单核细胞趋化蛋白2作为结核性胸水检测的标志物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及MCP-2/CCL8蛋白作为鉴别诊断结核性胸水的标志物及其应用。本发明提供了MCP-2/CCL8蛋白在制备结核性胸水鉴别诊断试剂或试剂盒的用途。本发明还提供了相应的检测试剂盒。本发明还提供了检测或诊断结核性胸水的方法。
【专利说明】单核细胞趋化蛋白2作为结核性胸水检测的标志物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学和诊断领域。更具体地说，本发明涉及一种可用于检测结核的胸水标记物及其用途。
【背景技术】
[0002]目前，结核病仍是全球发病率及死亡率最高的感染性疾病。结核性胸膜炎(Tuberculosis Pleuritis, TP)是机体处于高敏状态,对结核菌及其代谢产物在胸膜出现的炎症反应，是原发或继发结核累及胸膜的结果。TP是肺外结核中是最常见的结核感染形式之一,仅次于淋巴结结核。结核病人中大约有5%会发生TP，其往往呈急性发病，约1/3的患者在I周内出现症状，2/3的患者在I个月内出现症状。最常见的症状是胸膜性疼痛(75%)、干咳(70%)。典型TP的临床特征为单侧胸腔少到中等量的积液，即结核性胸腔积液(Tuberculosis PleuralEffusions, TPE)。
[0003]TP如未经治疗，其自然病程一般为4?16周，其中有43%到65%的病例会在若干年后发展为活动性肺结核或肺外结核。因此正确诊断与治疗TP很重要。目前，治疗方法主要为抗结核药治疗，另外辅以糖皮质激素及胸水抽吸或引流。TP的确诊需要在痰、胸水或胸膜活检中鉴定出结核分枝杆菌。影像学手段及胸腔镜均有助于诊断TPE。此外，支持诊断的依据还包括行胸腔穿刺进行胸水检查。胸水检查包括常规的理化特性检查(颜色、PH值、葡萄糖浓度等)、胸水涂片与培养、腺苷脱氨酶(ADA)检测。胸水涂片与培养因其检出率低、检测周期长有很大的局限性。ADA检测成本低、创伤小、方便快捷，如果胸水中ADA含量>70IU/L则高度提示结核，反之，如果〈40IU/L则可以基本上可以排除结核，其敏感度可高达95%，因此被广泛采用于TPE的辅助诊断，但是由于某些淋巴细胞丰富的胸水如:类风湿性关节炎、支气管肺泡癌、间皮瘤、支原体和衣原体性肺炎、肺吸虫病、球孢子菌病等胸水ADA往往也会增高，因此该检测方法的特异度仍存在不足，为此，ADA检测结果的分析应该结合临床所见以及常规检验结果。
[0004]随着细胞生物学与分子生物学的进展，胸液积液的免疫学检查受到关注。胸膜腔的炎症导致胸膜血管通透性的增加，从而产生富含蛋白和细胞的渗出性胸腔积液。结核性胸膜炎和恶性胸腔积液是导致淋巴细胞性胸腔积液(胸腔积液中淋巴细胞数量占白细胞总数的50%以上)的常见病因，⑶4+T淋巴细胞在此过程中占居主导地位。结核性胸膜炎以Thl反应为主，恶性胸腔积液以Th2反应为主。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等，刺激B细胞产生IgE和其它抗体参与过敏反应；而Thl细胞主要分泌IFN- Y和IL-2，通过激活巨噬细胞和细胞毒性T细胞在抗胞内病原体感染中发挥重要作用。结核分枝杆菌的感染是一个复杂的免疫反应的过程，CD4+、CD8+效应性T细胞是参与结核性胸膜炎防御反应的重要效应细胞，可通过分泌特异性IFN-Y介导免疫应答。因此，结核性胸腔积液中表达高水平的IFN-Y，测定TPE中IFN-Y浓度有助于诊断结核性胸膜炎，该检测方法具有较高的灵敏度和特异度，但其诊断价值仍存有争议。研究发现，病变部位还存在招募淋巴细胞的趋化因子，如巨噬细胞炎症蛋白1-α (ΜΙΡ1-α)、干扰素诱导蛋白-10、单核细胞趋化蛋白I (MCP-1)。这些趋化因子可能介导选择性募集淋巴细胞到胸腔积液中。虽然，某些细胞因子如IL-2、TNF-a、IL-1 β及趋化因子如IP_10、MCP_1在结核性胸腔积液中的表达水平及诊断价值有零星报道，但是目前尚缺乏对胸腔积液中免疫细胞及免疫分子的系统分析，因此，尚未发现优于IFN-Y的新诊断标志物。
[0005]因此，本领域急需对结核病具备鉴别诊断意义的标志物以及检测该标志物进而诊断结核病的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种鉴别诊断结核性胸水的标志物及其在制备结核性胸水鉴别诊断试剂或试剂盒中的用途。
[0007]本发明的另一目的是提供鉴别诊断结核性胸水的检测试剂盒以及检测或诊断结核性胸水的方法。
[0008]在第一方面，本发明提供MCP-2/CCL8蛋白在制备检测结核性胸水的试剂盒或检测试剂中的用途。
[0009]在优选的实施方式中，所述检测试剂是MCP-2/CCL8蛋白的特异性抗体。
