专利名称：人工麝香的多肽电泳图谱检测方法
技术领域：
本发明涉及一种中药检测方法，具体涉及一种人工麝香的多肽电泳图谱检测方
法。
背景技术：
麝香具有一定的抗炎镇痛药理活性，现有研究显示麝香的抗炎活性与麝香中特有的糖肽有关，不同文献报道其抗炎糖肽分子量各不相同，不同来源的麝香其多肽成分有显著性差异。常规的电泳分析体系Tris-甘氨酸-SDS-PAGE电泳分析分辨大分子物质的相对分子质量范围在l(T200kDa，对于相对分子质量小于IOkDa的多肽分辨率低。利用含有SDS的凝胶中加入高浓度脲时可利用SDS-PAGE对小分子多肽进行分析的分离效果不甚理想，且重现性较差，且小分子多肽在固定染色的过程中容易丢失。故采用Tricine-SDS-PAGE电泳，建立麝香多肽电泳方法。
发明内容
本发明提供了一种人工麝香的多肽电泳图谱检测方法。本发明目的是通过如下技术方案实现的I、人工麝香凝胶电泳分析样品的制备称取人工麝香样品O. 003^0. 008重量份，加入I体积份乙醚，超声提取15 25min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加O. 03、. 08体积份电泳上样缓冲液(IX)，超声提取15 25min,在4500rpm, 10°C条件下离心15 25min,取上清,加O. 02%溴酹蓝,沸水浴3 8min,即得电泳样品；2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备(a)去离子水溶解100 150重量份Tris，用HCl调PH值至7 9，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX);(b)去离子水溶解50 70重量份Tris，8(Tl00重量份1^(^1^，3 8重量份505，定容至500体积份，制得负极缓冲液(10 X );(C)去离子水溶解150 200重量份Tris，l 2重量份SDS，用HCl调PH值至疒9，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3X )；(d) 40^60%丙烯酰胺，Γ2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；(e)4(T60%丙烯酰胺，Γδ%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f)0. 2 I体积份lmol/L, PH为6. 8的Tris-HCl, 2^4体积份甘油，I 3体积份10%SDS，0. 6^1体积份β -巯基乙醇，O. 5^1. 5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液^X);
(g) O. 2 I体积份lmol/L, PH为6. 8的Tris-HCl，2 4体积份甘油，I 3体积份10%SDS，0.6 1体积份β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备分离胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，O. 2^0. 6重量份甘油，O. 5^1. 5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2 4体积份，临用时加入O. 005、. 02体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0005、. 002体积份TEMED ；夹层胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ)0. 5^1. 5体积份，O. 5^0. 8体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2 4体积份，临用时加入O. 005、. 02体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0005、. 002体积份TEMED ；浓缩胶2体积份0. 4^0. 6体积份凝胶缓冲液(3X)，0. Γθ. 2体积份3C储液，去离子水稀释至广3体积份，临用时加入O. 005、. 02体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0005 O. 002 体积份 TEMED ；(3 )电泳条件120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处；(4)染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制固定液量取甲醇30-60体积份，冰醋酸5-20体积份，加双蒸水稀释至100体积份；染色液称取O. 5^1. O重量份AgNO3溶于3飞体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入O. 36% NaOH 15 30体积份，再加入氨水I 2体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；显色液0. 3^0. 8体积份I %柠檬酸，O. 03、. 08体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；终止液量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份；3、具体染色步骤(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定O. 5^1. 5h，每l(T30min换一次液；(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次5 15min ；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色1(Γ20分钟；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2 4min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；(g)在蒸馏水中漂洗凝胶O. 5^1. 5h ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；在人工麝香电泳图谱中，出现分子量约为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、lL 3kDa的染色条带。本发明人工麝香的多肽电泳图谱检测方法优选如下步骤I、人工麝香凝胶电泳分析样品的制备称取人工麝香样品O. 003重量份，加入I体积份乙醚，超声提取20min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加O. 05体积份电泳上样缓冲液(IX),超声提取20min,在4500rpm,10°C条件下离心20min,取上清,加O. 02%溴酹蓝,沸水浴5min,即得电泳样品；
