防止细胞转化和癌症转移的组合物和方法

防止细胞转化和癌症转移的组合物和方法
【专利摘要】本申请提供了用于表征微泡或其他膜结构的方法。所述方法包括检测样品中的微泡或其他膜结构，并且在某些方面包括确定存在或不存在组织谷氨酰胺转移酶（tTG）和/或交联纤连蛋白（FN）。可以使用重组tTG或其衍生物，或者tTG或FN结合配体从样品中分离所述微泡或其他膜结构。本申请还提供了抑制物质从含有tTG的微泡转移至一个或多个细胞的方法。所述方法包括给予个体tTG抑制剂，如具有细胞不透性的tTG抑制剂。本申请还提供了组合物，所述组合物含有微泡或其他膜结构群，其中所述群附着于tTG或其衍生物，或者附着于tTG或FN的结合配体之上。本申请还提供了用于实施所述方法的试剂盒，所述试剂盒包括试剂和其他组分。
【专利说明】防止细胞转化和癌症转移的组合物和方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2011年2月17日提交的申请号为61/443，978的美国临时专利申请的优先权，其公开的内容通过引用并入本文。
发明领域
[0002]本发明一般地涉及癌症的诊断和治疗，更具体地涉及基于从癌细胞上脱落的微泡的新型癌症标记物和疗法。
发明背景
[0003]肿瘤进展涉及癌细胞在其微环境中彼此间以及与邻近的正常细胞之间相互沟通的能力。来源于人体癌细胞的微泡(MV)已受到关注，因为其明显能够参与信号蛋白在癌细胞之间的水平转移，并且促进癌细胞的侵袭活性。不同类型的高级或侵袭形式的人癌细胞释放MV至其周围环境，这已越来越多的被认为是一种肿瘤生物学的特征。然而，对这些结构是如何产生的及其在癌症进展中的重要性目前仍知之甚少。因此，探索MV在癌症中迄今为止尚未被确认的作用，并利用这些作用开发涉及诊断方法和治疗干涉的组合物和方法具有持续和尚未满足的需求。本发明满足了这些需求。
发明简述
[0004]本发明部分地基于我们的发现，即在微泡(MV)介导的正常细胞转化中，从癌细胞脱落的(MV)必需包含组织谷氨酰胺转移酶(tTG)。在这方面，我们发现从多种类型的人癌细胞上脱落的MV都能够赋予正常细胞(以成纤维细胞和上皮细胞为代表的非癌细胞)转化的表型，通过类似存活能力的增强和锚定非依赖性生长，能够证明这种转化表型。我们还发现tTG本身不足以转化正常细胞。相反，tTG必需和一种与其相结合和交联的蛋白(纤连蛋白(FN)) —起参与到正常细胞的转化过程中。因而，本发明的一个方面是鉴定具有诱导细胞转化能力的MV，所述转化依赖于tTG的存在。在另一个方面，本发明提供了通过调节与微泡相结合的tTG的作用来抑制诱导正常细胞转化的方法。
[0005]在一个实施方式中，本发明提供了 一种表征微泡的方法。所述方法包括获取含有微泡的样品和检测微泡中的tTG。基于对MV的检测确定MV是否含有tTG和/或交联的FN，如果在样品中存在与微泡相结合的tTG则将所述MV鉴定为tTG阳性，相反，如果在样品中不存在与微泡相结合的tTG则将所述微泡鉴定为tTG阴性。在另一个实施方式中，所述方法包括检测tTG阳性微泡的存在情况。所述方法包括获取样品和对所述样品进行分析以检测与tTG结合的微泡的存在情况。在另一个实施方式中，所述方法包括获取含有微泡的样品，并对所述微泡进行检测以确定其是否包含交联的FN。如果样品中存在与微泡相结合的交联FN则将所述MV鉴定为交联FN阳性，相反如果样品中不存在与微泡相结合的交联FN则将所述微泡鉴定为交联FN阴性。
[0006]所述方法适于分析含有MV的任意样品。在一个实施方式中，所述样品包括来自诊断为患有癌症、疑似患有癌症、或存在癌症风险的个体的液体生物样品。在一个实施方式中，所述样品来自正在接受癌症治疗的个体。[0007]本发明的一个方面包括将个体诊断为具有循环微泡的方法，所述循环微泡为tTG和/或交联的FN阳性或者tTG和/或交联的FN阴性。所述方法包括检测来自个体的样品中的与微泡相结合的tTG和/或交联的FN，如果分别存在tTG和/或交联的FN，则将所述个体鉴定为具有与tTG和/或交联的FN相结合的循环微泡，如果均不存在与微泡相结合的tTG和/或交联的FN，则将所述个体鉴定为不具有与tTG和/或交联的FN相结合的循环微泡。
[0008]在不同实施方式中，检测所述微泡包括采用任意适合的技术从液体生物样品中分离微泡。在一个实施方式中，分离所述MV包括使用结合配体捕获。可以使用能够选择性结合tTG或FN，或者选择性结合包括tTG和FN的复合物的任意试剂。在某些实施方式中，所述结合配体选自FN、抗-FN抗体或其抗体结合片段或衍生物、重组tTG和经修饰的tTG、tTG或经修饰的tTG的片段、抗-tTG抗体或其抗体结合片段或衍生物、以及上述试剂的组合。可以使用任意适合的技术和试剂检测是否存在tTG。在不同实施方式中，可以使用上述结合配体中的一种或组合进行检测，其中所述结合配体已被检测标记和/或附着于基质上。
[0009]在另一个方面，本发明包括从样品中分离膜结构的方法。该实施方式包括提供可能含有所述膜结构的样品并将所述样品与tTG或其衍生物混合，如果样品中存在所述膜结构，则允许其形成膜结构与tTG或其衍生物的复合物。如果存在所述膜结构，将所述tTG和膜结构的复合物与样品的其余部分分离。
[0010]本发明的另一个方面包括抑制物质从含有tTG的微泡转移至个体中的一个或多个细胞的方法。所述方法包括给予所述个体tTG抑制剂。所述tTG抑制剂可以是具有细胞不透性的tTG抑制剂，如生物试剂，包括但不限于抗体，或者其可以是药学试剂，如小分子tTG抑制剂。
[0011]本发明还提供了一种包括分离的微泡群的组合物，其中所述微泡包含tTG，其中所述分离的微泡群附着于tTG或FN结合配体。
[0012]本发明还提供了用于检测tTG阳性微泡的试剂盒。
附图的简要说明
[0013]图1.利用扫描电子显微镜SEM (左图)和使用与罗丹明偶联的鬼笔环肽的免疫荧光显微镜检测F-肌动蛋白(右图)来对MDAMB231细胞进行分析。一些最大的MV如箭头所
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[0014]图2.对在血清饥饿或EGF刺激条件下培养的多种细胞系中产生的MV进行定量。通过使用与罗丹明偶联的鬼笔环肽标记所述样品对产生MV的细胞进行检测。数据以平均值土 s.d.表示，其来自三次独立实验。
[0015]图3.图2所示实验中细胞的图像。一些MV如箭头所示。
[0016]图4.用实时成像的荧光显微镜观察MDAMB231细胞，所述MDAMB231细胞瞬时表达来自Lyn酪氨酸激酶(GFP-PM)的质膜靶序列的GFP标记形式。其显示了以2分钟间隔拍摄的转染子的一系列延时图像。箭头表示形成并从细胞中脱落的W。
[0017]图5.将模拟转染或使用pEGFP (编码GFP的质粒)转染的去血清的MDAMB231细胞裂解，并将通过转染子脱落至培养基中的MV分离和裂解。然后使用针对GFP、MV-标记物脂筏标记蛋白_2 (flotillin-2)、和细胞质特异性标记物ΙκΒα的抗体对全细胞裂解物(WCL)和MV裂解物进行的免疫印迹法分析。[0018]图6.使用针对MV-标记物肌动蛋白和脂筏标记蛋白-2、细胞质特异性标记物I K B α、和活化的(磷酸基)-EGF-受体的抗体对血清饥饿的MDAMB231和U87细胞的全细胞裂解物(WCL)以及这些细胞脱落的MV的裂解物进行免疫印迹法分析。
[0019]图7.如图所示将多组去血清的ΝΙΗ3Τ3成纤维细胞与无血清培养基、含2%小牛血清(CS)的培养基、或补充了来源于MDAMB231或U87细胞的完整MV的培养基共同培养。暴露于不同培养条件下指定时长后，将一组细胞裂解，并使用识别活化的和总AKT和ERK的抗体进行免疫印迹法分析。