[0010]在优选的实施方式中，所述检测试剂是带有或不带有检测标记的单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清，或蛋白芯片。
[0011]在进一步的优选实施方式中，所述可检测标记选自下组:生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
[0012]在第二方面，本发明提供MCP-2/CCL8蛋白作为结核性胸水检测标志物的用途。
[0013]在第三方面，本发明提供一种结核性胸水检测的试剂盒，所述试剂盒包括:
[0014]a)容器，
[0015]b)装在所述容器内的MCP-2/CCL8蛋白的检测试剂；和
[0016]c)标签或使用说明书，所述标签或使用说明书注明所述试剂盒用于胸水检测或诊断结核病以及利用所述检测试剂检测结核病的使用方法。
[0017]在优选的实施方式中，所述标签或说明书中注明:
[0018]如果检测对象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，则诊断该对象具有
结核病。
[0019]在进一步优选的实施方式中，如果检测对象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于25pg/ml,更优选高于30pg/ml,则诊断该对象具有结核病。
[0020]在另一优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括检测胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴细胞的含量的试剂。
[0021]在进一步优选的实施方式中，所述标签或说明书中还注明:
[0022]如果检测对象的胸水中CD3+和/或CD4+T淋巴细胞的含量高于其他疾病对照，则诊断该对象具有结核病。
[0023]在另一优选的实施方式中，所述检测试剂是MCP-2/CCL8蛋白的特异性抗体。
[0024]在进一步优选的实施方式中,所述检测试剂是带有或不带有检测标记的单克隆抗体、多克隆抗体或抗血清，或蛋白芯片。[0025]在优选的实施方式中，所述可检测标记选自下组:生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
[0026]在第四方面，本发明提供一种检测结核病的方法，所述方法包括:
[0027]检测待测对象的胸水样品中MCP-2/CCL8蛋白的含量，如果检测的MCP-2/CCL8蛋白含量高于其他疾病对照，则诊断该对象具有结核病。
[0028]在优选的实施方式中，如果检测的MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，则诊断
该对象具有结核病。
[0029]在另一优选的实施方式中，如果检测对象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于25pg/ml,更优选高于30pg/ml,则诊断该对象具有结核病。
[0030]在进一步优选的实施方式中，所述方法还包括检测胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴细胞的含量是否升高。
[0031]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1.结核患者胸水中MCP-2/CCL-8的表达水平高。(A)应用蛋白质芯片筛选结核患者和非结核患者的胸水中差异表达的细胞因子，并用ELISA方法验证；(B)结核患者和非结核患者胸水中差异表达的蛋白质；(C-D)ELISA测定结核患者或非结核患者胸水中IFN-y (C)或MCP-2/CCL8 (D)的蛋白水平；(E) ELISA测定有或无胸水的结核患者与健康志愿者的外周血中MCP-2/CCL8的蛋白水平；(F)显示MCP-2/CCL8和IFN- Y的曲线下面积(AUC)的受试者运算特征曲线(ROC)。
[0033]图2.结核患者胸水中表达CCR5的⑶4+T细胞的比例显著上调。㈧FACS检测结核患者胸水中⑶3+、⑶4+和⑶8+细胞的代表性图示；(B)FACS检测结核患者胸水中⑶3+、⑶4+和⑶8+细胞上CCR5表达的代表性图示；(C)比较结核患者和恶性肿瘤患者胸水(n=6)之间表达CCR5的CD3+、CD4.和CD8.细胞的百分比，*，ρ〈0.05。
[0034]图3.806诱导巨噬细胞1?^-2/^(^8表达。(A)实时定量PCR检测用感染复数(Multiplicity OfInfection, Μ0Ι)为5的BCG感染所示时间的鼠巨噬细胞系Raw264.7中mcp-2/ccl8mRNA的产生；(B)实时定量PCR检测用MOI为5的BCG处理所示时间的原代腹腔巨噬细胞中mcp-2/ccl8mRNA的产生；(C)ELISA检测用MOI为5的BCG感染所示时间的THP-1 (一种人急性单核细胞白血病细胞系)中MCP-2/CCL8蛋白，**，p〈0.001，*，p〈0.05。
