一种igf家族蛋白联合检测芯片的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种IGF家族蛋白联合检测芯片，该芯片包括：玻片，采用活性氨基丙基硅烷包被；多个微阵列，经芯片点阵将所述微阵列固定在所述玻片上；垫片，将各个微阵列分隔成不同的杂交区；其中，每个所述微阵列上含有对应于一种胰岛素样生长因子家族蛋白的一种特异性抗体；还包括以下反应试剂：用生物素标记的检测抗体混合液；封闭液，采用5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；标准蛋白混合物；采用荧光染料HyLight555（激发波长550nm，发射波长566nm）标记的链霉亲和素。本发明所述的IGF家族蛋白联合检测芯片能完成目前ELISA、免疫印迹法等传统方法不能完成的多项检测指标、高通量、高灵敏度的检测，非常适合于针对IGF-1信号通路众多目标蛋白多联同时检测。
【专利说明】—种IGF家族蛋白联合检测芯片
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学【技术领域】，涉及一种蛋白联合检测芯片，特别是涉及一种针对胰岛素样生长因子(IGF)家族蛋白的联合检测芯片。
【背景技术】
[0002]胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)信号系统通过与细胞膜上的特异受体之间的相互作用在调节细胞增殖、分化和凋亡等方面扮演着重要的生理作用。IGF信号系统由以下三部分组成:配体(IGF-1、IGF-2和胰岛素)、受体(IGF-1R、IGF-2R、胰岛素受体(IR)、IGF-1R/IR杂合受体(HR)等)和六种IGF高亲和性结合蛋白(IGFBP1-6)。其中，IGF-1和IGF-2在胎儿发育和出生后生活中通过内分泌、旁分泌和自分泌机制发挥重要的作用。IGF的有丝分裂，分化和抗凋亡特性是主要由IGF-1R来介导的。当IGF-1或IGF-2与受体结合时，IGF-1R可通过MEK/ERK或PI3K/Akt信号通路来分别促进细胞增殖或抑制细胞凋亡，因而增加致癌风险。在IGF家族的蛋白中，IGF-1、IGF-1R和IGF-2与癌症形成是正相关的。与之相反，IGFBP是重要的代谢调控因子，这类蛋白通过与IGF的高亲和性结合来抑制IGF的活性。在细胞表面，各种IGFBP竞争性地结合IGF，以阻遏IGF与IGF-1R的相互作用。
[0003]IGF信号系统在理论界和医药公司都深受关注。研究表明，IGF系统的失调被认为是包括糖尿病、心血管基部以及多种癌症的关键因素。临床研究的结果使人们关注IGF系统的复杂性。其中一个主要的复杂方面是:这些配体不是仅仅能高亲和性地结合到它们系统自身的受体上，例如，IGF-1结合到IGF-1R上，它们还可以与其他受体以不同的亲和性进行交互，例如，IGF-2可结合IGF-1R、IR和HR。血清IGF水平是由更高亲和性的IGFBP来调控的。不同的IGFBP与IGF-1和IGF-2之间的相对亲和性是不同的。除了与IGF结合的功能之外，IGFBP还进行其他不依赖于IGF的功能。
[0004]许多以IGF-1R作为靶向目标的药物在动物实验和临床前期都有明显的效果，但真正能用于临床药用的却凤毛麟角。其中的主要问题在于目前的实验方法只是针对单一的IGF蛋白进行试验，而缺乏对多种IGF家族蛋白所组成的系统的综合研究。为了获得药物功效的完整了解，未来以IGF为标靶的抗癌药物开发非常需要充分考虑IGF系统的所有复杂性.为了深入了解IGF信号通路的复杂性，需要同时检测多个IGF家族蛋白。但是，目前的实验方法和检测芯片并不能满足这一需求。
[0005]对于细胞因子和信号蛋白的定性检测和定量检测，目前常用的是的检测方法主要包括:酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫印迹法(western blot)、流式细胞仪(Flow-Cytometry)等。酶联免疫吸附法具有灵敏度高、特异性较好、操作简便等优点，但一次试验只能检测单一指标，通量低、成本高。放射免疫分析虽然灵敏度高，是容易造成放射性污染。免疫印迹法能测定分子的大小，且无非特异的反应，但操作繁琐，灵敏度低，且只能检测单一指标。流式细胞仪能在细胞水平上检测细胞因子的水平，但却存在低灵敏、低通量、高成本等缺点。上述方法能用于检测单个蛋白表达水平，但却不适合IGF多蛋白系统 的检测。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等不足，本发明的目的在于提供一种新型的针对胰岛素样生长因子(IGF)信号通路的蛋白联合检测芯片，以实现IGF家族蛋白的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本检测，具有廉价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。
