专利名称：用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板及试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种体外诊断的试剂盒，特别是涉及一种通过酶联免疫法检测血清中细胞因子含量的联合变化用以预测慢性阻塞性肺病的诊断试剂盒。
背景技术：
慢性阻塞性肺病是一种慢性气道炎症，以气道气流受限不完全可逆为特征。其主要临床表现为咳嗽，咳痰以及呼吸困难。随着病程进展，可发展到轻体力活动或静息时亦感到气急。此外尚有乏力、纳差和体重减轻等肺外全身症状。慢性阻塞性肺病目前居全球死亡原因的第4位，据世界卫生组织报道，至2020年慢性阻塞性肺病将位居世界疾病经济负担第5位。在我国，慢性阻塞性肺病同样是严重危害人民身体健康的重要慢性呼吸系统疾病。目前依据国际慢性阻塞性肺病诊断治疗和预防指南(Global strategy for thediagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease，GOLD)诊断指南，慢性阻塞性肺病的诊断和病情分级主要依据肺功能检查。肺功能检查虽然对确定气流受限有重要意义，但是难以及时反映慢性阻塞性肺病的状态和病程，故发展一种能够及时快速检测慢性阻塞性肺病的方法已成为临床实践中的迫切需求。生物标志物作为疾病早期的预测与诊断因子，已开始应用于冠心病、糖尿病、高血压等疾病。随着医疗从传统的被动治疗逐渐向主动预防和诊治的医学观念质变，特别是个体化医学的出现和渐入主流，生物标志物的研究开发也成为近年来临床和制药领域的热点课题。寻找生物标志物主要通过高通量的组学研究，迄今已发现多种基因表达可以作为慢性气道疾病预测指标。然而，目前临床尚没有预测慢性阻塞性肺病的试剂盒来预测该病的进展及生存情况。血清中蛋白质测定用于慢性阻塞性肺病的辅助诊断，已有近十年历史。近年来大量研究表明系统性炎症改变在慢性阻塞性肺病发生及进展中的发挥重要作用。对于类似慢性阻塞性肺病这样具有复杂炎症背景的疾病而言，单个基因或蛋白难以反映疾病的整体变化。以往研究发现，多个血清蛋白构成的生物标志物组群与慢性阻塞性肺病患者的临床预后密切相关，这提示同步联合测定多个因子则有助于更全面的了解疾病的进展。近年来研究发现的与慢性阻塞性肺病的发生发展相关的蛋白标志物包括Wnt抑制因子 I (Wnt inhibitory factor-1, WIF-1)、肿瘤坏死因子 β (tumor necrosisfactor-β , TNF-β )、巨卩遼细胞炎性蛋白 3a (macrophage inflammatory protein 3α，MIP-3 α )、肿瘤坏死因子超家族成员 10 (tumor necrosis factor super family 10,TNFSF10)、血管内皮生长因子 D(vascular endothelial growth factor D, VEGF D)、嗜伊红粒细胞趋化蛋白3/趋化因子配体26(Eotaxin 3/CCL26)、糖皮质激素诱导的TNF受体家方矣相关蛋白 18 (glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptorfamily-related protein 18, GITR-18)。利用蛋白芯片检测发现,并以正常人血清中这7种因子的水平作为衡量标准，在慢性阻塞性肺病患者血清中这7种细胞因子含量会急剧变化，与正常人相比存在统计学差异(P < 0. 05)。因此选用这7种细胞因子作为慢性阻塞性肺病早期诊断具有重要临床意义。而对这7种COPD相关的生物标志物进行并行检测，利用其联合变化对CCffD进行预测，可灵敏、特异、方便的用于CCffD的早期诊断，将为医护人员和病人带来极大便利，也将拥有更为广阔的应用市场。
发明内容本实用新型的目的是提供一种结构简单、操作方便的用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板及试剂盒。为了达到上述目的，本实用新型提供了一种用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板，其特征在于，包括固相载体，所述的固相载体上设有fct抑制因子I的单克隆抗体孔、肿瘤坏死因子β的单克隆抗体孔、巨噬细胞炎性蛋白3 α的单克隆抗体孔、肿瘤坏死因子超家族成员10的单克隆抗体孔、血管内皮生长因子D受体的单克隆抗体孔、嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的单克隆抗体孔、糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的单克隆抗体 孔和空白对照孔。优选地,所述的固相载体为聚苯乙烯酶标板。本实用新型还提供了一种用于预测慢性阻塞性肺病的试剂盒，其特征在于，包括外盒,外盒内设有盒内支架,盒内支架上具有主凹槽,主凹槽内设有上述的用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板。