[0020]图8.如图所示将多组去血清的ΝΙΗ3Τ3成纤维细胞与无血清培养基、含2%小牛血清(CS)的培养基、或补充了来源于MDAMB231或U87细胞的完整MV的培养基共同培养。对另外两组成纤维细胞评估其经受去血清引发的细胞死亡的能力。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0021]图9.如图所示将多组去血清的NIH3T3成纤维细胞与无血清培养基、含2%小牛血清(CS)的培养基、或补充了来源于MDAMB231或U87细胞的完整MV的培养基共同培养。对另外两组成纤维细胞评估其在低血清下(2%CS)的生长能力。对于生长检测，每日补充一次培养基(包括MV)。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0022]图10.对不与或与来源于MDAMB231或U87细胞的MV共同培养的NIH3T3成纤维细胞进行锚定非依赖性的生长检测。每三天重新加入一次软琼脂培养基(包括加入新鲜制备的MV)。将表达Cdc42F28L的NIH3T3细胞作为这些实验的阳性对照。数据以平均值土 s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0023]图11.图10中形成的集落的图像。
[0024]图12.对血清饥饿的MDAMB231和U87细胞的全细胞裂解物(WCL)以及从这些细胞脱落的MV的裂解物，使用若干抗体包括一个针对tTG的抗体，进行免疫印迹法分析。
[0025]图13.上图——使用tTG抗体进行免疫染色的MDAMB231细胞。框内的区域被放大，并使用箭头表示某些MV。下图——仅使用二抗共染色的MDAMB231细胞(左图)和使用标记MV的偶联罗丹明的鬼笔环肽(右图)共染色的MDAMB231细胞。
[0026]图14。图示为对血清饥饿的U87神经胶质瘤细胞和HeLa宫颈癌细胞不进行处理或使用EGF对其刺激15分钟，然后再用tTG抗体免疫染色的图像。如箭头所示是明显的MV。
[0027]图15.对异位表达仅GFP或GFP_tTG的MDAMB231细胞的全细胞裂解物(WCL)和从这些转染子脱落至其培养基中的MV的裂解物，使用针对GFP、MV-标记物脂筏标记蛋白-2、和细胞质特异性标记物I K B α的抗体进行的免疫印迹法分析。
[0028]图16.使用针对tTG和细胞内蛋白Rheb、以及标记核的DAPI的抗体染色的MDAMB231细胞的透性化和非透性化样品的荧光图像。
[0029]图17.根据BPA掺入酪蛋白的读数，检测血清饥饿MDAMB231细胞的全细胞裂解物(WCL)和这些细胞产生的完整MV的转酰胺基作用活性，这些细胞不使用或使用tTG抑制剂TlOl (细胞不透性)或MDC (细胞透性)处理。然后使用针对tTG、脂筏标记蛋白-2、和I K B α的抗体对样品进行免疫印迹法分析。
[0030]图18.来源于MDAMB231细胞的MV具有诱导细胞转化的能力，此能力依赖于将tTG从MV转移至受体细胞。使用tTG和肌动蛋白抗体对血清饥饿NIH3T3成纤维细胞的提取物进行免疫印迹法分析，所述血清饥饿NIH3T3成纤维细胞与无血清培养基或添加了来源于MDAMB231细胞的MV的无血清培养基培养，所述来源于MDAMB231细胞的MV不使用或使用tTG抑制剂TlOl预处理30分钟培养。
[0031]图19.来源于MDAMB231细胞的MV具有诱导细胞转化的能力，此能力依赖于将tTG从MV转移至受体细胞。根据BPA掺入裂解蛋白的读数，检测血清饥饿NIH3T3成纤维细胞的提取物的转酰胺基作用活性，所述血清饥饿NIH3T3成纤维细胞与无血清培养基或添加了来源于MDAMB231细胞的MV的无血清培养基培养，所述来源于MDAMB231细胞的MV不使用或使用tTG抑制剂TlOl预处理30分钟。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0032]图20.对在无血清培养基、2%CS_培养基、或含来源于MDAMB231细胞的MV的无血清培养基中培养的成纤维细胞进行的细胞死亡检测。如图所示，对各培养基进一步添加或不添加tTG抑制剂TlOl (细胞不透性)或MDC (细胞透性)。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0033]图21.成纤维细胞的锚定非依赖性生长检测，所述成纤维细胞培养在来源于MDAMB231细胞的MV中，所述MV经过(或不经过)T101，或RGD肽(或对照RGE-肽)处理。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0034]图22.稳定表达Myc-tTG或空载体的NIH3T3裂解物的免疫印迹法分析，该分析使用Myc和肌动蛋白抗体。并且根据BPA掺入裂解蛋白的读数，检测转酰胺基作用的活性。
[0035]图23.对保存在无血清培养基中的NIH3T3稳定细胞系进行细胞死亡检测，所述无血清培养基经过(或未经过)T101、MDC、或2%CS-培养基处理。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0036]图24.NIH3T3稳定细胞系的锚定非依赖性生长检测。作为阳性对照，将载体对照成纤维细胞与来源于MDAMB231细胞的MV培养。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0037]图25.将 5X105 个表达对照 siRNA (siCont)或 tTG siRNA (表示为 siTG-Ι 或siTG-2)的有丝分裂阻滞的(使用丝裂霉素-C) MDAMB231细胞(表示为Mito_C_MDAMB231)单独或与5X105个NIH3T3成纤维细胞联合通过皮下注射至裸鼠体内来进行肿瘤形成试验。将未经处理的MDAMB231和NIH3T3细胞注射至裸鼠体内作为对照。不同条件下形成的肿瘤计数，其结果列于表中。
[0038]图26.MDAMB231的全细胞裂解物(WCL)和从这些细胞脱落的MV的裂解物的免疫沉淀(使用tTG抗体)。免疫沉淀后样品(输入道为未经免疫沉淀处理)使用FN、tTG、和肌动蛋白抗体进行免疫印迹法分析。值得注意的是，在MV道检测到了交联的FN (FN 二聚体)。
[0039]图27.从MDAMB231或U87细胞收集的完整的MV，在裂解前使用(或不使用)TlOl进行处理。然后使用FN和tTG抗体对MV提取物进行免疫印迹分析。值得注意的是，经TlOl处理显著降低在MV样品中检测到的交联形式的FN (FN 二聚体)。
[0040]图28.使用针对FAK或ERK的抗体或者特异性识别这些蛋白激酶活化形式的抗体对成纤维细胞裂解物进行免疫印迹法分析，所述成纤维细胞与或者不与来源于MDAMB231和U87细胞的MV共同培养，所述来源于MDAMB231和U87细胞的MV使用或不使用TlOl预处理。[0041]图29。MV是如何转化受体细胞的图示。人癌细胞产生含有tTG和纤连蛋白的MV并从细胞表面释放。释放后的MV可以通过被邻近的正常细胞摄取或直接改变邻近正常细胞的微环境，通过tTG和FN的共转移协同作用诱导受体细胞产生促进细胞存活和异常细胞生长的信号活动。
[0042]图30.MDAMB231乳腺癌细胞组成性的释放MV至培养基。将使用编码GFP的质粒(pEGFP)转染的或模拟转染的MDAMB231细胞在无血清培养基中培养一天。收集来自转染子的条件培养基，分离培养基中存在的完整MV，并用荧光活化细胞分类计(FACS)进行分析(细胞栅设定为GFP阳性，并且细胞直径为I 一 3微米)。该结果为对从模拟转染MDAMB231细胞中分离得到的MV进行分析得到的结果。