2、Tricine-SDS-PA重量份E凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备(a)去离子水溶解100重量份Tris，用HCl调PH值至7. 5，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX);(b)去离子水溶解55重量份Tris，90重量份Tricine，8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(10 X );(c)去离子水溶解160重量份Tris，I. 5重量份SDS，用HCl调PH值至7. 8，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3X )；(d) 56%丙烯酰胺，I. 2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储 液；(e) 52%丙烯酰胺，2. 0%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f) O. 8 体积份 lmol/L, PH 为 6. 8 的 Tris-HCl, 2 体积份甘油，3 体积份 10%SDS,O. 7体积份β -巯基乙醇，I. 5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6Χ)；(g) O. 4 体积份 lmol/L, PH 为 6. 8 的 Tris-HCl，2 体积份甘油，2. 5 体积份 10%SDS,I体积份β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备分离胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，O. 6重量份甘油，I. 5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至4体积份，临用时加入O. 005体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 001体积份TEMED ；夹层胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，O. 5体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2. 5体积份，临用时加入O. 005体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 001体积份的TEMED ；浓缩胶2体积份取上述制得的O. 6体积份凝胶缓冲液(3Χ)，0. 2体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2体积份，临用时加入O. 005体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 001 体积份 TEMED ；(3 )电泳条件120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处；(4)染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制固定液量取甲醇50体积份，冰醋酸5体积份，加双蒸水稀释至100体积份；染色液称取O. 5重量份AgNO3溶于3体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入O. 36%NaOH 18体积份，再加入氨水I. 5体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌,全部加入后,加双蒸水至100体积份；显色液0. 8体积份I %柠檬酸，O. 06体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；终止液量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份；3、具体染色步骤(a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定Ih,每IOmin换一次液；(b)弃去固定液,凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次IOmin ；
(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色20min ；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗3min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；(g)在蒸馏水中漂洗凝胶Ih ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；在人工麝香电泳图谱中，出现分子量约为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、lL 3kDa的染色条带。
本发明人工麝香的多肽电泳图谱检测方法还可以优选如下步骤 I、人工麝香凝胶电泳分析样品的制备称取人工麝香样品O. 008重量份，加入I体积份乙醚，超声提取18min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加O. 05体积份电泳上样缓冲液(IX),超声提取22min,在4500rpm,1(TC条件下离心22min,取上清,加O. 02%溴酹蓝,沸水浴4min,即得电泳样品；2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备(a)去离子水溶解150重量份Tris，用HCl调PH值至9，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX);(b)去离子水溶解70重量份Tris，95重量份Tricine，3重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(10 X );(c)去离子水溶解180重量份Tris，I重量份SDS，用HCl调PH值至8. 5，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3X )；(d) 45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；(e) 55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f) O. 4 体积份 lmol/L，PH为 6. 8 的 Tris-HCl，3. 5 体积份甘油，I. 5 体积份 10%SDS，O. 8体积份β -巯基乙醇，O. 7体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6Χ)； (g) O. 8 体积份 lmol/L，PH为 6. 8 的 Tris-HCl，2. 5 体积份甘油，I. 8 体积份 10%SDS，O. 8体积份β-巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备分离胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，O. 3重量份甘油，I. 2体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3. 5体积份，临用时加入O. 009体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0015体积份TEMED ；夹层胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I. 2体积份，O. 55体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3. 5体积份，临用时加入O. 008体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 001体积份TEMED ；浓缩胶2体积份0. 45体积份凝胶缓冲液(3 X)，O. 18体积份3C储液，去离子水稀释至I. 5体积份，临用时加入O. 008体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0008体积份TEMED ；(3)电泳条件120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处；(4)染色方法
