专利名称：卷烟香精香料安全性筛选的生物热化学方法
技术领域：
本发明涉及卷烟香精香料安全领域，具体地指一种卷烟香精香料安全性筛选的生物热化学方法。
背景技术：
近几十年食品安全问题的受关注度可谓达到空前的状态，烟草虽然绝大多数情况不被直接食用，但很多国家依然把烟草划为食品类或准食品类，作为“特殊食品”其安全性越来越受关注，检测程序和方法也越来越严格。C0RESTA (国际烟草科学研究合作中心)成立了相关的烟草烟气体外毒性测试工作组，其主要任务是根据国际认可的体外毒性测试准则并加以修改，以适应烟草烟气的性质和独特特性，同时确定标准测试方法。体外毒性测试并非危害的直接测定，但完全可以确保测试产品不会增加潜在的危害，毒理学数据可以在一定程度为卷烟产品安全性评价提供理论依据和信息。然而，对于新型的烟用添加剂的安全性和功能性评价，即使是常规的检测往往也需要耗费非常大的人力物力，测试成本高、时间周期长、效率低等问题暴露了出来。行业急需要一些新的高速准确的方法来协助，对添加剂进行初步筛选，缩小范围，降低成本，提高效率。
所有的化学、物理和生命过程都伴随着热效应。对这些热效应进行精确的测定，并作合理的分析，这就成热化学的精髓。随着科学和技术的不断发展，仪器设备的不断改进， 特别是现代微量热技术的发展，热化学越来越多地渗透到其它领域，从而形成了许多新兴的交叉学科。其中，最具特色的生物热化学逐渐被人们认识和重视起来。生物体内的化学反应的热效应一般都很小，而且是在等温状态下进行的。现代等温微量热技术就是在此基础上发展起来的方法。从生命科学的基本研究内容看，可涉及生物的生长发育、生理生化、 物质和能量代谢过程。
量热法(Calorimetry)是生物热化学的重要研究方法，它用于生物体系变化过程的热效应研究有许多独到之处。在量热测定过程中不需添加任何试剂，这样就不会引入对生物体系正常活动和代谢有影响的因素；而且还可以有目的地加入某一物质，以研究该物质对生物体活动的影响。此外，量热法可用于任何复杂的体系，如混沌的、高分散体系，对被研究体系的溶剂性质、光谱性质及电化学性质没有任何限制，只要有热效应即可应用，因此，可用于直接研究离体的组织和悬浮液。样品用量少，而且在量热实验后，对研究体系没有任何破坏，还可以进行后续生化分析。虽然量热法缺乏特异性，但研究对象本身具有特异性，所以用这种非特异的方法可以得到一些有意义的结果。量热法可以用于生命系统中的各种特异过程，如生物机体内各个水平上的生长代谢过程、酶促反应、生物大分子间以及生物大分子与小分子间的相互作用等。当然，量热法也有其不足之处，即不能追踪某一特定个别中间产物的消长过程和宏观体系中的个体情况，只能显示各种过程热效应的总和，但研究者可以结合其他手段，如各种电子显微技术、光谱和波谱等进行解析，取长补短。生物量热技术和理论日趋完善，现已基本形成了生物热化学和生物化学热力学等交叉学科。并且， 生物量热技术已渗透到生命科学的各个领域，在生物化学、临床医学、环境科学、农业生态、食品科学等方面获得广泛应用。
微量热法(Microcalorimetry)具有高度自动化、实时在线、微量化(mg待测样品就可完成实验)、灵敏度高(低至nW的热量)、重现性好，而且不会破坏样品的特点，运用于研究生物体系有诸多的优势。微量热法能直接测定微生物或细胞，甚至细胞器对各种外来物质的敏感度；可定量研究外源物与微生物、细胞或细胞器间的作 用，获得影响程度、药效、抑菌率和毒性等方面的信息；结合其他实验方法，还可以研究外源物对实验对象的影响机制。 这对外源物的安全性评估，指导药物或添加剂的合成、筛选及应用均具有较强的理论意义。 利用生物量热技术的这些特点和优势，能够较好的担当起对烟用添加香精香料进行初筛选的重任。在烟用香精香料进行一系列繁琐的生物安全性评价之前，利用微量热法，可以快速、准确的将绝大部分对微生物(具有代表性的模式细胞或微生物)正常代谢有着显著影响的香精香料筛选出来。这样可以大幅降低后期实验成本、人力和时间，起到事半功倍的效果O发明内容