[0043]图31.MDAMB231乳腺癌细胞组成性的释放MV至培养基。将使用编码GFP的质粒(pEGFP)转染的或模拟转染的MDAMB231细胞在无血清培养基中培养一天。收集来自转染子的条件培养基，分离培养基中存在的完整MV，并用荧光活化细胞分类计(FACS)进行分析(细胞栅设定为GFP阳性，并且细胞直径为I 一 3微米)。该结果为对从瞬时表达GFP的MDAMB231细胞中分离得到的MV进行分析得到的结果。
[0044]图32.来源于MDAMB231细胞的MV转化MCFlOA乳房上皮细胞。对在无血清培养基、含2%胎牛血清(FBS)的培养基、或添加了来源于5.0XlO6个MDAMB231细胞的完整MV的无血清培养基中培养3天的MCFlOA细胞进行细胞死亡检测。数据以平均值土s.d.表示，其来自三次独立实验。
[0045]图33.来源于MDAMB231细胞的MV转化MCFlOA乳房上皮细胞。对与MV培养的MCFlOA细胞进行锚定非依赖性生长检测，所述MV来源于5.0XlO6个MDAMB231细胞，且不使用或使用tTG抑制剂TlOl处理。连续12天每三天补充一次用于软琼脂检测的培养基(包括MV、T101、和AG1478)，并同时计数所形成的集落。数据以平均值土s.d.表示，其来自三次独立实验。
[0046]图34.来源于MDAMB231细胞的MV转化MCFlOA乳房上皮细胞。对与来源于U87细胞的MV培养的NIH3T3成纤维细胞进行锚定非依赖性生长检测，所述来源于U87细胞的MV不使用或使用FGE受体抑制剂AG1478处理。连续12天每三天补充一次用于软琼脂检测的培养基(包括MV、T101、和AG1478)，并同时计数所形成的集落。数据以平均值土s.d.表示，其来自三次独立实验。
[0047]图35.将来源于MDAMB231细胞的完整MV分离、固定、使用tTG抗体免疫染色，然后进行SEM检测。所显示的是MV的典型的SEM图像。值得注意的是，在MV的表面上检测到了 tTG。
[0048]图36.将固定浓度的纯化重组tTG (I μ Μ)与浓度渐增的tTG抑制剂TlOl共同培养后对其转酰胺基作用活性进行检测。测得TlOl的IC50 (虚线)为?1.5 μ M。该实验又另外重复了两次，均得到了类似结果。
[0049]图37.根据BPA掺入裂解蛋白的读数，对MDAMB231细胞的细胞提取物进行转酰胺基活性作用的检测，所述MDAMB231细胞在未添加或添加200 μ M TlOl (此浓度比在B中该抑制剂计算得到的IC50高133倍)的培养基中培养?10小时，随后充分洗涤并裂解(细胞培养物)。在进行转酰胺基活性作用检测前，制备等量的未经处理的或使用IOyM TlOl培养15分钟的MDAMB231细胞提取物(细胞提取物)。数据以平均值土s.d.表示，其来自三次独立实验。
[0050]图38.使用tTG抗体对使用或不使用T101、MDC、BFA、或Exol处理的血清饥饿的MDAMB231细胞进行免疫染色。所显示的是接触不同抑制剂的细胞的典型图像。形成MV的细胞如箭头所示。
[0051]图39.使用或不使用tTG抑制剂TlOl和MDC处理的(左图)、使用对照siRNA(siCont)或两种不同的tTG siRNA (siTG_l和siTG_2)转染的(中图)、或者不使用或使用经典分泌抑制剂BFA和Exol处理(右图)的血清饥饿的MDAMB231的细胞裂解物(WCL)，同时收集和裂解由细胞释放至所述培养基中的MV。使用针对tTG、MV-标记物脂筏标记蛋白-2、和细胞质特异性标记物I K B α的抗体对提取物进行的免疫印迹法分析。
[0052]图40.使用针对Myc-标签、脂筏标记蛋白_2、和I κ B α的抗体对仅仅异位表达载体的MDAMB231细胞的全细胞裂解物或具有Myc标签的野生型tTG (TG WT)、转酰胺基作用缺陷型tTG (TG C277V)、GTP结合缺陷型tTG (TG R580L)的全细胞裂解物(WCL)以及从这些转染子脱落的MV的裂解物进行的免疫印迹法分析。
[0053]图41.使用tTG和肌动蛋白抗体对成纤维细胞与来源于U87细胞的MV培养30分钟后的裂解物进行免疫印迹法分析，所述来源于U87细胞的MV不使用或使用细胞不透性tTG抑制剂TlOl预处理。
[0054]图42.使用tTG抗体和与罗丹明偶联的鬼笔环肽对NIH3T3细胞进行免疫染色以检测肌动蛋白，所述NIH3T3细胞使用未添加或添加了由MDAMB231或U87细胞产生的完整MV的无血清培养基培养30分钟。所显示的是成纤维细胞的典型荧光图像。值得注意的是，仅在与来源于癌细胞的MV培养的成纤维细胞中检测到了 tTG。
[0055]图43.根据BPA掺入裂解蛋白的读数，对与来源于U87细胞的MV培养30分钟的成纤维细胞的裂解物的转酰胺基作用活性进行检测，所述来源于U87细胞的MV不使用或使用TlOl预处理。
[0056]图44.对在无血清培养基、2%CS_培养基、或含有来自5.0XlO6个U87神经胶质瘤细胞的MV的无血清培养基中保存的成纤维细胞进行细胞死亡检测。对各培养基进一步添加细胞不透性tTG抑制剂TlOl或未对其进行处理。数据以平均值土 s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0057]图45.收集从5.0XlO6个血清饥饿的MDAMB231细胞中脱落的MV并将其重新悬浮于无血清DMEM中，所述血清饥饿的MDAMB231使用对照siRNA (siCont)或两种不同tTGsiRNA (siTG-Ι和siTG-2)转染。将NIH3T3细胞接种于6孔板中，然后加入无血清培养基或含有不同MV制备物的无血清培养基培养?35小时，同时测定不同细胞培养物的细胞死亡率。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0058]图46.收集从5.0XlO6个血清饥饿的MDAMB231细胞中脱落的MV并将其重新悬浮于无血清DMEM中，所述MV使用对照siRNA (siCont)或两种不同tTG siRNA (siTG-Ι和siTG-2)转染。对使用上述不同的MV制备物培养的NIH3T3成纤维细胞进行锚定非依赖性生长检测。连续12天每三天补充一次软琼脂培养基(包括加入新制的MV)，并同时计数所形成的集落。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0059]图47.对对照NIH3T3成纤维细胞或与来源于5.0XlO6个U87神经胶质细胞瘤的MV培养的成纤维细胞进行锚定非依赖性生长检测，所述来源于5.0XlO6个U87神经胶质细胞瘤的MV使用T101、RGD-肽、RGE对照肽处理、或未经处理。数据以平均值土s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0060]图48.对稳定表达激活型Cdc42 (Cdc42F28L)或空载体的NIH3T3细胞进行锚定非依赖性生长检测，所述NIH3T3细胞使用200 μ M TlOl处理或未经处理。值得注意的是，Cdc42F28L诱导集落形成的能力对TlOl不敏感。数据以平均值土 s.d.表示，其来自至少三次独立实验。
[0061]图49.TlOl不干扰tTG与FN在来源于MDAMB231细胞或U87细胞的MV中结合的能力。在裂解前，不使用或使用TlOl对从MDAB231或U87细胞中收集的完整MV进行处理。然后使用tTG抗体将MV提取物免疫沉淀(IP: tTG)。使用FN和tTG抗体对所得到的免疫复合物进行免疫印迹法分析。