采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制固定液量取甲醇30体积份，冰醋酸20体积份，加双蒸水稀释至100体积份；染色液称取O. 6重量份AgNO3溶于3. 5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入O. 36%Na0H 25体积份，再加入氨水I. 8体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌,全部加入后,加双蒸水至100体积份； 显色液0. 7体积份I %柠檬酸，O. 04体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；终止液量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份；3、具体染色步骤(a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定I. 2h,每15min换一次液； (b)弃去固定液,凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次15min ；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色15min ；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；(g)在蒸馏水中漂洗凝胶O. 5h ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；在人工麝香电泳图谱中，出现分子量约为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、ll. 3kDa的染色条带。本发明所述重量份与体积份的关系为g/ml的关系。本发明方法采用电泳上样缓冲液直接提取分析，每个样品的用量只需要几毫克左右，该方法为人工麝香的鉴别建立了一种简便可行的辅助手段。
附图I :人工麝香多肽电泳图谱:A:Marker+胰岛素；B、C:人工麝香(北京联馨药业)，批号依次为I和2下面实验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例一人工麝香多肽电泳指纹图谱分析取人工麝香，为北京联馨药业有限公司2个批次产品。按照实施例一的方法，检测人工麝香的多肽电泳图谱，结果显示，在研究的2个批次的人工麝香电泳图谱中，均出现分子量约为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、ll. 3kDa的染色条带。结果见附图I (其中A为Marker+胰岛素；B和C为北京联馨药业生产的人工麝香。)结论电泳图谱中组要出现分子量约为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、ll. 3kDa的染色条带为人工麝香样品。下述实施例均能实现上述实验例的效果。实施例I :I、人工麝香凝胶电泳分析样品的制备称取人工磨香样品O. 003g,加入Iml乙醚,超声提取20min,离心去上清,挥干乙醚，不溶物加O. 05ml电泳上样缓冲液(IX)，超声提取20min，在4500rpm，10°C条件下离心20min,取上清，加O. 02%溴酚蓝，沸水浴5min，即得电泳样品；
2、Tricine-SDS-PAgE凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备(a)去离子水溶解IOOg Tris，用HCl调PH值至7. 5，定容至500ml，制得正极缓冲液(IOX)；(b)去离子水溶解55g Tris, 90g Tricine, 8g SDS,定容至500ml,制得负极缓冲液(IOX)；(c)去离子水溶解160g Tris, I. 5g SDS,用HCl调PH值至7. 8，定容至500ml，制得凝胶缓冲液(3X);(d) 56%丙烯酰胺，I. 2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储 液；(e) 52%丙烯酰胺，2. 0%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f)0. 8ml lmol/L，PH 为 6· 8 的 Tris-HCl，2ml 甘油，3ml 10%SDS，O. 7ml β -巯基乙醇，1.5ml 1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10ml，制得上样缓冲液^X)；(g) 0.4ml lmol/L，PH 为 6. 8 的 Tris-HCl，2ml 甘油，2. 5ml 10%SDS，Iml β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60ml，制得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备分离胶3ml :取上述制得的凝胶缓冲液(3X) lml，0. 6g甘油，I. 5ml 6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至4ml，临用时加入O. 005ml的10%过硫酸铵溶液和O. OOlml TEMED ；夹层胶3ml :取上述制得的凝胶缓冲液(3X) lml，0. 5ml 3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2. 5ml,临用时加入O. 005ml的10%过硫酸铵溶液和O. OOlml的TEMED ；浓缩胶2ml :取上述制得的O. 6ml凝胶缓冲液(3X)，0. 2ml 3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2ml，临用时加入O. 005ml的10%过硫酸铵溶液和O. OOlml TEMED ；(3)电泳条件120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处；(4)染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制固定液量取甲醇50ml，冰醋酸5ml，加双蒸水稀释至IOOml ；染色液称取O. 5g AgNO3溶于3ml双蒸水中；取洁净烧杯，加入O. 36%Na0H 18ml,再加入氨水I. 5ml混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至IOOml ；显色液0. 8ml I %柠檬酸，O. 06ml甲醛，加双蒸水至IOOml ；终止液量取冰醋酸1ml，加双蒸水稀释至IOOml ；3、具体染色步骤(a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定Ih,每IOmin换一次液；(b)弃去固定液,凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次IOmin ；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色20分钟；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗3min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；
