专利名称：天然麝香的多肽电泳图谱检测方法
技术领域：
本发明涉及一种中药检测方法，具体涉及一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法。
背景技术：
麝香具有一定的抗炎镇痛药理活性，现有研究显示麝香的抗炎活性与麝香中特有的糖肽有关，不同文献报道其抗炎糖肽分子量各不相同，不同来源的麝香其多肽成分有显著性差异。常规的电泳分析体系Tris-甘氨酸-SDS-PAGE电泳分析分辨大分子物质的相对分子质量范围在l(T200kDa，对于相对分子质量小于IOkDa的多肽分辨率低。利用含有SDS的凝胶中加入高浓度脲时可利用SDS-PAGE对小分子多肽进行分析的分离效果不甚理想，且重现性较差，且小分子多肽在固定染色的过程中容易丢失。并且由于麝香样品蛋白含量较低，且麝香为贵重药材，在进行鉴别研究中不能采用先提取出其蛋白质成分，然后进行电泳检测的方法；另一方面，麝香样品 提取物中含有大量的色素类成分，难以在微量样品检测中有效去除。研究中发现优化的人工麝香凝胶电泳方法不适用于天然麝香样品，故采用Tricine-SDS-PAGE电泳，建立麝香多肽电泳方法。
发明内容
本发明提供了一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法。本发明目的是通过如下技术方案实现的:1、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备称取天然麝香样品0.003、.008重量份，加入I体积份乙醚，超声提取15 25min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液(IX)，超声提取15 25min，在4500rpm, 10°C条件下离心15 25min,取上清,加0.02%溴酹蓝,沸水浴3 8min,即得电泳样品;2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备:(a)去离子水溶解100 150重量份Tris，用HCl调PH值至7-9，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX);(b)去离子水溶解50 70重量份Tris，8(Tl00重量份1^(^1^，3 8重量份505，定容至500体积份，制得负极缓冲液(10 X );(C)去离子水溶解150 200重量份Tris，l 2重量份SDS，用HCl调PH值至疒9，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3X )；(d) 40^60%丙烯酰胺，Γ2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；(e)4(T60%丙烯酰胺，Γδ%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；
(f)0.2 I体积份lmol/L, PH为6.8的Tris-HCl, 2^4体积份甘油，I 3体积份10%SDS，0.6^1体积份β -巯基乙醇，0.5^1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液^X);(g) 0.2 I体积份lmol/L, PH为6.8的Tris-HCl，2 4体积份甘油，I 3体积份10%SDS，0.6 1体积份β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备:分离胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，0.2^0.6重量份甘油，0.5^1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2 4体积份，临用时加入0.005、.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005、.002体积份TEMED ；夹层胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ)0.5^1.5体积份，0.5^0.8体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2 4体积份，临用时加入0.005、.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005、.002体积份TEMED ；浓缩胶2体积份:0.4^0.6体积份凝胶缓冲液(3X)，0.Γθ.2体积份3C储液，去离子水稀释至广3体积份，临用时加入0.005、.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005 0.002 体积份 TEMED ；(3 )电泳条件:120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处(4)染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制:固定液:量取 甲醇30-60体积份，冰醋酸5-20体积份，加双蒸水稀释至100体积份；染色液:称取0.5^1.0重量份AgNO3溶于3飞体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%Na0H 15 30体积份，再加入氨水2体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份；显色液:0.3^0.8体积份I %柠檬酸，0.03、.08体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；终止液:量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份；3、具体染色步骤:(a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定0.5^1.5h，每l(T30min换一次液；(b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次5 15min ；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色l(T20min ；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2 4min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；(g)在蒸馏水中漂洗凝胶0.5^1.5h ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带.