本发明的目的是针对现在新型香精香料不断增多，但传统的体外毒理学检测方法存在成本高、周期长、效率较低的缺陷，提供了一种卷烟香精香料(主要是液态香精香料)安全性筛选的生物热化学方法。本发明利用量热技术将烟用香精香料按影响程度进行分类， 有显著毒性或破坏性的香精香料直接排除掉，避免人力物力上的浪费。本发明无需制成香烟，直接将香精香料进行测试。
为解决上述技术问题，本发明提供一种卷烟香精香料安全性筛选的生物热化学方法，包括以下步骤
I)选择模式研究对象，配置相应的培养基
⑴大肠杆菌LB培养基用于培养及测试,LB培养基配方为5g酵母粉，IOg蛋白胨, 5g的NaCl溶于IL 二次蒸馏水中，调节pH至7. 4，在120°C、1. 034X 105 Pa高压灭菌处理 20min，待用；
⑵金黄色葡萄球菌LB培养基用于培养及测试；
⑶白色假丝酵母菌LB培养基用于培养及测试；
⑷热带假丝酵母菌LB培养基用于培养及测试；
(5)酿酒酵母菌YPDA培养基用于培养及测试，YPDA培养基配方为20g蛋白胨、IOg 酵母抽提物、2g葡萄糖用适量二次蒸馏水溶解，再加入15ml的O. 2%腺嘌呤溶液，定容到 1L，120°C高压灭菌15min，室温贮存，待用；
(6)枯草芽孢杆菌LB培养基用于培养及测试；
(7)苏云金芽胞杆菌LB培养基用于培养及测试；
(8)植物乳杆菌乳酸菌培养基用于其培养和测试，培养基配方为将7. 5g酵母粉、 7. 5g蛋白胨、IOg葡萄糖、2g的ΚΗ2Ρ04、0· 5ml吐温80溶于900ml 二次蒸馏水，再加入IOOml 番茄汁，混匀后低温贮存，待用； ⑶嗜盐古生菌嗜盐古生菌培养基用于培养及测试， 嗜盐古生菌培养基配方为250g的NaCl，2g的K2SO4, 30g的MgCl2 · 6H20，2g酵母提取物， 2. 5g水解乳蛋白，溶于IL 二次蒸馏水中，待用；
(10)四膜虫四膜虫培养基用于培养及测试，四膜虫培养基配方为15g蛋白胨、5g酵母粉、Ig葡萄糖溶解于IL蒸馏水中，pH值调至7. (Γ7. 5，高压灭菌后待用；
(11)成纤维细胞成纤维细胞培养基用于培养及测试，成纤维细胞培养基配方为 MEM (Minimal Essential Medium)基础培养基,加入10%胎牛血清和O O. 4g .1/1的非必需氨基酸；MEM培养基基本成分为O. 20g · I/1无水CaCl2、0. 0977g · Γ1无水MgS04、0. 40g · Γ1 KCl、6· 8g · L-1 NaCl、O. 122g · I^1NaH2PO4、(Γθ· OOlg · L-1 酒石酸胆碱、0 0· OOlg · Γ1 叶酸、 0 0· 002g · I/1 肌醇、(TO. OOlg · I/1 烟酰胺、(Γθ. OOlg · L^1D-泛酸钙、(Γθ. OOlg · L—1 盐酸吡哆辛、(H). OOOlg · L-1 核黄素、(H). OOlg · L-1 盐酸硫胺、Ig · L-1 葡萄糖、(Γθ. OOlg · L-1 丁二酸、0 0· OOlg Γ1 丁二酸钠、0. Ollg Γ1 芬红、(Π). OOOlg Γ1 卡那霉素以及 0. Γ0. 3 g .171 必需氨基酸。