[0062]图50.用针对tTG和纤连蛋白的抗体，或者重组tTG可以从癌细胞的条件培养基中分离微泡。制备血清饥饿的MDAMB231乳腺癌细胞(231)和U87脑肿瘤细胞(U87)的细胞裂解物(WCL)，并收集这些细胞的条件培养基。如图所示，使用与蛋白-G小珠结合的tTG或纤连蛋白(FN)抗体对培养基进行免疫沉淀(IP)。并将与镍珠结合的纯化、重组tTG(PPT: Rec.tTG)与所述条件培养基培养。使用所述抗体对使用抗体或tTG重组形式沉淀得到的复合物，以及来自癌细胞的全细胞裂解物(WCL)样品进行免疫印迹分析。在免疫沉淀(IP)和沉淀(PPT)样品道中存在微泡标记物脂筏标记蛋白表明针对tTG和纤连蛋白的抗体以及tTG的重组形式能够捕获从癌细胞脱落至培养基中的微泡。
[0063]图51.重组tTG能够与无任何蛋白成分的液体囊泡结合。采用挤出法制备合成脂质体，然后将该制备物与5yg重组tTG (tTG WT)或5yg牛血清白蛋白(BSA)等量组合。培养15分钟后，离心沉淀脂质体，利用SDS-PAGE分离所得到的上清(Sup)和脂质体(团块)组分。然后使用Quick Blue对凝胶染色以检测蛋白。设置含有重组tTG (Rec.tTG WT)的泳道作为标准。
发明详述
[0064]本发明充分利用了我们的发现，即MV介导的正常细胞的转化，部分依赖于含有tTG的W。特别地，我们证明了从不同类型人癌细胞脱落的MV能够将癌细胞的转化性质赋予正常的成纤维细胞和上皮细胞，如锚定非依赖性生长的能力和增强的存活能力。这一转化性质需要将蛋白交联酶tTG转移至所述细胞。我们进一步证明了 tTG不足以转化正常细胞，还需要另一种蛋白介导所述来源于癌细胞的MV的转化作用。我们发现tTG交联基质纤连蛋白(FN)也参与了非癌细胞的转化。特别地，并且不限于任何特定理论，我们发现在来自癌细胞的MV中发生了 tTG与FN的交联，交联的FN和tTG随后在MV介导下向受体成纤维细胞转移，协同活化有丝分裂信号并且诱导受体细胞转化。关于FN与tTG交联，我们证明了在从癌细胞脱落的微泡中存在交联的FN，但是我们未在相同细胞的全细胞裂解物(WCL)中检测到交联的FN (参见例如图26)。因此，我们认为FN与tTG的交联发生在MV中。这些发现强调了 MV在诱导细胞转化中的新作用。因而，本发明旨在鉴定具有诱导细胞转化能力的MV和提供抑制这种诱导作用的方法。
[0065]与本发现相关，越来越多的证据表明在体内癌细胞能够产生MV。已有发现表明当将若干不同人原发肿瘤细胞或已建立的癌细胞系培养物脱落的MV随后加入至相同癌细胞后，这些细胞的生长和存活显著增强。当在肿瘤背景下考虑这些发现时，可以将癌细胞间共有的MV所产生的增加的增殖能力设想为促进肿瘤生长的机制。然而，本发明发现MV以出乎预料的方式影响癌症进展，特别是通过将转化的癌细胞特性赋予作为肿瘤微环境的主要成分的正常细胞系(即，成纤维细胞和上皮细胞)。这一发现与肿瘤的扩大并不一定仅依赖于癌细胞增殖的观点一致，肿瘤的扩大还依赖于包括暴露于癌细胞脱落的MV中的肿瘤微环境中的基质细胞(包括成纤维细胞)和正常上皮所表现出的异常生长。
[0066]为了使从癌细胞脱落的MV (即，我们作为模型细胞使用的MDAMB231乳腺癌细胞和U87脑瘤细胞)在低血清下促进正常细胞(即，NIH3T3成纤维细胞和MCFlOA乳房上皮细胞)的生长和诱导其产生在软琼脂上形成集落的能力，在生长检测中通常需要使用新制的MV重复处理受体细胞。这表明在加入正常受体细胞后MV中所含的、与促进其转化活性有关的蛋白和RNA转录物，具有有限的存在时间并且需要持续补充。当在肿瘤背景下考虑这一问题时，癌细胞可以向其微环境中长期脱落MV，以此向与之邻近的受体基底和正常上皮持续提供所需的MV以诱导并维持转化的表型。因而，本发明提供了检测MV的方法，所述MV涉及赋予非癌细胞的转化表型的转化和维持，还提供了抑制这些过程的方法。
[0067]在一个实施方式中，本发明提供了 一种表征微泡的方法。所述方法通常包括获取样品和检测所述样品中是否存在与MV结合的tTG。如果样品中存在与微泡相结合的tTG，则将所述微泡鉴定为tTG阳性。如果在样品中未鉴定得到tTG，但存在微泡，则将所述微泡
鉴定为tTG阴性。“与......相结合”指在微泡中存在所述蛋白(即，tTG或FN)，其完全或
部分地包含在所述微泡中，或者完全或部分地在囊泡膜内。然而，在通常情况下，我们认为本申请所述的与MV相结合的tTG至少有一部分是跨MV膜的tTG蛋白，或者有至少一部分是与MV膜的外层相结合或处于MV外侧。
[0068]在其他实施方式中，所述方法包括检测微泡中交联的FN。基于这种检测，如果检测到与所述微泡相结合的交联的FN，则可以将所述MV鉴定为交联的FN阳性。同样地，如果不存在与所述微泡相结合的交联的FN，则将所述微泡鉴定为交联的FN阴性。本领域技术人员容易认识到如何基于如分子量、迁移率分析等因素来区分交联的FN与未交联的(单体)FN。
[0069]在本发明的某些实施方式中，确定MV是tTG阳性能够指示所述MV也是交联的FN阳性。同样地，在某些实施方式中，确定MV是tTG阴性能够指示所述MV也是交联的FN阴性。因此，在某些实施方式中，确定MV是交联的FN阳性能够指示所述MV是tTG阳性，确定MV是交联的FN阴性能够指示所述MV也是tTG阴性。
[0070]本发明的一个相关方面提供了一种方法，所述方法包括检测tTG阳性和/或交联FN阳性的微泡的存在。所述方法包括获取样品和对样品进行分析以检测与tTG和/或交联的FN相结合的微泡的存在。
[0071]在另一个方面，本发明提供了一种将个体诊断为具有tTG阳性和/或交联FN阳性的循环微泡的方法。该实施方式包括检测获取自个体的样品中的与tTG结合和/或与交联的FN结合的微泡，如果在样品中存在tTG则将所述个体鉴定为具有与tTG相结合的循环微泡，如果在样品中存在交联的FN则将所述个体鉴定为具有交联FN阳性的W。如果样品中不存在tTG则所述个体可以被鉴定为不具有与tTG相结合的循环微泡，同样地如果样品中不存在交联的FN则所述个体可以被鉴定为不具有与交联FN相结合的循环微泡。
[0072]如本申请所使用的，术语“微泡”或“MV”指从细胞脱落的囊泡，其中所述囊泡具有的直径范围为0.1至5.0微米，包括其间的所有整数和精确到小数点后一位的数字。能够赋予正常细胞转化表型的微泡在本申请中也称为微泡或“致癌组”。检测从肿瘤中脱落的微泡的一些方法是本领域公知的。参见例如(Skog J等，(2008)Nat Cell BiollO: 1470 - 1476)，其中公开了可以从罹患成胶质细胞瘤人类患者的血液样品中检测来源于脑肿瘤的微泡。如有需要还可以通过微泡表面标记物⑶63、或脂後标记蛋白(参见例如Rak2008Nature CellBiology)、或这些和/或其他MV标记物的组合对本发明中的微泡进行鉴定。
[0073]在另一个方面，本发明包括一种从样品中分离膜结构的方法，所述膜结构可以包括MV。所述方法通常包括提供可能包含所述膜结构的样品，将所述样品与tTG或其衍生物混合，如果样品中存在所述膜结构，允许其形成膜结构与tTG或其衍生物的复合物，以及从样品中分离所述tTG或tTG的衍生物与所述膜结构的所述复合物。
[0074]在不同实施方式中，所述膜结构通常是球形含脂质体。球形膜结构可以包括脂质双层。所述方法特别适于捕获从细胞脱落或分泌的那些膜结构。因而，所述膜结构可以来自任意含膜的生物材料，其包括但不限于细胞内膜、囊泡如分泌囊泡、细胞器、包膜结构、质膜等。在某些实施方式中，所述膜结构选自囊泡、外来体、微泡、微粒子、腔内囊泡、来源于内体的囊泡、多泡体、及其组合。