本发明天然麝香的多肽电泳图谱检测方法优选如下步骤:1、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取天然麝香样品0.003重量份，加入I体积份乙醚，超声提取20min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液(IX),超声提取20min,在4500rpm,10°C条件下离心20min,取上清,加0.02%溴酹蓝,沸水浴5min,即得电泳样品；2、Tricine-SDS-PA重量份E凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备:(a)去离子水溶解100重量份Tris，用HCl调PH值至7.5，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX);(b)去离子水溶解55重量份Tris，90重量份Tricine，8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(10 X );(c)去离子水溶解160重量份Tris，1.5重量份SDS，用HCl调PH值至7.8，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3X )；(d) 56%丙烯酰胺，1.2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；(e) 52%丙烯酰胺，2.0%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f) 0.8 体积份 lmol/L, PH 为 6.8 的 Tris-HCl, 2 体积份甘油，3 体积份 10%SDS,0.7体积份β -巯基乙醇，1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6Χ)；(g) 0.4 体积份 lmol/L, PH 为 6.8 的 Tris-HCl，2 体积份甘油，2.5 体积份 10%SDS,I体积份β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备:分离胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，0.6重量份甘油，1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至4体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TEMED ；夹层胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，0.5体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2.5体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份的TEMED ；浓缩胶2体积份:取上述制得的0.6体积份凝胶缓冲液(3Χ)，0.2体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001 体积份 TEMED ；(3 )电泳条件:120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处；(4)染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制:固定液:量取甲醇50体积份，冰醋酸5体积份，加双蒸水稀释至100体积份；染色液:称取0.5重量份AgNO3溶于3体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%Na0H 18体积份，再加入氨水1.5体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌,全部加入后,加双蒸水至100体积份；显色液:0.8体积份I %柠檬酸，0.06体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；终止液:量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份；
3、具体染色步骤:(a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定Ih,每IOmin换一次液；(b)弃去固定液,凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次IOmin ；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色20min ；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗3min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；(g)在蒸馏水中漂洗凝胶Ih ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带.
本发明天然麝香的多肽电泳图谱检测方法还可以优选如下步骤:1、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备称取天然麝香样品0.008重量份，加入I体积份乙醚，超声提取18min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液(IX),超声提取22min,在4500rpm,1(TC条件下离心22min,取上清,加0.02%溴酹蓝,沸水浴4min,即得电泳样品；2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备:(a)去离子水溶解150重量份Tris，用HCl调PH值至9，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX);(b)去离子水溶解70重量份Tris，95重量份Tricine，3重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(10 X );(c)去离子水溶解180重量份Tris，I重量份SDS，用HCl调PH值至8.5，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3X )；(d) 45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；(e) 55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f) 0.4 体积份 lmol/L，PH为 6.8 的 Tris-HCl，3.5 体积份甘油，1.5 体积份 10%SDS，0.8体积份β -巯基乙醇，0.7体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6Χ)； (g) 0.8 体积份 lmol/L，PH为 6.8 的 Tris-HCl，2.5 体积份甘油，1.8 体积份 10%SDS，0.8体积份β-巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备:分离胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，0.3重量份甘油，1.2体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5体积份，临用时加入0.009体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0015体积份TEMED ；夹层胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ)1.2体积份，0.55体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5体积份，临用时加入0.008体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TEMED ；浓缩胶2体积份:0.45体积份凝胶缓冲液(3 X)，0.18体积份3C储液，去离子水稀释至1. 5体积份，临用时加入O. 008体积份的10%过硫酸铵溶液和O. 0008体积份TEMED ；(3)电泳条件120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处；(4)染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制固定液量取甲醇30体积份，冰醋酸20体积份，加双蒸水稀释至100体积份；染色液称取O. 6重量份AgNO3溶于3. 5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入