(12)上皮细胞上皮细胞培养基用于培养及测试，上皮细胞培养基配方为MEM基础培养基，加入10%胎牛血清和(Γι%的非必需氨基酸；
2)香精香料预处理香精香料做成浓缩液浸膏进行使用，浸膏的相对密度为1. 10 1· 35 ；
3)将步骤I)中的l(T500ul的模式研究对象菌液加入I飞ml对应的液体培养基中；
4)将步骤2)的浓溶液或悬浊液分成0、5、10、20、50、100、200μ I浓度梯度，并将不同浓度梯度的浓溶液或悬浊液加入步骤3)中液体培养基中，振荡均匀后；或者将步骤2) 的浓溶液或悬浊液选定1(Γ 00μ I范围内的一个合适量加入步骤3)液体培养基中，振荡均匀后；5)将步骤4)中振荡均匀的液体培养基置入量热仪中，设定温度为2(T40°C恒温；
6)待温度达到设定值且稳定后，将培养液导入微量热仪的检测室，开启运行程序， 开始采集数据；
7)根据采集数据进行作图、拟合和计算，获得相关的生长产热曲线及热动力学参数，其参数包括代谢过程的生长速率常数(k)、最大产热功率(Pm)、总放热量(Q)、传代时间 (te)、最大热功率对应的时间(tm)、出峰时间(tp)和抑制率(I)、半抑制浓度(IC5tl);
8)比较相关的生长产热曲线及热动力学参数相关的生长产热曲线及热动力学参数，分析加入不同烟气收集液对模式研究对象正常代谢的影响及其差异，获得有关香精香料对卷烟烟气安全性的初步评估；分析有无加入香精香料后，模式研究对象代谢指标的差异，获得香精香料是否具有显著的毒性或者破坏性。
作为优选方案，所述成纤维细胞的培养基配方中的非必需氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸和胱氨酸中任意几种；MEM培养基中必需氨基酸为赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸中的任意几种。
本发明的优点在于方法操作简单、成本极低、实验周期短、效率高、结果准确可靠，还能实时观测整个代谢过程，开创了一种初步鉴定卷烟香精香料快速筛选的新方法，为后面的进一步分析评价提供了重要的参考依据，并且在提高了效率的同时大大降低了成本。
图1为酵母菌在30°C条件下正常生长代谢热谱图2为中草药I提取物影响下，酵母菌在30°C条件下生长代谢热谱图；
图3为中草药2提取物影响下，酵母菌在30°C条件下生长代谢热谱图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例I
对国内三种中草药提取物进行评价。三种中草药为甘草、川芎和藜芦，利用乙醇为提取液进行同时蒸馏萃取，萃取液进行浓缩至浸膏状。分别给它们的提取物浸膏编号依次为1#、2#、3#。这三种提取物浸膏的相对水密度为1. l(Tl. 35，甘草是已经被食品和烟草行业公认为可以作为添加剂加入产品，另外两种还没被完全认可，认为它在某些方面可能存在潜在毒性。以酿酒酵母菌为模式研究生物，YPDA培养基为接种和测试培养基，利用TAM air微量热检测仪对三种中草药提取物分别作用下酿酒酵母菌代谢过程进行实时监控。 YPDA (yeast peptone dextrose adenine)培养基配方为 20g 蛋白腺、10 g 酵母抽提物、2g 葡萄糖，适量二次蒸馏水溶解。再加入15 ml O. 2%腺嘌呤溶液，定容到1L，120°C高压灭菌 15min，室温贮存。