(g)在蒸馏水中漂洗凝胶Ih ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存。(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存。人工麝香电泳图谱中，均出现分子量约为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、lL 3kDa的染色条带。实施例2 I、人工麝香凝胶电泳分析样品的制备称取人工磨香样品O. 008g,加入Iml乙醚,超声提取20min,离心去上清,挥干乙醚，不溶物加O. 05ml电泳上样缓冲液(IX)，超声提取22min，在4500rpm，10°C条件下离心22min,取上清，加O. 02%溴酚蓝，沸水浴4min，即得电泳样品； 2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备(a)去离子水溶解150g Tris，用HCl调PH值至9，定容至500ml，制得正极缓冲液(IOX)；(b)去离子水溶解70g Tris, 95gTricine, 3g SDS,定容至500ml,制得负极缓冲液(IOX)；(c)去离子水溶解180g Tris,lg SDS，用HCl调PH值至8. 5，定容至500ml，制得凝胶缓冲液(3X);(d)45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；(e)55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f) O. 4ml lmol/L，PH 为 6. 8 的 Tris-HCl，3. 5ml 甘油，I. 5ml 10% SDS，O. 8ml β -巯基乙醇，0.7ml 1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10ml，制得上样缓冲液^X)；(g) 0.8ml lmol/L，PH 为 6. 8 的 Tris-HCl，2. 5ml 甘油，2. 5ml 10%SDS，O. 8ml β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60ml，制得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备分离胶3ml :取上述制得的凝胶缓冲液(3X) lml，0. 3g甘油，I. 2ml6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3. 5ml，临用时加入O. 009ml的10%过硫酸铵溶液和O. 0015mlTEMED ；夹层胶3ml :取上述制得的凝胶缓冲液(3X) I. 2ml, O. 55ml3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3. 5ml,临用时加入O. 008ml的10%过硫酸铵溶液和O. OOlml TEMED ；浓缩胶2ml 0. 45ml凝胶缓冲液(3X)，0· 18ml 3C储液，去离子水稀释至I. 5ml，临用时加入O. 008ml的10%过硫酸铵溶液和O. 0008ml TEMED ；(3)电泳条件120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处；(4)染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制固定液量取甲醇30ml，冰醋酸20ml，加双蒸水稀释至IOOml ；染色液称取O. 6gAgN03溶于3. 5ml双蒸水中；取洁净烧杯,加入O. 36%Na0H 25ml,再加入氨水I. 8ml混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至IOOml ；显色液0. 7ml I %柠檬酸，O. 04ml甲醛，加双蒸水至IOOml ；
终止液量取冰醋酸1ml，加双蒸水稀释至IOOml ；3、具体染色步骤(a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定I. 2h,每15min换一次液；(b)弃去固定液,凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次15min ；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色15min ；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色； (g)在蒸馏水中漂洗凝胶O. 5h ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存。人工麝香电泳图谱中，均出现分子量约为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、lL 3kDa的染色条带。
权利要求
1.一种人工麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤 A、人工麝香凝胶电泳分析样品的制备 称取人工麝香样品O. 003、. 008重量份，加入I体积份乙醚，超声提取15 25min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加O. 03、. 08体积份电泳上样缓冲液(IX)，超声提取15 25min，在4500rpm，10°C条件下离心15 25min，取上清，加O. 02%溴酚蓝，沸水浴3 8min，即得电泳样品； B、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法 (O电泳溶液准备 (a)去离子水溶解100 150重量份Tris，用HCl调PH值至7 9，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX); (b)去离子水溶解5(Γ70重量份Tris，8(Tl00重量份Tricine，3 8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(10 X ); (c)去离子水溶解15(Γ200重量份Tris，Γ2重量份SDS，用HCl调PH值至7 9，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3 X ); (d)40^60%丙烯酰胺，Γ2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液； (e)40^60%丙烯酰胺，Γ5%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液； (f)0.2 I体积份ImoI/L, PH为6. 8的Tris-HCl，2 4体积份甘油，I 3体积份10%SDS,O. 6^1体积份β -巯基乙醇，O. 5^1. 5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6Χ)； (g)0.2 I体积份ImoI/L, PH为6. 8的Tris-HCl，2 4体积份甘油，I 3体积份10%SDS,.0.6 1体积份β巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX); (2)凝胶制备: 分离胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，O. 2、. 