[0035]图4.p38和PI3K调节BCG-诱导的MCP-2/CCL8表达。⑷用BCG感染所示时间的巨噬细胞中信号通路p38、JNK、ERK、Akt、NF- κ B磷酸化的蛋白质印迹，数据是三次独立实验的代表性结果；(B)激酶抑制剂 SB203580、SP600125、PD98059、LY294002、BAYl 1-7082 处理后，用MOI为5的BCG感染24h的鼠巨噬细胞系Raw264.7中MCP_2/CCL8mRNA的实时定量 PCR 检测；(C)不同的激酶抑制剂 SB203580、SP600125、PD98059、LY294002、BAYl 1-7082处理后，用MOI为5的BCG感染24h的THP-1细胞中MCP-2/CCL8蛋白的ELISA检测，**，p〈0.001，木，p〈0.05。
[0036]图5.BCG通过TLR2诱导MCP-2/CCL8表达。⑷用MOI为5的BCG感染24h的野生型、TLR2+KCKTLR3+K0及TLR4+K0小鼠的原代腹腔巨噬细胞中mcp-2/ccl8mRNA的实时定量PCR。#，p〈0.0Ol。比较KO小鼠与野生型小鼠中巨噬细胞经BCG感染后mcp-2/ccl8mRNA的表达。⑶用MOI为5的BCG感染所示时间的野生型或TLR2K0小鼠的原代腹膜巨噬细胞中Akt磷酸化的蛋白质印迹测定。所示数据是三次独立实验的代表性图示。(C) (B)的三个独立实验的密度分析。显示的数据是三次独立实验的平均值土标准差，*，P〈0.05。
[0037]图6描述了分枝杆菌诱导巨噬细胞表达MCP-2/CCL8，在结核胸水中募集表达CCR5的T淋巴细胞。分枝杆菌通过TLR2/PI3K/Akt和p38信号通路激活巨噬细胞中MCP-2/CCL8的释放。结核性胸水中高度表达的MCP-2/CCL8可招募高表达CCR5 (MCP-2/CCL8所用的初始受体)的CD4+T淋巴细胞到感染部位。
【具体实施方式】
[0038]发明人经过广泛而深入的研究，发现MCP-2/CCL8在结核病人的胸水中明显高表达，结核病人胸水MCP-2/CCL8的敏感性和特异性都是100%，从而MCP-2/CCL8可以作为特异性诊断结核病人胸水的标志物，进而作为特异性检测和诊断结核病的标志物。在此基础上完成了本发明。
[0039]胸水
[0040]本领域技术人员鉴于本文的教导和现有技术应该知道，本文所用的术语“胸水”又称为胸腔积液或胸腔积水，是指由壁层胸膜与脏层胸膜组成的封闭性胸腔内，起润滑作用的很少量液体。
[0041]当发生某种情况影响到胸膜，可使得胸腔内液体增多，也就是产生所谓的胸腔积水(积液)。胸水从性质上可分为渗出性及漏出性。渗出性的病因很多，归纳起来为两大类:一类是炎症性病变所致，如由细菌、病毒或真菌等感染胸膜引起感染性炎症，导致胸腔积液，或由于肺栓塞、胰腺炎、结缔组织疾病等非感染性炎症引起胸腔积液；第二类是肿瘤性的，如肿瘤长在胸膜上或转移侵犯胸膜引起积液，可见于胸膜间皮瘤、肺癌、乳房癌、胃癌等。漏出性胸腔积液的病因，可以是全身性疾病，如低蛋白血症、过敏性疾病,也可以是某器官的病变，如充血性心力衰竭、肝硬化、肝阿米巴病、胸导管破裂等。
[0042]由于产生胸水的原因很多，现有技术中，简单检测胸水在临床上不具备鉴别诊断意义。
[0043]MCP-2/CCL8蛋白及其编码基因
[0044]本文所述的MCP-2/CCL8是炎症的趋化因子，它是用干扰素和其他促炎细胞因子旁分泌刺激T-细胞，或通过与病毒、细菌和真菌接触时的天然免疫而表达在炎性组织上的细胞及其浸润的细胞，主要是单核细胞和巨噬细胞表达的趋化因子。它是通过不同的趋化因子受体包括趋化因子受体CCR1，CCR2B和CCR5去趋化、激活不同的细胞类型像粒细胞，单核吞噬细胞。
[0045]在本发明中，术语“本发明蛋白”、“MCP-2/CCL8蛋白”、“MCP-2/CCL8多肽”可互换使用，都指NCBI基因登录号6355所示的蛋白或多肽(其氨基酸序列为MKVSAALLCLLLMAATFSPQGLAQPDSVSIPITCCFNVINRKIPIQRLESYTRITNIQCPKEAVIFKTKRGKEVCADPKERWVRDSMKHLDQIFQNLKP, SEQ ID NO:1)。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的MCP-2/CCL8蛋白。此外，该术语还应包括全长的MCP-2/CCL8蛋白及其片段。本发明的MCP-2/CCL8蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。