O.36%Na0H 25体积份，再加入氨水1. 8体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌,全部加入后,加双蒸水至100体积份； 显色液0. 7体积份I %柠檬酸，O. 04体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；终止液量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份；3、具体染色步骤(a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定1. 2h,每15min换一次液；(b)弃去固定液,凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次15min ；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色15min ；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；(g)在蒸馏水中漂洗凝胶O. 5h ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存；从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带.本发明所述重量份与体积份的关系为g/ml的关系。本发明方法采用电泳上样缓冲液直接提取分析，每个样品的用量仅需几毫克，该方法为天然麝香的鉴别建立了一种简便可行的辅助手段。
附图1 :天然麝香多肽电泳图谱；A = Marker+胰岛素；B J:天然麝香，批号依次为I 5，7 10下面实验和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例一天然麝香多肽电泳指纹图谱分析取天然麝香，批号依次为1-5，7-10，按照实施例一的方法，检测天然麝香的多肽电泳图谱，电泳结果显示，在研究的批次天然麝香中，除I个批次未能显示74kDa蛋白条带外(F泳道)，其余批次均含有分子量为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。结果见附图1 (其中A = Marker+胰岛素；B J:天然麝香，批号依次为I 5，7 10)结论从电泳图谱可以看出，天然磨香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带下述实施例均能实现上述实验例的效果。实施例1 :1、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备
称取天然磨香样品0.003g,加入Iml乙醚,超声提取20min,离心去上清,挥干乙醚，不溶物加0.05ml电泳上样缓冲液(IX)，超声提取20min，在4500rpm，10°C条件下离心20min,取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴5min，即得电泳样品；2、Tricine-SDS-PAgE凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备:(a)去离子水溶解IOOg Tris，用HCl调PH值至7.5，定容至500ml，制得正极缓冲液(IOX)；(b)去离子水溶解55g Tris, 90g Tricine, 8g SDS,定容至500ml,制得负极缓冲液(IOX)；(c)去离子水溶解160g Tris,1.5g SDS,用HCl调PH值至7.8，定容至500ml，制得凝胶缓冲液(3X);(d) 56%丙烯酰胺，1.2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；(e) 52%丙烯酰胺，2.0%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f)0.8ml lmol/L，PH 为 6.8 的 Tris-HCl，2ml 甘油，3ml 10%SDS，0.7ml β -巯基乙醇，1.5ml 1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10ml，制得上样缓冲液^X)；(g) 0.4ml lmol/L，PH 为 6.8 的 Tris-HCl，2ml 甘油，2.5ml 10%SDS，Iml β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60ml，制 得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备:分离胶3ml:取上述制得的凝胶缓冲液(3X) lml，0.6g甘油，1.5ml 6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至4ml，临用时加入0.005ml的10%过硫酸铵溶液和0.0Olml TEMED ；夹层胶3ml:取上述制得的凝胶缓冲液(3X) lml，0.5ml 3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2.5ml,临用时加入0.005ml的10%过硫酸铵溶液和0.0Olml的TEMED ；浓缩胶2ml:取上述制得的0.6ml凝胶缓冲液(3X)，0.2ml 3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2ml，临用时加入0.005ml的10%过硫酸铵溶液和0.0Olml TEMED ；(3)电泳条件:120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处；(4)染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制:固定液:量取甲醇50ml，冰醋酸5ml，加双蒸水稀释至IOOml ；染色液:称取0.5g AgNO3溶于3ml双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%Na0H 18ml,再加入氨水1.5ml混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至IOOml ；显色液:0.8ml I %柠檬酸，0.06ml甲醛，加双蒸水至IOOml ；终止液:量取冰醋酸1ml，加双蒸水稀释至IOOml ；3、具体染色步骤:(a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定Ih,每IOmin换一次液；(b)弃去固定液,凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次IOmin ；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色20分钟；
(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗3min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；(g)在蒸馏水中漂洗凝胶Ih ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存。从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带.