[0075]本发明适于分析任意生物样品中MV的存在，特别适于与tTG和/或交联的FN相结合的囊泡。在一个实施方式中，所述样品是液体生物样品。所述液体生物样品可以包括或由可能含有MV的血液、血清、脑脊液、尿液或任意其他生物液体组成。所述生物样品可以来自个体，如哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人。所述人可以是已被诊断为患有癌症、存在发展成癌症的风险或患有癌症的个体。所述生物样品可以直接用于确定是否存在tTG和/或交联的FN阳性的微泡。在另一个实施方式中，在对所述样品进行检测前对样品进行处理步骤。在一些实施方式中，可以进行所述处理步骤以纯化微泡和/或富集样品中的微泡含量。
[0076]本发明的一个方面包括从样品中分离微泡，这样如果样品中存在tTG阳性MV和/或交联的FN阳性MV就可以对其进行鉴别。在不同实施方式中，可以采用任意适宜的技术或技术的组合分离微泡或其他膜结构，其包括但不一定限于基于尺寸、密度和/或电荷分离物质中的组分的方法，所述方法包括但不限于离心和/或体积排阻色谱法。在不同实施方式中，可以使用一种或多种结合配体从样品中检测和/或分离微泡或其他膜结构。因而，所述的结合配体是可以用于从样品中检测、捕获和/或分离微泡或其他膜结构的试剂。可以对分离的微泡或其他膜结构进行检测以确定其是否含有tTG和/或交联的FN，或其他组分如任意肽、蛋白、多核苷酸或任意其他指示微泡或其他膜结构来源和/或在评估任意疾病或其他状况中具有意义的标记物。在本发明的不同方面，可以通过确定样品中是否存在与tTG和/或交联的FN相结合的微泡或其他膜结构以评估获取样品的个体的涉及一个或多个癌症相关参数的状态，如个体是否患有癌症如实体瘤，和个体是否具有或存在转移风险，和/或所提供的某一特定治疗方案对提供包含微泡样品的个体是否有益。
[0077]在一个实施方式中，用于从样品中分离微泡的所述结合配体是一种能够与tTG或FN特异性结合的试剂。此类试剂包括但不一定限于能够与tTG或交联的FN特异性结合的tTG或FN的抗体，适体和小分子结合剂。在某些实施方式中，所述结合剂能够特异性与tTG或交联的FN结合，所述tTG或交联的FN与从癌细胞中脱落的微泡相结合。所述结合剂可以对与微泡相结合的交联的FN具有特异性。在另一个实施方式中，所述结合剂对tTG和FN的复合物具有特异性。这种复合物可以与微泡相结合，所述结合剂可以对与微泡结合的复合物形式具有特异性。
[0078]在本发明的某些方面，在对tTG阳性和/或FN阳性的微泡进行的、基于免疫吸附的检测、分离和/或测定中可以使用一个或多个结合配体。因而，所述结合配体可以包括或由能够与FN或tTG结合的抗-tTG抗体或抗-FN抗体或抗体片段组成。所述抗体不需要是任意特定类型，其可以是多克隆或单克隆抗体。抗原结合片段包括但不一定限于Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链(ScFv)、双体、多价抗体、包括一个或多个抗体部分的融合蛋白、和任意其他经修饰的免疫球蛋白分子，其包括对tTG、FN、或其组合物具有所需特异性的抗原识别位点。
[0079]对于基于免疫吸附对MV进行的检测而言，本领域公知的目前可用的分离方法一般为三步离心法，其需要大量的初始原料(即，来自癌细胞或血液样品的条件培养基)，该方法耗时并且各次制备之间所得的MV产率可能存在较大差异。因而，根据本发明的对MV和其他膜结构进行更有效分离的新方法具有重要的实用价值。如下文中更详细的描述，我们的发现tTG和交联的纤连蛋白是来源于癌细胞的MV的组分，这一组分对于MV的转化能力具有重要作用。基于这一发现，我们开发了一种试验以确定我们能够使用MV结合配体从癌细胞的条件培养基中捕获MV。特别地，我们使用tTG抗体或纤连蛋白抗体从条件培养基中实施免疫沉淀，所述tTG抗体或纤连蛋白抗体与蛋白G-琼脂糖小珠(购自Invitrogen)预先结合，所述条件培养基可以从血清饥饿的MDAMB231乳腺癌细胞和U87脑肿瘤细胞中收集。如图50所示，在免疫沉淀样品道中存在MV标记物脂筏标记蛋白(从上数第三行)，由此我们证明了 MV能够与这些抗体中的任意一种免疫沉淀。我们还检测了 RhoA的存在情况，这是一种已知不是MV组分的蛋白，在这些免疫沉淀中未检测到这种蛋白，表明所述培养基未受到完整细胞的污染(最下面一行)。因而，我们证明了能够使用两种不同的MV结合配体捕获从癌细胞脱落的MV。
[0080]我们还检测了 tTG 本身是否能够用于捕获从癌细胞脱落的W。为了做到这一点，我们使用细菌中常规的重组蛋白合成方法制备了具有His标签的重组tTG。我们将这种具有His标签的重组tTG与镍珠结合并检测重组tTG是否还能够用于从收集自癌细胞培养物的条件培养基中分离MV。就这一点而言，图50中的后两行表明事实的确如此，如图所示，在这些样品道中检测到了脂筏标记蛋白(从上数第三行)。因而，图50中的数据确定了 tTG的纯化重组形式能够用作捕获从癌细胞脱落的MV的试剂。图50中的数据还证明了针对tTG或纤连蛋白的抗体能够用作分离从癌细胞脱落的MV的特异性结合配体。
[0081]对本领域技术人员而言，至少从图50中显而易见的是，本发明的某些方面提供了重组tTG或其衍生物从样品中捕获MV或其他膜结构的用途。人tTG的氨基酸序列为:
I maeelvlerc dleletngrd hhtadlcrek lvvrrgqpfw ltlhfegrny easvdsltfs
61 vvtgpapsqe agtkarfplr daveegdwta tvvdqqdctl slqlttpana piglyrlsle
121 astgyqgssf vlghfillfn awcpadavyl dseeerqeyv ltqqgfiyqg sakfiknipw
181 nfgqfedgil diclilldvn pkflknagrd csrrsspvyv grvvsgmvnc nddqgvllgr
241 wdnnygdgvs pmswigsvdi lrrwknhgcq rvkygqcwvf aavactvlrc lgiptrvvtn
301 ynsahdqnsn llieyfrnef geiqgdksem iwnfhcwves wmtrpdlqpg yegwqaldpt
361 pqeksegtyc cgpvpvraik egdlstkyda pfvfaevnad vvdwiqqddg svhksinrsl421 ivglkistks vgrderedit htykypegss eereaftran hlnklaekee tgmamrirvg
481 qsmnmgsdfd vfahitnnta eeyvcrlllc artvsyngil gpecgtkyll nlnlepfsek
541 svplcilyek yrdcltesnl ikvrallvep vinsyllaer dlylenpeik irilgepkqk
601 rklvaevslq nplpvalegc tftvegaglt eeqktveipd pveageevkv rmdllplhmg