[0046]在本发明中，术语“MCP-2/CCL8基因”或“MCP-2/CCL8多核苷酸”可互换使用，指具有人MCP-2/CCL8核苷酸序列(NCBI基因登录号6355)的核酸序列(其核苷酸序列为atgaaggtttctgcagcgcttctgtgcctgctgctcatggcagccactttcagccctcagggacttgctcagccagattcagtttccattccaatcacctgctgctttaacgtgatcaataggaaaattcctatccagaggctggagagctacacaagaatcaccaacatccaatgtcccaaggaagctgtgatcttcaagaccaaacggggcaaggaggtctgtgctgaccccaaggagagatgggtcagggattccatgaagcatctggaccaaatatttcaaaatctga，SEQ ID N0:2)o 需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。
[0047]在得到MCP-2/CCL8蛋白的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的MCP-2/CCL8核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0048]一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0049]此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0050]目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。
[0051]通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产重组的MCP-2/CCL8蛋白或多肽。一般来说有以下步骤:
[0052]I)用本发明的编码人MCP-2/CCL8蛋白或多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0053]2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0054]3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0055]本发明中，MCP-2/CCL8多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0056]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含MCP-2/CCL8编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0057]此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0058]包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0059]宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。
[0060]用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0061]获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0062]在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 ο
[0063]特异性抗体
[0064]在本发明中，术语“本发明抗体”和“MCP-2/CCL8的特异性抗体”可互换使用。
[0065]本发明还包括对人MCP-2/CCL8蛋白或多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人MCP-2/CCL8基因产物或片段。较佳地，指那些能与人MCP-2/CCL8基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人MCP-2/CCL8蛋白的分子，也包括那些并不影响人MCP-2/CCL8蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人MCP-2/CCL8基因产物结合的抗体。
[0066]本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利N0.4，946，778);或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