优选地，所述的盒内支架上位于主凹槽周围的位置处还设有副凹槽，所述的副凹槽内设有13个固定孔，生物素标记的抗Wnt抑制因子I的多克隆抗体管、生物素标记的抗肿瘤坏死因子β的多克隆抗体管、生物素标记的抗巨噬细胞炎性蛋白的多克隆抗体管、生物素标记的抗肿瘤坏死因子超家族成员10的多克隆抗体管、生物素标记的抗血管内皮生长因子D的多克隆抗体管、生物素标记的抗嗜伊红粒细胞趋化蛋白3/趋化因子配体26的多克隆抗体管、生物素标记的抗糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的多克隆抗体管、HRP标记的链霉素亲和素管、阳性血清管、显色剂管、终止液管、浓缩洗涤液管和样品稀释液管各设于一个固定孔中。更优选地，所述的生物素标记的抗Wnt抑制因子I的多克隆抗体管、生物素标记的抗肿瘤坏死因子β的多克隆抗体管、生物素标记的抗巨噬细胞炎性蛋白的多克隆抗体管、生物素标记的抗肿瘤坏死因子超家族成员10的多克隆抗体管、生物素标记的抗血管内皮生长因子D的多克隆抗体管、生物素标记的抗嗜伊红粒细胞趋化蛋白3/趋化因子配体26的多克隆抗体管和生物素标记的抗糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的多克隆抗体管位于用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的后侧，终止液管、浓缩洗涤液管和样品稀释液管位于用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的左侧，HRP标记的链霉素亲和素管、阳性血清管和显色剂管位于用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的右侧。本实用新型的优点是I、本实用新型将7种抗体整合到一个酶联免疫检测板上，放置在一个试剂盒内，利用酶联免疫反应对这7种COPD相关的生物标志物进行并行检测，利用其联合变化对COPD进行预测，操作简单，节省人力和时间，提高了工作效率；本实用新型既适用于酶联接免疫吸附剂测定，也可改为蛋白质芯片技术。[0014]2、酶联免疫检测板放置在主凹槽中，便于运输和保存，并且防止酶联免疫检测板上的单克隆抗体被污染。3、酶联免疫反应所用到的其它试剂管放置在副凹槽中，使用起来更便利，进一步完善了本实用新型试剂盒在慢性阻塞性肺病的快速预测功能。4、副凹槽中设有固定孔,各试剂管设于固定孔中,可使其固定牢固；5、副凹槽的试剂管放置合理，使用方便。
图I为用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的剖面示意图。图2为用于预测慢性阻塞性肺病的试剂盒的俯面示意图。
具体实施方式
下面结合实施例来具体说明本实用新型。实施例I如图I所示，为用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的剖面示意图，所述的用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板包括固相载体1，所述的固相载体I上设有空白对照孔26，Wnt抑制因子I的单克隆抗体孔2、肿瘤坏死因子β的单克隆抗体孔3、巨噬细胞炎性蛋白3α的单克隆抗体孔4、肿瘤坏死因子超家族成员10的单克隆抗体孔5、血管内皮生长因子D受体的单克隆抗体孔6、嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的单克隆抗体孔7和糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的单克隆抗体孔8。所述的固相载体I为96孔聚苯乙烯酶标板。如图2所示，为用于预测慢性阻塞性肺病的试剂盒的俯面示意图，所述的用于预测慢性阻塞性肺病的试剂盒，包括外盒9，外盒9内设有盒内支架10，盒内支架10上具有主凹槽11，主凹槽11内设有上述的用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板。所述的盒内支架10上位于主凹槽11周围的位置处还设有副凹槽12，所述的副凹槽12内设有13个固定孔，生物素标记的抗fct抑制因子I的多克隆抗体管13、生物素标记的抗肿瘤坏死因子β的多克隆抗体管14、生物素标记的抗巨噬细胞炎性蛋白的多克隆抗体管15、生物素标记的抗肿瘤坏死因子超家族成员10的多克隆抗体管16、生物素标记的抗血管内皮生长因子D的多克隆抗体管17、生物素标记的抗嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的多克隆抗体管18、生物素标记的抗糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的多克隆抗体管19、HRP标记的链霉素亲和素管20、阳性血清管21、显色剂管22、终止液管23、浓缩洗涤液管24和样品稀释液管25各设于一个固定孔中。所述的生物素标记的抗Wnt抑制因子I的多克隆抗体管13、生物素标记的抗肿瘤坏死因子β的多克隆抗体管14、生物素标记的抗巨噬细胞炎性蛋白的多克隆抗体管15、生物素标记的抗肿瘤坏死因子超家族成员10的多克隆抗体管16、生物素标记的抗血管内皮生长因子D的多克隆抗体管17、生物素标记的抗嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的多克隆抗体管18和生物素标记的抗糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的多克隆抗体管19位于用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的后侧，终止液管23、浓缩洗涤液管24和样品稀释液管25位于用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的左侧，HRP标记的链霉素亲和素管20、阳性血清管21和显色剂管22位于用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的右侧。