[0007]本发明所述的IGF家族蛋白联合检测芯片包括:玻片，采用活性氨基丙基硅烷包被；多个微阵列，经芯片点阵将所述微阵列固定在所述玻片上；垫片，将各个微阵列分隔成不同的杂交区；其中，每个所述微阵列上含有对应于一种胰岛素样生长因子家族蛋白的一种特异性抗体；还包括以下反应试剂:用生物素标记的抗体混合液；封闭液，采用5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；标准蛋白混合物，包含若干种所述的胰岛素样生长因子家族蛋白混合物，以及不同浓度的用封闭液稀释的标准蛋白混合物；采用荧光染料HyLight 555(激发波长550nm,发射波长566nm)标记的链霉未和素。
[0008]根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，每个所述玻片上固定有16个独立的微阵列，每个微阵列具有4个重复点样的抗体点。
[0009]根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述玻片上还包括固定有生物素标记的抗牛I gG抗体的阳性对照点。
[0010]根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述特异性抗体包括针对如下胰岛素样生长因子家族蛋白的抗体:IGF-ι、IGF-1R、IGF-2、IGF-2R、IGFBP-U IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-6 和胰岛素。
[0011]根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述玻片在芯片点阵时，控制温度为70-75F，湿度为40-45%，并在点阵后室温静置过夜。
[0012]根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述玻片在芯片点阵后，通过以下步骤进行处理:用含5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭，各个独立的微阵列分别用细胞培养上清、人类血清、组织裂解液或者不同浓度的封闭液稀释的标准蛋白混合物孵育过夜，洗涤去除不结合的蛋白，然后在各个微阵列中加入生物素标记的相应的抗体，孵育，洗涤，用荧光染料HyLight 555 (激发波长550nm，发射波长566nm)标记的链霉亲和素室温孵育，洗涤，干燥。
[0013]根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述玻片在完成实验操作后通过以下步骤来计算待测样品中各种胰岛素样生长因子家族蛋白的浓度:用激光扫描仪在Cy3波长下扫描成像；用数据提取软件找到各个微阵列点并输出数码读数；用配套芯片处理软件自动计算出待测样品中各个蛋白的浓度.根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述玻片的实验操作通过以下步骤进行:用含5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭，各个独立的微阵列分别用待测样品或者不同浓度的用封闭液稀释的标准蛋白混合物孵育过夜，洗涤去除不结合的蛋白，然后在各个微阵列中加入生物素标记的抗体混合液，孵育，洗涤，再用荧光染料HyLight 555 (激发波长550nm,发射波长566nm)标记的链霉未和素室温孵育，洗漆，干燥。
[0014]根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，所述完成实验操作的玻片通过以下步骤来计算待测样品中各种胰岛素样生长因子家族蛋白的浓度:用激光扫描仪扫描成像；用数据提取软件找到各个微阵列点并输出数码读数；用配套芯片处理软件自动计算出待测样品中各个蛋白的浓度。
[0015]所述的待测样品选自:细胞培养上清、人类血清、组织裂解液。
[0016]本发明所述的IGF家族蛋白联合检测芯片是经过优化设计的抗体芯片，能完成目前ELISA、免疫印迹法等传统方法不能完成的多项检测指标、高通量、高灵敏度的检测，非常适合于针对IGF-1信号通路众多目标蛋白多联同时检测，有利于更好的说明IGF-1家族成员在生物体内的相互关系和作用，为生物制药公司更有效的药物筛选提供重要的实验工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1显示IGF家族蛋白联合检测芯片的特异性。荧光染料标记的链霉亲和素孵育后，用Genepix 4000B扫描得到每个芯片的特异信号。信号强度通过Genepix软件解析，并显示芯片的特异性。