[0067]本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人MCP-2/CCL8基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人MCP-2/CCL8蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见 Kohler 等人，Nature256;495, 1975;Kohler 等人，F.ur.T.Tmmunol.6:511, 1976; Kohler 等人,Eur.T.Jmmun ο 1.6:292, 1976; Hammerling 等人,In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人MCP-2/CCL8蛋白功能的抗体以及不影响人ANGPTL4蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人ANGPTL4基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人MCP-2/CCL8基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
[0068]抗人MCP-2/CCL8蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是血清样本)中的人MCP-2/CCL8蛋白。
[0069]检测方法
[0070]本发明创造性地发现胸水中的MCP-2/CCL8蛋白可以作为特异性检测和诊断结核病的标志物，进而提供了结核病的检测方法，所述方法包括利用MCP-2/CCL8蛋白检测试剂检测待测患者胸水中的MCP-2/CCL8蛋白含量，如果与其他疾病对照相比，该含量升高，则所述待测患者具有结核病。
[0071]在优选的实施方式中，如果检测的MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，则诊断
该对象具有结核病。
[0072]在优选的实施方式中，所述方法还包括检测胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴细胞的含量相比于其他疾病对照是否升高。
[0073]检测试剂盒
[0074]本发明还提供用于在胸水中检测MCP-2/CCL8蛋白，进而诊断结核病的试剂盒，所述试剂盒包括:
[0075]a)容器，
[0076]b)装在所述容器内的MCP-2/CCL8蛋白的检测试剂；和
[0077]b)标签或使用说明书，所述标签或使用说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断结核病以及利用所述检测试剂检测结核病的使用方法。
[0078]在优选的实施方式中，所述标签或说明书中注明:
[0079]如果检测对象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，则诊断该对象具有
结核病。
[0080]在进一步优选的实施方式中，所述试剂盒中还包括检测胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴细胞的含量的试剂。
[0081]在另一优选的实施方式中，所述标签或说明书中还注明:
[0082]如果检测对象的胸水中⑶3+和/或⑶4+T淋巴细胞的含量高于正常对照，则诊断该对象具有结核病。
[0083]在具体的实施方式中，所述检测试剂是MCP-2/CCL8蛋白的特异性抗体。
[0084]本发明人利用所述诊断试剂盒，已完成实验128例，其中确诊结核病人75例，确诊非结核病人(对照病人)53例，诊断结果如表2所示，敏感性为93.33%，特异性为94.8%。
[0085]本发明的优点:
[0086]1.本发明首次发现胸水中的MCP-2/CCL8在检测结核病中的应用；
[0087]2.本发明的MCP-2/CCL8蛋白可以作为特异性诊断结核病人胸水的标志物；
[0088]3.本发明的MCP-2/CCL8蛋白可以作为特异性检测和诊断结核病的标志物；
[0089]4.利用本发明的MCP-2/CCL8蛋白检测结核病的敏感性和特异性都极高。[0090]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0091]实验材料与方法
[0092]细胞培养基及试剂
[0093]小鼠巨噬细胞系RAW264.7 (ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚州)及THP-1细胞(人急性单核细胞性白血病细胞系，ATCC，马纳萨斯，维吉尼亚州)均用补加了 10%小牛血清(FBS)及抗生素(50U/mL青霉素和50 μ g/mL链霉素)的RPMI1640培养基培养。THP-1细胞在用Mtb刺激前需用50ng/mL的PMA(Sigma公司)预处理24h以诱导其分化为巨噬细胞。