661 lhklvvnfes dklkavkgfr nviigpa (SEQ ID NO:1).本发明包括使用全长的重组生产的tTG作为结合剂。本发明还包括使用tTG衍生物。适用于本发明的tTG衍生物包括但不一定限于对序列SEQ ID NO:1的缺失、插入、和保守性氨基酸取代。本领域技术人员将认识到在不影响其捕获MV和其他膜结构效用的前提下可以对所述序列作出多种修饰。例如，可以对tTG序列进行修饰以包括便于蛋白纯化的基于氨基酸的标签如His-标签。还包括具有改善的酶活性的tTG的突变形式。例如，在一个实施方式中，在本发明中使用的突变的tTG是转酰胺基作用(交联)缺陷的tTG。转酰胺基作用缺陷tTG蛋白的氨基酸序列是本领域公知的。在一个实施方式中，所述的转酰胺基作用缺陷tTG包括选自以下的突变:半胱氨酸277变为缬氨酸(C277V)、半胱氨酸277变为丝氨酸(C277S)、天冬氨酸306和天冬酰胺310变为丙氨酸的双突变(D306A/N310A，也将其称为双位点突变体)、以及这些突变的组合。在另一个实施方式中，所述tTG衍生物是tTG的纤连蛋白结合缺陷形式。此类tTG衍生物包括SEQ ID NO:1的序列，但缺乏SEQ ID NO:1的前7个氨基酸。在其他实施方式中，本发明中使用的tTG衍生物包括或由tTG的氨基酸残基1-139 (所谓的N-末端β-夹心结构域)或氨基酸1-200组成。就这一点而言，我们已经证明了当在细胞中表达时，这些tTG的截短形式具有较强的与质膜结合的能力(即，见图51和下面的描述)。因而，根据本发明预计这些tTG衍生物将能够从样品中捕获MV和其他膜结构。
[0082]任意适宜的tTG或FN结合配体或tTG或其衍生物，或其组合物都可以被用来确定样品中是否包括与tTG相结合的微泡。在本发明的某些方面，仅使用一种类型的结合配体。除了 tTG和/或FN的特异性结合配体，与tTG或FN以外的微泡标记物结合的结合配体也可以被用来确定样品中是否包括与tTG相结合的微泡。例如，无论被捕获的微泡是否与tTG相结合，可以使用能够特异性识别tTG或FN以外的微泡标记物的抗体或其抗原结合片段以捕获微泡。这种识别tTG或FN以外的微泡标记物的结合配体可称为是一般性微泡结合配体。在不同实施方式中，一般性MV结合配体可以是⑶63或脂筏标记蛋白。一般性微泡结合配体可以被用来获得第 一微泡群。第一微泡群可以是未与tTG结合的均质微泡，或与tTG结合的均质微泡，或者可以是混合的微泡群，其中的一些微泡与tTG结合，一些微泡未与tTG结合。第一微泡群可以使用任意适宜的技术来检测其中是否存在tTG。存在tTG表明第一微泡群中包括与tTG结合的微泡。同样地，缺乏tTG表明第一群中不包含与tTG结合的微泡。如有需要，可以测定第一微泡群中与tTG结合的微泡的量。例如，可以检测第一微泡群中tTG的量(如果存在)并以此测定第一微泡群中与tTG结合的微泡的量。在另一个实施方式中，可以使用tTG和/或FN特异性结合配体对第一微泡群进行进一步分离以获得第二微泡群。在此，通过从第一微泡群获得与tTG结合的第二微泡群，可以相应的富集含有tTG和/或FN的微泡。或者，可以使用tTG和/或FN结合配体处理一个以上样品，以获得富集了与tTG结合的微泡的组合物。
[0083]本发明的一个实施方式提供了一种使用tTG或tTG的衍生物捕获从细胞脱落的任意膜结构的方法。这一方法部分的基于我们的论证，即如上文所述的tTG能够用于捕获从癌细胞脱落的MV。针对本发明的这个方面，我们检测了 tTG直接与质膜结合的能力，以及其完成这一过程是否需要其他蛋白。这项分析的结果见图51。为获得这些结果，我们将纯化的重组野生型tTG (tTG WT)，或作为对照的牛血清白蛋白(BSA)，与合成得到的脂质体组合在一起，所述脂质体的脂质组分与哺乳动物细胞质膜的内层类似。经过短暂的培养后，离心使所述囊泡成团，然后将所得的上清和团块用SDS-PAGE分离并用Quick Blue染色以检测蛋白。图51显示tTG对脂质具有相对较高的亲和性，几乎所有的重组tTG (tTG WT)均与合成囊泡成团。另一方面，牛血清白蛋白(BSA)仅与脂质体较弱成团，大部分对照蛋白仍保留在上清中。因而，我们证明了 tTG不仅能够用于分离从癌细胞脱落的MV，还能够用于分离没有任何细胞组分的合成膜结构。因而，在本发明的一个实施方式中，重组tTG构成了一般的膜结构结合配体。
[0084]在不同实施方式中，可以采用检测蛋白的多种方法中的任意一种来测定样品中是否存在tTG和/或交联的FN，如免疫检测法，包括但不限于免疫印迹、用于蛋白检测的多孔检测板、用于蛋白检测的小珠、用于蛋白检测的横流装置或检测条、ELISA检测、或任意其他改进的免疫检测或适于检测蛋白的其他检测类型。考虑到本申请的优点，本领域技术人员将认识到这些或其他检测方法可以包括使用一种或多种本申请所述的tTG或FN结合配体。在不同实施方式中，所述的一种或多种结合配体可以与基质可逆地或不可逆地结合，如使用通过酰胺或酯键共价键合、离子吸引、或吸附的方法将所述结合配体共价地、离子地、或物理地结合于固相免疫吸附剂。所述基质可以是结合配体能够附着于其上的任意适宜的基质。例子包括通常用于免疫检测测定、横流装置、基于小珠的检测等的基质。所述固体基质可以是允许液体流过所述基质的多孔固体基质。所述液体能够通过任意适宜的方法流过所述多孔基质，如通过毛细管作用、微流体等。所述基质还可以是非多孔性固体基质，如由玻璃或其他非多孔性材料形成的小珠。
[0085]本发明包括一种检测组分的用途，根据本发明其能够被用于多种分析手段，所述分析手段适于检测是否存在与tTG和/或交联的FN相结合的微泡。例如，所述检测组分可以是用于检测在与特异性结合配体结合状态下的tTG和/或交联的FN的任意试剂。在一些实施方式中，所述检测组分包括放射性标记、荧光标记、或化学发光标记或基质。在一些实施方式中，所述检测组分可以是与本发明的结合配体连接的基质的一部分。例如，可以使用包括可检测标记的一个或多个小珠，所述可检测标记例如荧光标记、条码、或者能够确定小珠和是否存在tTG和/或交联的FN的其他方式。本领域技术人员将认识到此类试剂配置允许进行多道检测。
[0086]通过本发明的方法可以将tTG和/或交联的FN的量，和/或tTG阳性MV和/或交联的FN的MV的量与参照物进行比较。参照物的检测可以采用本领域普通技术人员公知的任意方法。在不同实施方式中，可以与参照物进行比较以确定tTG交联FN阳性微泡的存在和/或其量的预后意义。例如，所述参照物可以是tTG交联的FN的参考水平或tTG阳性交联的FN阳性的囊泡的参考水平。所述参考水平可以是已知的值或值的范围，或者可以是测定值或值的范围，该值可以从例如一个或多个已知未患有癌症、或者无tTG阳性微泡和/或交联的FN阳性微泡的主体，或者从一个或多个患有不同类型和/或处于不同癌症分期的主体测得。在一些实施方式中，所述参考水平是从一组患有癌症的主体中测定的平均水平，所述癌症如特定类型的癌症和/或特定分期的癌症。所述参照可以构成对照，如无tTG和/或交联的FN或者无tTG交联的FN阳性的微泡的对照样品，或加入已知量的tTG和/或交联的FN或者tTG和/或交联的FN阳性的微泡的对照样品。
[0087]本发明预计能够用于多种肿瘤疾病。例如，tTG和交联的FN阳性的微泡预计与多种实体肿瘤相关。而且，在分离得到微泡的个体中，tTG和交联的FN阳性的微泡预计能够提示转移或转移的风险。
[0088]在某些实施方式中，本发明提供了一种将个体诊断为具有tTG阳性、或交联的FN阳性、或tTG阴性、或交联的FN阴性的循环微泡的方法。该方法包括检测获取自个体的样品中的与微泡结合的tTG和/或交联的FN，如果存在tTG和/或交联的FN则将所述个体鉴定为具有与tTG和/或交联的FN相结合的循环微泡，如果样品中不存在tTG和/或交联的FN则将所述个体鉴定为不具有与tTG和/或交联的FN相结合的循环微泡。循环微泡被认为可以穿行通过个体的血液或其他体液。在一个实施方式中，使用所述方法分析的所述个体的样品来自已诊断为患有癌症且正在进行癌症治疗的个体。
[0089]本发明对癌症的类型没有特殊限制，只要所述癌症涉及tTG和/或交联的FN阳性的微泡的形成。本发明预计可用于诊断、预测和研发受推荐的治疗干预。在这一点上，本发明预计对以下癌症有价值，所述癌症的例子包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假性粘液瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、头颈部癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胸腺瘤、和华氏巨球蛋白血症。