[0018]图2显示IGF家族蛋白联合检测芯片的标准曲线。每个标准抗原在各自的浓度范围内以3倍梯度稀释，并与芯片孵育。使用IGF-1R专用的分析软件分析数据和建立标准曲线(R2 > 0.97)。
[0019]图3A和图3B分别显示IGF-2R (A)和IGFBP-2 (B)在癌症组织(T)及其癌旁组织(P)样本中差异表达。制备来自25例病人的肝癌组织及其癌旁组织裂解液，并与IGF信号抗体芯片孵育，然后对数据进行统计分析。IGF-2R和IGFBP-2在肝癌组织及其癌旁组织中的平均浓度具有显著差异性，P〈0.05 (T检验)。
[0020]图3C显示了 IGF家族蛋白联合检测芯片的代表性数据。
[0021]图4 A显示使用Western blot实验进一步检测IGFBP-2的表达的代表性数据；图4B显示使用回归分析检测抗体芯片和Western blot的相关性；图4C显示抗体芯片和ELISA的相关性。
[0022]图5显示IGF-2R (A)和IGFBP-2 (B)在癌症组织(T)及其癌旁组织(P)样本中的正态分布。来自25例病人的肝癌组织及其癌旁组织裂解液被制备，并与IGF信号抗体芯片孵育，然后统计分析数据。
【具体实施方式】
[0023]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0024]实施例一:本发明所述的IGF家族蛋白联合检测芯片的构建
为了开发本发明所述的IGF家族蛋白联合检测芯片，首先从供应商筛选现有抗体产品或通过自行开发合适的抗体对。然后将这些抗体对用于创建一个芯片以同时检测IGF家族的10种蛋白质。
[0025]材料
所有抗体购买于R&D Systems公司(美国明尼苏达州Minneapolis)或者由RayBiotech公司(美国佐治亚州Norcross)制备。IGF家族蛋白来自R&D公司或由RayBiotech公司制
【权利要求】
1.一种IGF家族蛋白联合检测芯片，所述检测芯片包括: 玻片，采用活性氨基丙基硅烷包被； 多个微阵列，经芯片点阵将所述微阵列固定在所述玻片上； 垫片，将各个微阵列分隔成不同的杂交区； 其中，每个所述微阵列上含有对应于一种胰岛素样生长因子家族蛋白的一种特异性抗体； 还包括以下反应试剂: 检测抗体混合液，所述抗体采用生物素标记； 封闭液，采用5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液； 标准蛋白混合物，包含若干种所述的胰岛素样生长因子家族蛋白混合物以及用封闭液稀释的不同浓度的标准蛋白混合物； 采用荧光染料HyLight 555 (激发波长550nm，发射波长566nm)标记的链霉亲和素。
2.根据权利要求1所述的蛋白联合检测芯片，其特征在于:每个所述玻片上固定有至少16个独立的微阵列，每个微阵列具有4个重复点样的抗体点。
3.根据权利要求1所述的蛋白联合检测芯片，其特征在于:所述玻片上还包括固定有生物素标记的抗牛IgG抗体的阳性对照点。
4.根据权利要求1所述的蛋白联合检测芯片，其特征在于:所述特异性抗体包括针对如下胰岛素样生长因子家族蛋白的抗体:IGF-1、IGF-1R、IGF-2、IGF-2R、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-6 和胰岛素。
5.根据权利要求1所述的蛋白联合检测芯片，其特征在于:所述玻片在芯片点阵时，控制温度为70-75F，湿度为40-45%，并在点阵后室温静置过夜。
6.根据权利要求1所述的蛋白联合检测芯片，其特征在于，所述玻片的实验操作通过以下步骤进行:用含5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭，各个独立的微阵列分别用待测样品或者不同浓度的用封闭液稀释的标准蛋白混合物孵育过夜，洗涤去除不结合的蛋白，然后在各个微阵列中加入生物素标记的抗体混合液，孵育，洗涤，再用荧光染料HyLight555 (激发波长550nm,发射波长566nm)标记的链霉未和素室温孵育，洗漆，干燥。
7.根据权利要求6所述的蛋白联合检测芯片，其特征在于，所述完成实验操作的玻片通过以下步骤来计算待测样品中各种胰岛素样生长因子家族蛋白的浓度:用激光扫描仪扫描成像；用数据提取软件找到各个微阵列点并输出数码读数；用配套芯片处理软件自动计算出待测样品中各个蛋白的浓度。
8.根据权利要求6或7所述的蛋白联合检测芯片，其特征在于，所述的待测样品选自:细胞培养上清、人类血清、组织裂解液。
【文档编号】G01N33/68GK103698529SQ201210366988
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2012年9月28日
【发明者】黄若磐, 毛应清, 陈蕴如 申请人:广州瑞博奥生物科技有限公司