实施例2:1、养殖麝香凝胶电泳分析样品的制备称取养殖磨香样品0.008g,加入Iml乙醚,超声提取20min,离心去上清,挥干乙醚，不溶物加0.05ml电泳上样缓冲液(IX)，超声提取22min，在4500rpm，10°C条件下离心22min,取上清，加0.02%溴酚蓝，沸水浴4min，即得电泳样品；2、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法(I)电泳溶液准备:(a)去离子水溶解150g Tris，用HCl调PH值至9，定容至500ml，制得正极缓冲液(IOX)；(b)去离子水溶解70g Tris, 95gTricine, 3g SDS,定容至500ml,制得负极缓冲液(IOX)；(c)去离子水溶解180g Tris,lg SDS，用HCl调PH值至8.5，定容至500ml，制得凝胶缓冲液(3X);(d)45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液；(e)55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f) 0.4ml lmol/L，PH 为 6.8 的 Tris-HCl，3.5ml 甘油，1.5ml 10%SDS, 0.8ml β -巯基乙醇，0.7ml 1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10ml，制得上样缓冲液^X)；(g) 0.8ml lmol/L，PH 为 6.8 的 Tris-HCl，2.5ml 甘油，2.5ml 10%SDS，0.8ml β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60ml，制得上样缓冲液(IX);(2)凝胶制备:分离胶3ml:取上述制得的凝胶缓冲液(3X) lml，0.3g甘油，1.2ml6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5ml，临用时加入0.009ml的10%过硫酸铵溶液和0.0015mlTEMED ；夹层胶3ml:取上述制得的凝胶缓冲液(3X)1.2ml, 0.55ml3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5ml,临用时加入0.008ml的10%过硫酸铵溶液和0.0Olml TEMED ；浓缩胶2ml:0.45ml凝胶缓冲液(3X)，0.18ml 3C储液，去离子水稀释至1.5ml，临用时加入0.008ml的10%过硫 酸铵溶液和0.0008ml TEMED ；(3)电泳条件:120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处；(4)染色方法采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制:固定液:量取甲醇30ml，冰醋酸20ml，加双蒸水稀释至IOOml ；染色液:称取0.6gAgN03溶于3.5ml双蒸水中；取洁净烧杯,加入0.36%Na0H 25ml,再加入氨水1.8ml混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至IOOml ；显色液0. 7ml I %梓檬酸，O. 04ml甲醒，加双蒸水至IOOml ；终止液量取冰醋酸1ml，加双蒸水稀释至IOOml ；3、具体染色步骤(a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定1. 2h,每15min换一次液；(b)弃去固定液,凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次15min ；(c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色15min ；(d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2min ；(e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液；(f)将胶转移至终止液终止染色；(g)在蒸馏水中漂洗凝胶O. 5h ；(h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存。从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量约为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。
权利要求
1.一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤: A、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备 称取天然麝香样品0.003、.008重量份，加入I体积份乙醚，超声提取15 25min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液(IX)，超声提取15 25min，在4500rpm, 10°C条件下离心15 25min,取上清,加0.02%溴酹蓝,沸水浴3 8min,即得电泳样品; B、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法 (O电泳溶液准备: (a)去离子水溶解100 150重量份Tris，用HCl调PH值至7_9，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX); (b)去离子水溶解5(Γ70重量份Tris，8(Tl00重量份Tricine，3 8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(10 X ); (c)去离子水溶解15(Γ200重量份Tris，Γ2重量份SDS，用HCl调PH值至7 9，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3 X ); (d)40^60%丙烯酰胺，Γ2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液； (e)40^60%丙烯酰胺，Γ5%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液； (f)0.2 I体积份ImoI/L, PH为6.8的Tris-HCl，2 4体积份甘油，I 3体积份10%SDS,0.6^1体积份β巯基乙醇，0.5^1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6Χ)； (g)0.2 I体积份ImoI/L, PH为6.8的Tris-HCl，2 4体积份甘油，I 3体积份10%SDS,0.6 1体积份β_巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX)； (2)凝胶制备: 分离胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，0.2^0.6重量份甘油，0.5^1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2 4体积份，临用时加入0.005、.