6重量份甘油，O. 5^1. 5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2 4体积份，临用时加入O. 005、. 02体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0005、. 002体积份TEMED ； 夹层胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ)0. 5^1. 5体积份，O. 5^0. 8体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2 4体积份，临用时加入O. 005、. 02体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0005、. 002体积份TEMED ； 浓缩胶2体积份0. 4^0. 6体积份凝胶缓冲液(3X)，0. Γ0. 2体积份3C储液，去离子水稀释至广3体积份，临用时加入O. 005、. 02体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0005、. 002体积份TCMED ； (3)电泳条件120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处； (4)染色方法 采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制 固定液量取甲醇30-60体积份，冰醋酸5-20体积份，加双蒸水稀释至100体积份； 染色液称取O. 5^1. O重量份AgNO3溶于3飞体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入O. 36%Na0H 15 30体积份，再加入氨水2体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份； 显色液0. 3^0. 8体积份I %柠檬酸，O. 03、. 08体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；终止液量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份； C、具体染色步骤 (a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定O.5^1. 5h，每l(T30min换一次液； (b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次5 15min； (c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色1(Γ20分钟； (d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2 4min； (e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液； (f)将胶转移至终止液终止染色； (g)在蒸馏水中漂洗凝胶O.5^1. 5h ； (h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存； 在人工麝香电泳图谱中，出现分子量为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、ll. 3kDa的染色条带。
2.如权利要求I所述的一种人工麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤 A、称取人工麝香样品O.003重量份，加入I体积份乙醚,超声提取20min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加O. 05体积份电泳上样缓冲液(IX)，超声提取20min，在4500rpm，10°C条件下离心20min,取上清,加O. 02%溴酹蓝,沸水浴5min,即得电泳样品； B、Tricine-SDS-PA重量份E凝胶电泳分析方法 (O电泳溶液准备 (a)去离子水溶解100重量份Tris，用HCl调PH值至7.5，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX); (b)去离子水溶解55重量份Tris，90重量份Tricine，8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(IOX); (c)去离子水溶解160重量份Tris，1.5重量份SDS，用HCl调PH值至7.8，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3 X ); (d)56%丙烯酰胺，I. 2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液； (e)52%丙烯酰胺，2. 0%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液； (f)O. 8体积份lmol/L, PH为6. 8的Tris-HCl，2体积份甘油，3体积份10%SDS, O. 7体积份β -巯基乙醇，I. 5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液^X); (g)0.4体积份lmol/L, PH为6. 8的Tris-HCl，2体积份甘油，2. 5体积份10%SDS, I体积份巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX); (2)凝胶制备: 分离胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，O. 6重量份甘油，I. 5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至4体积份，临用时加入O. 005体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 001体积份TEMED ； 夹层胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，O. 5体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2. 5体积份，临用时加入O. 005体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 001体积份的TEMED ； 浓缩胶2体积份取上述制得的O. 6体积份凝胶缓冲液(3 X)，O. 2体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2体积份，临用时加入O. 005体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 001体积份TCMED ； (3)电泳条件120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处； (4)染色方法 采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制 固定液量取甲醇50体积份，冰醋酸5体积份，加双蒸水稀释至100体积份； 染色液称取O. 5重量份AgNO3溶于3体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入O. 36%NaOH 18体积份，再加入氨水1. 