[0090]本发明的另一个方面提供了一种在个体中抑制物质从含有tTG的微泡转移至所述个体中的一个或多个细胞的方法。抑制物质转移的方法包括但不一定限于抑制tTG阳性微泡与细胞对接。或者当所述细胞与微泡完全或部分对接时，抑制微泡的一些或全部内容物进入细胞。该方法包括给予个体包含tTG抑制剂的组合物。在一个实施方式中，所述tTG抑制剂是具有细胞不透性的抑制剂。在一个实施方式中，将所述组合物给予已诊断为患有、疑似患有、或存在癌症风险的个体。在一个实施方式中，给予所述组合物以抑制个体中癌细胞的转移和/或抑制转移灶的形成。
[0091]给予包含具有细胞不透性的tTG抑制剂的组合物时，所述个体可以是需要抑制tTG的个体，和/或已诊断为患有、疑似患有、或存在发展成与tTG阳性微泡相关的病症或其他疾病风险的个体，包括但不一定限于本申请所述的所有癌症。在一个实施方式中，给予所述组合物的个体不存在自身免疫性疾病和/或此前未接受过针对自身免疫性疾病的治疗。在某些例子中，所述个体未接受，和/或过去和目前均未接受过针对腹腔疾病的治疗。在某些例子中，所述个体是此前未给予过能够特异性抑制tTG试剂的个体。
[0092]所述具有细胞不透性的tTG抑制剂可以是能够特异性抑制tTG的交联活性的抑制剂或在空间上发挥作用如通过阻断tTG与例如细胞表面受体发生相互作用以干扰tTG阳性微泡与细胞对接的试剂。在一个实施方式中，所述具有细胞不透性的tTG抑制剂是生物试齐U，如抗tTG抗体，或其tTG结合片段。抗体的tTG结合片段如上文所述，预计其适于治疗目的。所述抗体或其抗原结合片段本质上可以是单克隆的，或重组产生的抗体或抗原结合片段。这些试剂相对于其氨基酸部分可以是嵌合的、部分人源化的或完全人源化的。在不同实施方式中，所述抑制剂是能够特异性识别与tTG相结合的微泡的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，所述抑制剂是能够识别tTG和交联的FN的复合物的抗体或其抗原结合片段，在特定的例子中其可以是与微泡相结合的。
[0093]在另一个方面，所述tTG抑制剂是能够特异性抑制tTG的交联活性的小分子。在一个实施方式中，所述tTG抑制剂是本领域公知的T101。TlOl可以从Zedira购得(Darmstadt，德国)。其他tTG抑制剂包括但不一定限于Zedira的化合物B0C_D0N(B003)，或化合物KCC009，在Yuan等发表的Oncogene (2007) 26，2563 - 2573中对其进行了描述。
[0094]在组合物如药物制剂中可以提供所述的tTG抑制剂。可以通过将所述抑制剂与任意适宜的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合制备用于治疗目的的组合物。适于与所述药物混合的组分的一些例子可以参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy (2005)第 21 版，Philadelphia,PA.Lippincott Williams&Wilkins。本领域技术人员将认识到本发明的方法中使用的任意tTG抑制剂特定给药方案的形式和特征将由给药途径和其他已知变量决定，需要考虑这些因素如所治疗个体的体型、性别、健康状况和年龄、和所述个体可能疑似患有或可能被诊断为患有的疾病的类型和分期。根据这一标准，本领域技术人员能够确定给予所述个体的组合物的有效量。
[0095]所述包含tTG抑制剂的组合物可以使用任意可用的方法和途径给予个体，包括口月艮、胃肠外、皮下、腹腔、肺内、鼻内和颅内注射。胃肠外输液包括肌内、静脉内、动脉内、腹腔内、和皮下给药。本发明的方法可以在常规的抗癌疗法之前、同时、或之后实施，所述常规的抗癌疗法包括但不限于化疗、外科手术、和放疗。
[0096]在不同实施方式中，本发明包括将样品中是否含有与tTG和/或交联的FN相结合的微泡的检测结果固定在有形介质中。所述有形介质可以是任意类型的有形介质如任意类型的数字介质，包括但不限于DVD、CD-ROM、便携式闪存设备等。本发明包括向医疗服务人员提供有形介质以便其对提供tTG阳性微泡样品的个体提供推荐的治疗方案。
[0097]在不同实施方式中，本发明提供了用于测定包含与tTG和/或交联的FN相结合的微泡或其他膜结构的组合物的试剂盒。所述试剂盒可以包括用于捕获包含tTG和/或交联的FN的微泡或其他膜结构的试剂，如一个或多个tTG和/或交联的FN的特异性结合配体。所述试剂盒还可以包括重组的tTG或其衍生物。用于检测微泡的特异性结合配体和试剂可以盛放在一个或多个密封的、无菌小瓶中。所述试剂盒可以包括用于检测微泡和/或包含微泡的样品中是否存在tTG和/或交联的FN的说明书。因而，所述试剂盒可以包括对tTG和/或交联的FN阳性的微泡进行免疫检测的工具，如与本文所述的一种或多种结合配体复合的小珠或横流装置。
[0098]本发明的另一个方面涉及一种包括分离的微泡或其他膜结构群的组合物，其中所述微泡或其他膜结构包含tTG和/或交联的FN，并且其中所述分离的微泡或其他膜结构群与tTG或其衍生物，或者tTG和/或交联的FN结合配体相连接。作为替代方案，除了与tTG或其衍生物，和/或tTG或交联的FN结合配体相连接的微泡或其他膜结构以外，本发明的组合物还包括分离的微泡群，其中所述微泡包含tTG和交联的FN，并且其中所述分离的微泡群与FN结合配体相连接。如上文更为详细的描述，在此类组合物的不同实施方式中tTG结合配体和/或FN结合配体可以与固体基质连接。
[0099]下文中的实施例是用于解释本发明。其并非旨在以任何方式进行限定。
实施例1
[0100]本实施例中的结果由采用实施例3中所述的材料和方法进行的实验获得。
[0101]我们通过扫描电子显微镜(SEM)(图1，左图)或对F-肌动蛋白染色的细胞使用荧光显微镜(图1，右图)对高侵袭性人乳腺癌细胞系MDAMB231的血清饥饿的培养物进行分析，结果显示?35%的细胞表面存在直径尺寸范围为?0.2-2.0微米的MV (图2)。在?25%的去血清的U87人胶质瘤细胞上也检测到了 MV，这些MV的形成需要通过由HeLa宫颈癌细胞分泌的表皮生长因子(EGF)刺激来诱导(图2和3)。与之相反，在血清饥饿或EGF刺激条件下培养的正常NIH3T3成纤维细胞的表面未检测到MV，这表明某些细胞类型可能不产生MV。而且，实验表明MV从这些癌细胞上活跃地脱落，延时拍摄的图像显示(图4)，GFP标记的MV从转染了编码Lyn酪氨酸激酶的质膜靶序列的pEGFP质粒(GFP-PM)的MDAMB231细胞的质膜释放，免疫印迹分析(图5)和荧光激活细胞分选(FACS)分析(图30和31)也表明，在从仅表达PEGFP的空载体质粒的转染细胞中收集到的培养基中也检测到了含GFP的MV。