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005、.002体积份TEMED ； 夹层胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ)0.5^1.5体积份，0.5^0.8体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2 4体积份，临用时加入0.005、.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005、.002体积份TEMED ； 浓缩胶2体积份:0.4^0.6体积份凝胶缓冲液(3X)，0.Γ0.2体积份3C储液，去离子水稀释至广3体积份，临用时加入0.005、.02体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0005、.002体积份TCMED ； (3)电泳条件:120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处 (4)染色方法 采用灵敏度高的银染，以下`溶液临用前配制: 固定液:量取甲醇30-60体积份，冰醋酸5-20体积份，加双蒸水稀释至100体积份； 染色液:称取0.5^1.0重量份AgNO3溶于3飞体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%Na0H 15 30体积份，再加入氨水2体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份； 显色液:0.3^0.8体积份I %柠檬酸，0.03、.08体积份甲醛，加双蒸水至100体积份；终止液:量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份； C、具体染色步骤: (a)电泳结束后，将凝胶转移至固定液中固定0.5^1.5h，每l(T30min换一次液； (b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次5 15min； (c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色IOlOmin； (d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2 4min； (e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液； (f)将胶转移至终止液终止染色； (g)在蒸馏水中漂洗凝胶0.5^1.5h ； (h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存； 从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。
2.如权利要求1所述的天然麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤: A、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备 称取天然麝香样品0.003重量份，加入I体积份乙醚，超声提取20min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液(IX)，超声提取20min，在4500rpm，10°C条件下离心20min,取上清,加0.02%溴酹蓝,沸水浴5min,即得电泳样品； B、Tricine-SDS-PA重量份E凝胶电泳分析方法 (O电泳溶液准备: (a)去离子水溶解100重量份Tris，用HCl调PH值至7.5，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX); (b)去离子水溶解55重量份Tris，90重量份Tricine，8重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(IOX); (c)去离子水溶解160重量份Tris，1.5重量份SDS，用HCl调PH值至7.8，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3 X ); (d)56%丙烯酰胺，1.2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液； (e)52%丙烯酰胺，2.0%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液； (f)0.8体积份lmol/L, PH为6.8的Tris-HCl，2体积份甘油，3体积份10%SDS, 0.7体积份β -巯基乙醇，1.5体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液^X); (g)0.4体积份lmol/L, PH为6.8的Tris-HCl，2体积份甘油，2.5体积份10%SDS, I体积份巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX); (2)凝胶制备: 分离胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，0.6重量份甘油，1.5体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至4体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TEMED ； 夹层胶3体积份:取上述 制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，0.5体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2.5体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份的TEMED ；浓缩胶2体积份:取上述制得的0.6体积份凝胶缓冲液(3 