5体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌,全部加入后,加双蒸水至100体积份； 显色液0. 8体积份I %柠檬酸，O. 06体积份甲醛，加双蒸水至100体积份； 终止液量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份； C、具体染色步骤 (a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定Ih,每IOmin换一次液； (b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次IOmin； (c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色20min； (d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗3min； (e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液； (f)将胶转移至终止液终止染色； (g)在蒸馏水中漂洗凝胶Ih； (h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存； 在人工麝香电泳图谱中，出现分子量为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、ll. 3kDa的染色条带。
3.如权利要求I所述的一种人工麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤 A、人工麝香凝胶电泳分析样品的制备 称取人工麝香样品O. 008重量份，加入I体积份乙醚,超声提取18min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加O. 05体积份电泳上样缓冲液(IX)，超声提取22min，在4500rpm，10°C条件下离心22min,取上清,加O. 02%溴酹蓝,沸水浴4min,即得电泳样品； B、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法 (O电泳溶液准备 (a)去离子水溶解150重量份Tris，用HCl调PH值至9，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX); (b)去离子水溶解70重量份Tris，95重量份Tricine，3重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(IOX); (c)去离子水溶解180重量份Tris，I重量份SDS’用HCl调PH值至8.5，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3X); (d)45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液； (e)55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f)0.4 体积份 lmol/L, PH 为 6. 8 的 Tris-HCl, 3. 5 体积份甘油，I. 5 体积份 10%SDS,O. 8体积份β -巯基乙醇，O. 7体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6Χ)；(g)O. 8 体积份 lmol/L, PH 为 6. 8 的 Tris-HCl，2. 5 体积份甘油，I. 8 体积份 10%SDS, O. 8体积份β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX); (2)凝胶制备: 分离胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，O. 3重量份甘油，I. 2体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3. 5体积份，临用时加入O. 009体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0015体积份TEMED ； 夹层胶3体积份取上述制得的凝胶缓冲液(3 X) I. 2体积份，O. 55体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3. 5体积份，临用时加入O. 008体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 001体积份TCMED ； 浓缩胶2体积份0. 45体积份凝胶缓冲液(3X)，0. 18体积份3C储液，去离子水稀释至I. 5体积份，临用时加入O. 008体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0008体积份TEMED ； (3)电泳条件120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处； (4)染色方法 采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制 固定液量取甲醇30体积份，冰醋酸20体积份，加双蒸水稀释至100体积份； 染色液称取O. 6重量份AgNO3溶于3. 5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入O. 36%Na0H25体积份，再加入氨水I. 8体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份； 显色液0. 7体积份I %柠檬酸，O. 04体积份甲醛，加双蒸水至100体积份； 终止液量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份； C、具体染色步骤 (a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定I.2h,每15min换一次液； (b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次15min； (c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色15min； (d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2min； (e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液； (f)将胶转移至终止液终止染色； (g)在蒸馏水中漂洗凝胶O.5h ； (h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存； 在人工麝香电泳图谱中，出现分子量为91kDa、74kDa、55kDa、36kDa、ll. 3kDa的染色条带。
全文摘要
本发明公开了一种中药检测方法，具体涉及一种人工麝香的多肽电泳图谱检测方法。本发明采用电泳上样缓冲液直接提取分析，每个样品的用量仅需几毫克，该方法为人工麝香的鉴别建立了一种简便可行的辅助手段。
文档编号G01N27/447GK102937620SQ20121046693
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月15日 优先权日2012年11月15日
发明者潘杰, 黄进明, 于娟, 洪绯, 袁慧君 申请人:漳州片仔癀药业股份有限公司