酿酒酵母菌的正常代谢热谱图如图1所示。通过加入不同量的提取物形成浓度梯度，考察添加物浓度与酿酒酵母菌代谢变化的关系，从而获得微生物代谢过程各相关物理化学指标。将酿酒酵母菌转入5ml液体培养基中，再向培养液中加入浓缩后的中草药提取物，加入体积分别为0，2，10，50，100，150和200 μ 1，形成浓度梯度。然后，将培养液转入容积为20ml已灭过菌玻璃安瓿瓶，封盖后放入TAM air等温热活性检测仪，恒温 30°C进行实时监测。采集得到的热功率曲线(图2、图3)以及数据进过分析处理后，可以获得相关物理化学参数(表I)。k是生长速率；Pm为最大放热功率；Q是整个代谢过程的总放热量。其中，着重考察了生长速率常数、最大产热功率和总放热量的变化情况。比较三种中草药提取物所对应的参数，我们发现1#提取物浸膏的加入使上述三项参数均有所增大;2# 提取物浸膏的加入使三项参数先略微增大后减小；3#提取物浸膏使三项参数显著降低。综上，结果显示甘草提取物对微生物的正常代谢是有帮助的，可以加快它们的代谢速率，同时促进其繁殖；川芎提取物在浓度较低时，也表现出促进作用或者刺激作用，但是，随着浓度大到一定程度，就表现出一定的损害作用；藜芦提取物对微生物代谢有着明显的抑制作用。 通过微量热法得出的结论与之后所做的多项印证实验结果完全一致。
表I三种中草药提取物影响下，酿酒酵母菌代谢过程的相关物理化学参数
权利要求
1.一种卷烟香精香料安全性筛选的生物热化学方法，包括以下步骤 1)选择模式研究对象，配置相应的培养基 ⑴大肠杆菌LB培养基用于培养及测试，LB培养基配方为5g酵母粉，IOg蛋白胨，5g的NaCl溶于IL 二次蒸馏水中，调节pH至7. 4，在120°C、1. 034X105 Pa高压灭菌处理20min，待用； ⑵金黄色葡萄球菌LB培养基用于培养及测试； ⑶白色假丝酵母菌LB培养基用于培养及测试； ⑷热带假丝酵母菌LB培养基用于培养及测试； (5)酿酒酵母菌YPDA培养基用于培养及测试，YPDA培养基配方为20g蛋白胨、IOg酵母抽提物、2g葡萄糖用适量二次蒸馏水溶解，再加入15ml的O. 2%腺嘌呤溶液，定容到1L，120°C高压灭菌15min，室温贮存，待用； (6)枯草芽孢杆菌LB培养基用于培养及测试； ⑴苏云金芽胞杆菌LB培养基用于培养及测试； ⑶植物乳杆菌乳酸菌培养基用于其培养和测试，培养基配方为将7. 5g酵母粉、7. 5g蛋白胨、IOg葡萄糖、2g的KH2P04、0. 5ml吐温80溶于900ml 二次蒸馏水，再加入IOOml番茄汁，混匀后低温贮存，待用； ⑶嗜盐古生菌嗜盐古生菌培养基用于培养及测试，嗜盐古生菌培养基配方为250g的NaCl，2g的K2SO4, 30g的MgCl2 · 6H20, 2g酵母提取物，2. 5g水解乳蛋白，溶于IL 二次蒸懼水中，待用； (10)四膜虫四膜虫培养基用于培养及测试，四膜虫培养基配方为15g蛋白胨、5g酵母粉、Ig葡萄糖溶解于IL蒸馏水中，pH值调至7. (Γ7. 5，高压灭菌后待用； (11)成纤维细胞成纤维细胞培养基用于培养及测试，成纤维细胞培养基配方为MEM基础培养基，加入10%胎牛血清和(TO. 4g · Γ1的非必需氨基酸；ΜΕΜ培养基基本成分为 O. 20g · L-1 无水 CaCl2、0. 0977g · L-1 无水 MgS04、0. 40g · L-1 KC1、6. 