本实用新型试剂盒所用的酶联免疫检测板以及7种细胞因子的多克隆抗体可采用常规方法制备，具体如下(I)制备抗原分别将克隆的fct抑制因子I基因、克隆的肿瘤坏死因子β基因、克隆的巨噬细胞炎性蛋白3 α基因、克隆的肿瘤坏死因子超家族成员10基因、克隆的血管内皮生长因子D受体基因、克隆的嗜伊红粒细胞趋化蛋白3基因、克隆的糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18基因在大肠杆菌中表达， 得到蛋白后经纯化作为抗原；(2)制备抗体分别将步骤(I)中所得的7种抗原免疫兔，即抗原于家兔皮下多点注射，3周后，再次进行多点皮下注射，以后间隔7天用抗原加强一次，2次后采取颈动脉放血收集家兔血液，离心分离得到血清，即得到7种特异性的多克隆抗体；复苏分泌上述7种细胞因子单克隆抗体的杂交瘤细胞并注入小鼠腹腔，收集腹水，离心，留取上清液，，即得到7种细胞因子的单克隆抗体；(3)纯化抗体步骤(2)中所得的7种细胞因子的单克隆抗体和7种细胞因子的多克隆抗体分别经过离心、沉淀、亲和层析，得到纯化抗体；(4)标记抗体用生物素分别标记步骤⑶中所得到的纯化多克隆抗体；(5)试剂盒制备用步骤(3)中所得的纯化单克隆抗体包被固相载体，得到用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板。检测时，按照常规的酶联免疫检测方法进行检测，将待检测血清样品、正常对照品(正常人血清)、阳性血清(慢性阻塞性肺病患者血清)用样品稀释液稀释后，分别与固定在固相载体I的fct抑制因子I的单克隆抗体孔2、肿瘤坏死因子β的单克隆抗体孔3、巨噬细胞炎性蛋白3α的单克隆抗体孔4、肿瘤坏死因子超家族成员10的单克隆抗体孔5、血管内皮生长因子D受体的单克隆抗体孔6、嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的单克隆抗体孔7和糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的单克隆抗体孔8中的Wnt抑制因子I的单克隆抗体、肿瘤坏死因子β的单克隆抗体、巨噬细胞炎性蛋白3 α的单克隆抗体、肿瘤坏死因子超家族成员10的单克隆抗体、血管内皮生长因子D受体的单克隆抗体、嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的单克隆抗体和糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的单克隆抗体接触和保温。将生物素标记的多克隆抗体与结合于单克隆抗体上的检测样本接触和保温。最后用HRP标记的链霉素亲和素特异性的捕捉结合于检测抗体上的生物素，并用显色剂显色，用终止液终止反应，在ELISA检测仪上，测定各孔的OD值，从而测定结合于捕捉抗体上的细胞因子水平。具体的检测步骤如下I.加样将待检测血清样品、正常对照品(正常人血清)、阳性血清(慢性阻塞性肺病患者血清)用样品稀释液稀释3倍后，分别加入酶联免疫检测板的各反应孔中，每个反应孔加样O. 1ml，每种样品做3个平行实验，置37°C孵育I小时，弃去孔内溶液。蒸馏水稀释浓缩洗涤液10倍后，每孔加入O. 4ml，洗3次，每次I分钟。(简称洗涤，下同)。样品稀释液为O. I克牛血清白蛋白加到100ml pH7. 4磷酸盐缓冲液中得到，其中，pH7. 4磷酸盐缓冲液为将O. 2克磷酸二氢钾、2. 9克十二水合磷酸氢二钠、8. O克氯化钠、O. 2克氯化钾和
O.5ml吐温-20加到IOOOml蒸馏水中得到。浓缩洗涤液为将O. 2克磷酸二氢钾、2. 9克十二水合磷酸氢二钠、8. O克氯化钠、O. 2克氯化钾和O. 5ml吐温-20加到IOOml蒸馏水中得到。[0033]2.加生物素标记的多克隆抗体于各反应孔中，相应加入用样品稀释液新鲜稀释的10μ g/ml浓度的各生物素标记的多克隆抗体O. 1ml，于37°C孵育I小时，洗涤。3.加HRP标记的链霉素亲和素于各反应孔中加入HRP标记的链霉素亲和素
O.1ml，室温保持20分钟。4.加显色液于各反应孔中加入显色液O. lml，室温保持20分钟。所述显色液为将0.5ml 10mg/5ml的四甲基联苯胺的无水乙醇溶液、IOml ρΗ5·0底物缓冲液与32 μ 10. 75vol%过氧化氢水溶液混合得到，其中，ρΗ5. O底物缓冲液为含有O. 2Μ磷酸氢二钠和O. IM柠檬酸的蒸馏水溶液。5.终止反应于各反应孔中加入终止液O. 05ml，在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。终止液为将56ml纯硫酸缓慢加到IOOOml蒸馏水中得 至IJ。以正常对照品的蛋白表达水平作为衡量标准，阳性血清的蛋白表达量除以此标准，从而确定慢性阻塞性肺病病人细胞因子相对于正常人的表达比例。将待检测血清样品的蛋白表达量(0D值)除以正常对照品的蛋白表达量(0D值)，其中大于或等于2.4为增髙，小于2.4为降低。当7种细胞因子均增高时，提示存在慢性阻塞性肺病。实施例2收集6例正常人血清和6例慢性阻塞性肺病患者血清作为正常组和慢性阻塞性肺病组，采用实施例I中的试剂盒，按照实施例I中的检测步骤进行检测，7种细胞因子的联合表达改变如表I所示。表I :7种细胞因子在慢性阻塞性肺病患者及正常人血清中的表达变化表