X)，0.2体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至2体积份，临用时加入0.005体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TCMED ； (3)电泳条件:120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处； (4)染色方法 采用灵敏度高的银染，以下 溶液临用前配制: 固定液:量取甲醇50体积份，冰醋酸5体积份，加双蒸水稀释至100体积份； 染色液:称取0.5重量份AgNO3溶于3体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%Na0H18体积份，再加入氨水1.5体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份； 显色液:0.8体积份1 %柠檬酸，0.06体积份甲醛，加双蒸水至100体积份； 终止液:量取冰醋酸1体积份，加双蒸水稀释至100体积份； C、具体染色步骤: (a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定Ih,每IOmin换一次液； (b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次,每次1Omin； (c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色20min； (d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗3min； (e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液； (f)将胶转移至终止液终止染色； (g)在蒸馏水中漂洗凝胶Ih； (h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存； 从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。
3.如权利要求1所述的天然麝香的多肽电泳图谱检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤: A、天然麝香凝胶电泳分析样品的制备 称取天然麝香样品0.008重量份，加入I体积份乙醚，超声提取18min，离心去上清，挥干乙醚，不溶物加0.05体积份电泳上样缓冲液(IX)，超声提取22min，在4500rpm，10°C条件下离心22min,取上清,加0.02%溴酹蓝,沸水浴4min,即得电泳样品； B、Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳分析方法 (O电泳溶液准备: (a)去离子水溶解150重量份Tris，用HCl调PH值至9，定容至500体积份，制得正极缓冲液(IOX); (b)去离子水溶解70重量份Tris，95重量份Tricine，3重量份SDS，定容至500体积份，制得负极缓冲液(1OX); (c)去离子水溶解180重量份Tris，I重量份SDS’用HCl调PH值至8.5，定容至500体积份，制得凝胶缓冲液(3X); (d)45%丙烯酰胺，2%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得3C丙烯酰胺储液； (e)55%丙烯酰胺，4%甲叉丙烯酰胺，加入去离子水溶解，制得6C丙烯酰胺储液；(f)0.4 体积份 lmol/L, PH 为 6.8 的 Tris_HCl，3.5 体积份甘油，1.5 体积份 10%SDS,0.8体积份β -巯基乙醇，0.7体积份1%溴酚蓝，加蒸馏水补足10体积份，制得上样缓冲液(6Χ)；(g)0.8 体积份 lmol/L, PH 为 6.8 的 Tris-HCl，2.5 体积份甘油，1.8 体积份 10%SDS, 0.8体积份β -巯基乙醇，加蒸馏水补足60体积份，制得上样缓冲液(IX); (2)凝胶制备: 分离胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3Χ) I体积份，0.3重量份甘油，1.2体积份6C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5体积份，临用时加入0.009体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0015体积份TEMED ； 夹层胶3体积份:取上述制得的凝胶缓冲液(3 X)1.2体积份，0.55体积份3C丙烯酰胺储液，去离子水稀释至3.5体积份，临用时加入0.008体积份的10%过硫酸铵溶液和0.001体积份TCMED ； 浓缩胶2体积份:0.45体积份凝胶缓冲液(3X)，0.18体积份3C储液，去离子水稀释至1.5体积份，临用时加入0.008体积份的10%过硫酸铵溶液和0.0008体积份TEMED ； (3)电泳条件:120V恒压电泳至溴酚蓝距凝胶底部Icm处； (4)染色方法 采用灵敏度高的银染，以下溶液临用前配制: 固定液:量取甲醇30体积份，冰醋酸20体积份，加双蒸水稀释至100体积份； 染色液:称取0.6重量份AgNO3溶于3.5体积份双蒸水中；取洁净烧杯，加入0.36%Na0H25体积份，再加入氨水1.8体积份混匀，将制备好的AgNO3溶液逐滴加入，边加边搅拌，全部加入后，加双蒸水至100体积份； 显色液:0.7体积份I %柠檬酸，0.04体积份甲醛，加双蒸水至100体积份； 终止液:量取冰醋酸I体积份，加双蒸水稀释至100体积份； C、具体染色步骤: (a)电泳结束后,将凝胶转移至固定液中固定1.2h,每15min换一次液； (b)弃去固定液，凝胶以双蒸水中漂洗3次，每次15min； (c)将胶移入一个干净的容器内，染色液中轻摇染色15min； (d)弃去染色液，加双蒸水震荡漂洗2min； (e)将胶移至显色液中轻摇显色，至色带清晰，弃去显色液； (f)将胶转移至终止液终止染色； (g)在蒸馏水中漂洗凝胶0.5h ； (h)进行凝胶扫描或将凝胶进行干胶保存； 从电泳图谱可以看出，天然麝香电泳图谱中具有分子量为74kDa、67kDa的蛋白染色条带。
全文摘要
本发明公开了一种中药检测方法，具体涉及一种天然麝香的多肽电泳图谱检测方法。本发明采用电泳上样缓冲液直接提取分析，每个样品的用量仅需几毫克，该方法为天然麝香的鉴别建立了一种简便可行的辅助手段。
文档编号G01N27/447GK103076382SQ20121047017
公开日2013年5月1日 申请日期2012年11月15日 优先权日2012年11月15日
发明者潘杰, 黄进明, 于娟, 洪绯, 袁慧君 申请人:漳州片仔癀药业股份有限公司