8g · L-1 NaCl,0.122g · L-1NaH2PO4'0 0· OOlg · Γ1 酒石酸胆碱、(Γθ. OOlg · Γ1 叶酸、(Γθ. 002g · Γ1 肌醇、0 0· OOlg · Γ1 烟酰胺、(TO. OOlg · L-1D-泛酸钙、(TO. OOlg · Γ1 盐酸吡哆辛、(TO. OOOlg · Γ1核黄素、(To. OOlg · L-1 盐酸硫胺、Ig · L-1 葡萄糖、(H). OOlg · L-1 丁二酸、(H). OOlg · L-1 丁二酸钠、0. Ollg · L-1芬红、(To. OOOlg · L-1卡那霉素以及O. I O. 3 g · L—1必需氨基酸。
(12)上皮细胞上皮细胞培养基用于培养及测试，上皮细胞培养基配方为MEM基础培养基，加入10%胎牛血清和(Tl%的非必需氨基酸； 2)香精香料预处理香精香料做成浓缩液浸膏进行使用，浸膏的相对密度为1.10 1· 35 ； 3)将步骤I)中的l(T500ul的模式研究对象菌液加入I飞ml对应的液体培养基中； 4)将步骤2)的浓溶液或悬浊液分成0、5、10、20、50、100、200μI浓度梯度，并将不同浓度梯度的浓溶液或悬浊液加入步骤3)中液体培养基中，振荡均匀后；或者将步骤2)的浓溶液或悬浊液选定1(Γ 00μ I范围内的一个合适量加入步骤3)液体培养基中，振荡均匀后； 5)将步骤4)中振荡均匀的液体培养基置入量热仪中，设定温度为2(T40°C恒温； 6)待温度达到设定值且稳定后，将培养液导入微量热仪的检测室，开启运行程序，开始采集数据；7)根据采集数据进行作图、拟合和计算，获得相关的生长产热曲线及热动力学参数，其参数包括代谢过程的生长速率常数k、最大产热功率Pm、总放热量Q、传代时间te、最大热功率对应的时间tm、出峰时间tp和抑制率I、半抑制浓度IC5tl ； 8)比较相关的生长产热曲线及热动力学参数相关的生长产热曲线及热动力学参数，分析加入不同烟气收集液对模式研究对象正常代谢的影响及其差异，获得有关香精香料对卷烟烟气安全性的初步评估；分析有无加入香精香料后，模式研究对象代谢指标的差异，获得香精香料是否具有显著的毒性或者破坏性。
2.根据权利要求I所述的卷烟香精香料安全性筛选的生物热化学方法，其特征在于所述成纤维细胞的培养基配方中的非必需氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸和胱氨酸中任意几种；MEM培养基中必需氨基酸为赖氨酸、色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸中的任意几种。
全文摘要
本发明公开一种卷烟香精香料安全性筛选的生物热化学方法，该方法通过采用的生物热化学检测方法是体外宏观微量热实验，通过等温热活性检测仪对已经处理过的微观研究对象整个代谢过程进行实时监测。微观研究对象接种于液态培养基中，导入仪器的热量检测区域。利用采集模块收集过程中的热量变化，计算出相关物理化学参数。本发明操作简单、成本极低、实验周期短、效率高、结果准确可靠，还能实时观测整个代谢过程，开创了一种初步鉴定卷烟香精香料快速筛选的新方法，为后面的进一步分析评价提供了重要的参考依据，并且在提高了效率的同时大大降低了成本。
文档编号G01N25/48GK102980912SQ20121045099
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者李冉, 魏敏, 宋旭艳, 罗诚浩, 陈义坤 申请人:湖北中烟工业有限责任公司