[0094]RPMI1640, DMEM、FBS、青霉素及链霉素均购自上海Invitrogen公司。PI3K 抑制剂(LY294002)，p-ERK 抑制剂(PD980259), p-JNK ?φ 制剂(SP600125)，ρ-ρ38 抑制剂(SB203580)及 NF-κ B 抑制剂(ΒΑΥ11-7082)均购自 Enzo LifeSciences (Farmingdale, NY)。抗体 p_AKT、p-p38、p-ERK、p-JNK、p-p65 及肌动蛋白均购自Cell Signaling Technology (Beverly, MA) ? 聚乙烯(PE)或异硫氰酸突光素(FITC)标记的 CD3、CD4、CD8 及 CCR5 抗体均购自 ebioscience (San Diego, CA)。 [0095]细菌
[0096]牛分枝杆菌BCG (购自中国兽药监察局)于37 °C，用Middlebrook7H9肉汤培养基(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)作摇床培养。培养基成分为Middlebrook7H9加入0.05%吐温-80和10%过氧化氢酶葡萄糖酸蛋白(OADC)浓缩油(Becton Dickinson, Sparks, MD)。细菌悬液在 2500g 离心 IOmin,沉淀物用含 2mM 左旋谷氨酰胺、0.1mM非必须氨基酸、ImM丙酮酸钠及20mM碳酸氢钠(Gibco BRL, LifeTechnologies, Grand Island, NY) (CRPMI)的 RPMI1640 重悬，经 27-号针破坏菌团 2 次。取ImL置于-80°C至少I天，后将该培养液用含有10%0ADC的Middlebrook7Hll培养基(BectonDickinson C0., Sparks, MD)以连续稀释法进行稀释。
[0097]动物及腹腔巨噬细胞的分离
[0098]将TLR2+，TLR3+ 及 TLR4+ 突变小鼠(获自 Jackson Laboratory, US)和 C57BL/6小鼠回交8代，C57BL/6小鼠作对对照小鼠。所有的小鼠均饲养于上海实验动物中心，进行实验的小鼠均为6~8周龄。腹腔巨噬细胞用下述方法进行分离。给小鼠腹膜内注射2mL4%巯基醋酸盐培养基(FTG)。3天后，用预冷的PBS以腹腔灌洗法获取细胞，铺板2h待细胞贴壁，然后更换RPMI1640培养基，同时除去未贴壁的细胞。贴壁单层细胞24h后作为原代腹腔巨噬细胞使用。BCG刺激前12h更换无胎牛血清但含1%抗生素的RPMI 1640培养，用以将FBS的影响降到最低。所有的细胞均培养于5%C02的细胞培养箱。
[0099]对象
[0100]该研究项目经同济大学医学院批准，所有样本提供者的知情同意书均已获得。88位含胸水病患(年龄39.9±8.4岁)确诊为结核患者，(通过胸水中结核菌的培养阳性或胸膜组织活检确诊)。所有的结核患者均为入住上海市肺科医院的病人，均是人体免疫缺损病毒(HIV)抗体阴性，TB化学治疗之后，所有病患的胸水消退，临床症状减轻。在样品收集时所有病患均未接受TB药物、激素或者其他非激素类抗炎药物治疗。70位病患(年龄42.9±5.4岁)已从病因学(如恶性肿瘤、肺炎及PAH)上证明为非结核型胸水，其样本收集作为对照组。
[0101]PE和血清分离及ELISA分析
[0102]TB和非TB患者的胸水在住院24h后通过标准的胸腔穿刺术收集在肝素锂抗凝采血管中。获得IOmL周边血并离心处理，收集上清用ELISA法检测MCP-2/CCL8和Y -干扰素。
[0103]细胞因子的蛋白芯片分析
[0104]PE中细胞因子的浓度用RayBio人类炎症抗体阵列3 (货号AAH-1NF-G3-8)检测。玻璃芯片封闭好后，将IOOyL PE样本直接加入子阵列中，用抗体孵育，之后用生物素化的抗体混合物孵育，再用带标记的链霉亲和素孵育。之后用AxonGenePix (发射频率532nm)扫描该孔板以检测荧光信号，荧光强度值用相应分析软件分析得到。
[0105]RNA的制备，反转录PCR及实时定量PCR
[0106]用TRIzol试剂将总RNA分离出后，使用MMLV反转录系统(Invitrogen)进行反转录PCR (RT-PCR)。MCP-2/CCL8进行实时定量PCR (qRT-PCR)的引物为正向引物5' -TCTACGCAGTGCTTCTTTGCC-3' (SEQ ID NO: 3)和反向引物 5' -AAGGGGGATCTTCAGCTTTAGTA-3' (SEQ ID N0:4)。实时定量PCR用Applied Biosystems7300实时PCR系统及SYBRk'绿色实时PCR主混合物(Τ0Υ0Β0)进行。所有PCR试验均为3个平行组，且每组试验均重复至少3次。
[0107]流式细胞术