权利要求1.一种用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板，其特征在于，包括固相载体(1)，所述的固相载体(I)上设有fct抑制因子I的单克隆抗体孔(2)、肿瘤坏死因子β的单克隆抗体孔(3)、巨噬细胞炎性蛋白3 α的单克隆抗体孔(4)、肿瘤坏死因子超家族成员10的单克隆抗体孔(5)、血管内皮生长因子D受体的单克隆抗体孔(6)、嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的单克隆抗体孔(7)、糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的单克隆抗体孔(8)和空白对照孔(26)。
2.如权利要求I所述的用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板，其特征在于，所述的固相载体(I)为聚苯乙烯酶标板。
3.一种用于预测慢性阻塞性肺病的试剂盒，其特征在于，包括外盒(9)，外盒(9)内设有盒内支架(10)，盒内支架(10)上具有主凹槽(11)，主凹槽(11)内设有权利要求I所述的用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板。
4.如权利要求3所述的用于预测慢性阻塞性肺病的试剂盒，其特征在于，所述的盒内支架(10)上位于主凹槽(11)周围的位置处还设有副凹槽(12)，所述的副凹槽(12)内设有13个固定孔，生物素标记的抗Wnt抑制因子I的多克隆抗体管(13)、生物素标记的抗肿瘤坏死因子β的多克隆抗体管(14)、生物素标记的抗巨噬细胞炎性蛋白的多克隆抗体管(15)、生物素标记的抗肿瘤坏死因子超家族成员10的多克隆抗体管(16)、生物素标记的抗血管内皮生长因子D的多克隆抗体管(17)、生物素标记的抗嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的多克隆抗体管(18)、生物素标记的抗糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的多克隆抗体管(19)、HRP标记的链霉素亲和素管(20)、阳性血清管(21)、显色剂管(22)、终止液管(23)、浓缩洗涤液管(24)和样品稀释液管(25)各设于一个固定孔中。
5.如权利要求4所述的用于预测慢性阻塞性肺病的试剂盒，其特征在于，所述的生物素标记的抗Wnt抑制因子I的多克隆抗体管(13)、生物素标记的抗肿瘤坏死因子β的多克隆抗体管(14)、生物素标记的抗巨噬细胞炎性蛋白的多克隆抗体管(15)、生物素标记的抗肿瘤坏死因子超家族成员10的多克隆抗体管(16)、生物素标记的抗血管内皮生长因子D的多克隆抗体管(17)、生物素标记的抗嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的多克隆抗体管(18)和生物素标记的抗糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的多克隆抗体管(19)位于用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的后侧，终止液管(23)、浓缩洗涤液管(24)和样品稀释液管(25)位于用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的左侧，HRP标记的链霉素亲和素管(20)、阳性血清管(21)和显色剂管(22)位于用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板的右侧。
专利摘要本实用新型提供了一种用于预测慢性阻塞性肺病的酶联免疫检测板及试剂盒。所述的酶联免疫检测板，包括固相载体，所述的固相载体上设有Wnt抑制因子1的单克隆抗体孔、肿瘤坏死因子β的单克隆抗体孔、巨噬细胞炎性蛋白3α的单克隆抗体孔、肿瘤坏死因子超家族成员10的单克隆抗体孔、血管内皮生长因子D受体的单克隆抗体孔、嗜伊红粒细胞趋化蛋白3的单克隆抗体孔、糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白18的单克隆抗体孔和空白对照孔。本实用新型利用酶联免疫反应对这7种COPD相关的生物标志物进行并行检测，利用其联合变化对COPD进行预测，操作简单，节省人力和时间，提高了工作效率。
文档编号G01N33/544GK202614768SQ201220251768
公开日2012年12月19日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者白春学, 王向东, 王耀丽, 蒋进军, 宋振举, 李卡 申请人:复旦大学附属中山医院