[0108]病患中得到的PE在IOOOg下离心5min,细胞沉淀用红细胞裂解液重悬,用以除去红细胞，之后用含3.7%PFA的PBS洗2次。流式细胞术分析细胞表面标记的⑶3，⑶4，⑶8和CCR5。样本在流式细胞仪(BD Accuri C6)中处理24h以染色，并用BD CFlow Plus软件分析。
[0109]巨噬细胞感染、激酶抑制剂处理及免疫印迹分析
[0110]用MOI为5的M.bovisBCG刺激腹腔巨噬细胞，随后在冰上用细胞裂解液裂解细胞30min，后在12000g、4°C离心lOmin。收集上清加入SDS上样缓冲液煮沸。相应分子量的蛋白用SDS-PAGE在还原条件下分离并转移到NC膜上。用ECL试剂显色。
[0111]统计分析
[0112]所有的数据均表示为平均值土标准误差。每组偏差通过t值检验分析。当P值小于0.05时表不其在统计学上有显著差异。
[0113]实施例
[0114]实施例1.检测结核病人胸水中MCP-2/CCL8的表达
[0115]为了理解肺结核的发病机理，本发明人进行蛋白质芯片分析来检测结核患者胸水和非结核患者，包括癌症、肺炎、肺动脉高压患者胸水之间40个不同细胞因子的表达(图1A，表 I)。1-309/CCL1、RANTES/CCL5、MCP-2/CCL8、IL-8/CXCL8、MIG/CXCL9、MCP-1/CCL2、IFN- Y和TOGF-BB八个细胞因子浓度在结核患者胸水中显著提高(图1B)。在13个结核患者和12个非结核患者中用ELISA检测这些细胞因子的表达。发现IFN-Y在结核患者胸水中高表达(图1C)。同时，MCP-2/CCL8在结核患者胸水中也高表达(图1D)，而MCP-2/CCL8在结核病人血清中低表达(图1E)。这些结果表明MCP-2/CCL8聚集在结核病人的胸水中。然后，发明人分析MCP-2/CCL8在结核患者胸水和其他病因胸水中的诊断价值。应用受试者工作特征曲线(ROC)，发明人发现结核患者胸水中MCP-2/CCL8的曲线下面积为(AUC)为1，IFN- Y的AUC为0.987。对应的MCP-2/CCL8的截断点为22.78pg/ml, IFN- Y的截断点为14.75pg/ml，结核患者胸水MCP-2/CCL8的敏感性和特异性都是100%。
[0116]因此，MCP-2/CCL8是特异性诊断结核病人胸水的候选标记。
[0117]表1.结核患者和非结核患者胸水中细胞因子丰度的蛋白质阵列分析
【权利要求】
1.MCP-2/CCL8蛋白在制备检测结核性胸水的试剂盒或检测试剂中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂是MCP-2/CCL8蛋白的特异性抗体。
3.MCP-2/CCL8蛋白作为结核性胸水检测标志物的用途。
4.一种结核性胸水检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: a)容器， b)装在所述容器内的MCP-2/CCL8蛋白的检测试剂；和 c)标签或使用说明书，所述标签或使用说明书注明所述试剂盒用于胸水检测或诊断结核病以及利用所述检测试剂检测结核病的使用方法。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述标签或说明书中注明: 如果检测对象的胸水MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，则诊断该对象具有结核病。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括检测胸水中CD3+和/或CD4+T淋巴细胞的含量的试剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述标签或说明书中还注明: 如果检测对象的胸水中CD3+和/或CD4+T淋巴细胞的含量高于其他疾病对照，则诊断该对象具有结核病。
8.如权利要求4-7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂是MCP-2/CCL8蛋白的特异性抗体。
9.一种检测结核病的方法，其特征在于，所述方法包括: 检测待测对象的胸水样品中MCP-2/CCL8蛋白的含量，如果检测的MCP-2/CCL8蛋白含量高于其他疾病对照，则诊断该对象具有结核病。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，如果检测的MCP-2/CCL8蛋白含量高于22.78pg/ml，则诊断该对象具有结核病。
【文档编号】G01N33/68GK103884845SQ201210559258
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】戈宝学, 刘海鹏, 刘忠华 申请人:同济大学附属上海市肺科医院