[0102]根据此前关于MV在癌细胞之间分享其转运物质的报道，我们检测了 MV是否能够把供体癌细胞的某些转化特性赋予正常的(非转化的)受体细胞。因而，我们从MDAMB231乳腺癌细胞和U87脑肿瘤细胞的无血清培养基中分离出组成性脱落的MV (图6)并将其加入未转化的NIH3T3成纤维细胞的培养物中。由这两种癌细胞系产生的MV都能够促进受体成纤维细胞中信号蛋白激酶AKT和ERK活性(图7)，这与此前将来源于癌细胞的MV与其他癌细胞或内皮细胞培养时观察到的结果类似。而且，当NIH3T3成纤维细胞在添加有来源于MDAMB231细胞或U87细胞的MV的培养物中培养时，其表现出两种癌细胞的表型特性，即增强的存活能力(图8)和在低血清条件下生长的能力(图9)。通过测定锚定非依赖性生长(即，在软琼脂上的集落形成)，我们进一步检测了来源于癌细胞的MV是否能够诱导正常细胞的转化。图10和11表明使用从MDAMB231细胞或U87细胞中收集的MV持续处理成纤维细胞后能够赋予其在锚定非依赖性的条件下生长的能力，作为对照，正常条件下NIH3T3成纤维细胞不能在软琼脂上形成集落。来源于MDAMB231细胞的MV同样能促进正常人乳房上皮细胞系MCFlOA的存活(图32)和异常生长(图33)。因而，MV介导的由癌细胞向正常细胞持续性的转运物质转移确实赋予了正常细胞由致癌性转化诱导的特性。
[0103]然后，我们分析了哪种与MV相结合的蛋白负责介导转化能力的转移。因为已有发现表明通过MV能够在脑癌细胞之间共享EGF-受体的活化形式，我们最初认为EGF-受体是可能的候选蛋白。然而，因为在从U87细胞脱落的MV中无法检测到活化的EGF-受体(图6)，EGF-受体可能不是导致来源于MDAMB231乳腺癌细胞和U87成胶质瘤细胞的MV具有相似转化能力的物质(图8-11)。进一步支持上述观点的发现是，EGF-受体酪氨酸激酶抑制剂AG1478不能抑制由来源于U87细胞的MV给予的NIH3T3细胞的锚定非依赖性生长优势(图34)。
[0104]为鉴定可能参与了这些MV的转化作用的蛋白，我们进行了蛋白质组筛选。在实施例3中列出了来源于MDAMB231细胞和U87细胞的MV所共有的蛋白。值得注意的是，在与MV相结合的蛋白中包括了 tTG。tTG是一种与某些癌细胞所表现出的化学抗性和异常细胞生长相关的蛋白交联酶，其以一种未知的机制从细胞中分泌。我们已通过免疫印迹分析确定tTG是来源于MDAMB231和U87细胞的MV的一种组分(图12)，并且证明当使用tTG抗体进行免疫染色时可以检测到MDAMB231细胞表面的MV (图13，上图)，作为对照仅使用二抗染色时无法检测到MV (图13，左下图)。同样地，U87细胞和经EGF刺激的HeLa宫颈癌细胞产生的MV也含有tTG (图14)。与GFP对照相比，GFP标记的tTG能够更加有效地掺入MDAMB231脱落的MV中(图15)。综合上述发现，我们证明了 tTG特异性的存在于多种类型癌细胞产生的MV并且其对特定的细胞培养条件产生应答。
[0105]如图13所示，在细胞活化形式的MV中使用tTG抗体检测到的环形染色表明tTG通常富集在MV的膜中。相同的tTG抗体还对从非透性化的MDAMB231细胞的质膜上突出的MV进行了标记(图16)。通过免疫电子扫描显微镜(SEM)，相同抗体还在从MDAMB231细胞分离的单个MV的表面检测到了 tTG (图35)。图17中的顶部显示，根据其催化生物素化的戊胺(BPA)掺入酪蛋白的能力，我们判断在MDAMB231细胞的全细胞裂解物(WCL)中，或在从这些细胞脱落的完整的MV中表达的tTG具有酶活性。使用具有细胞透性的tTG抑制剂单丹酰尸胺(MDC)对完整的来源于MDAMB231细胞的MV进行预处理极大降低了在所述试验中检测到的BPA标记的酪蛋白的水平。有趣的是，细胞不透性的tTG抑制剂TlOl (图36和37)也有效阻断了 tTG与来源于MDAMB231细胞的MV结合的交联活性(图17)，这表明tTG主要在MV的外侧单层膜定位和活化。
[0106]通过对与tTG相结合的囊泡进行免疫荧光染色来监测MV的形成，我们发现来源于MDAMB231乳腺癌细胞的MV对阻断Arf GTPase活性的传统分泌抑制剂BFA或ExoI不敏感(图38)。这表明tTG交联蛋白的能力可能对癌细胞形成和/或脱落MV很重要，我们接下来检测了这一可能性。使用tTG抗体的免疫荧光分析揭示将MDAMB231细胞暴露于tTG的抑制剂MDC和TlOl对MV的形成没有影响(图38)。并且，从MDAMB231细胞脱落MV既不需要tTG的酶活性，也不受ExoI或BFA的影响，这体现在从对照细胞或经不同抑制剂处理的细胞的培养基中分离的MV中检测到了几乎等量的MV标记物脂筏标记蛋白-2和tTG (图39，左图和右图)。相应地，根据脂筏标记蛋白-标记物的读数，如果从MDAMB231细胞中敲除tTG，从而消除tTG在MV中的表达，从这些细胞中脱落的MV的量几乎没有改变(图39，中图)。而且，当缺乏交联底物(tTG C277V)或与GTP结合(tTG R580L)能力的tTG突变体在MDAMB231细胞中异位表达时，其与异位表达的野生型tTG同样能有效地靶向至MV(图40)。因而，这些结果表明tTG并非癌细胞形成或脱落MV的能力所必须的，tTG靶向至MV也不需要其酶活性。
[0107]接下来我们检测了 tTG是否是MV的转运物质并被转移至受体细胞。我们将NIH3T3成纤维细胞与MV培养30分钟，然后通过免疫印迹分析(图18和41)和免疫荧光显微镜(图42)分析tTG的表达，结果显示所述MV来源于MDAMB231细胞或U87细胞的血清饥饿的培养物。这些实验的结果显示与在对照成纤维细胞中几乎检测不到的tTG水平相比，与来源于癌细胞的MV培养后成纤维细胞中的tTG水平显著增加。
[0108]然后根据这些发现，我们提出的问题是MV介导的活化的tTG转移至受体成纤维细胞是否可能对赋予这些细胞增强的存活能力和转化特性具有重要意义。利用我们的发现即tTG定位于MV表面，这样其交联活性易于被具有细胞不透性的、不可逆的抑制剂TlOl所抑制(参见图13、16和17)。在将来源于癌细胞的MV加入成纤维细胞培养物之前，使用TlOl对来源于癌细胞的MV进行预处理可以选择性的和不可逆的抑制tTG与MV相结合的交联活性(图19和43)。使用这种方法，我们比较了在tTG的活性被抑制的条件下，由从癌细胞收集的MV为NIH3T3成纤维细胞带来的增强的存活能力将受到怎样的影响。图20和44显示，使用TlOl对来源于MDAMB231或U87细胞的MV进行预处理严重削弱了其保护受体成纤维细胞免受由无血清诱导的细胞死亡的能力。重要的是，在添加了正常量胎牛血清(2%CS)的培养基中培养NIH3T3细胞所达到的细胞存活程度并没有因加入TlOl而发生改变，这表明这种小分子抑制剂消除来源于癌细胞的MV提供的保护作用的能力并不是由于使成纤维细胞对细胞凋亡敏化的脱靶效应。然后我们进行了类似的实验，其中在存在细胞不透性的tTG抑制剂MDC的条件下将来源于MDAMB231细胞的MV与血清饥饿的NIH3T3细胞培养(图20)，或者将收集自tTG已被敲除的MDAMB231细胞(参见图39)中的MV加入血清饥饿的NIH3T3细胞中(图45)。总的来说，这些实验的结果表明tTG在介导存活优势中起到了关键性作用，所述存活优势通过来源于癌细胞的MV赋予成纤维细胞。
[0109]然后我们检测了来源于癌细胞MV的转化能力是否依赖于tTG。如图10和33，以及图21、46和47所示，将正常NIH3T3成纤维细胞和MCFlOA上皮细胞与来源于MDAMB231细胞或U87细胞的MV —起培养诱导正常细胞产生了在锚定非依赖性条件下生长的能力(即，形成集落)。然而，当将受体成纤维细胞或上皮细胞与经过TlOl预处理的MV制备物(图21、33、和47)，或者其中tTG已被敲除的MV制备物(图46)—起培养，则在各种情况下形成的集落数均减少。为进一步验证这一结果，我们的实验显示TlOl不会抑制一般性的细胞转化。一般性的细胞转化由表达小GTPase Cdc42 (Cdc42F28L)的活化形式的NIH3T3细胞在锚定非依赖性条件下的生长能力表示。我们的实验显示即使使用了过量5倍的T101，该抑制剂也不会影响表达Cdc42F28L的NIH3T3细胞在锚定非依赖性的条件下生长的能力(图48)。
[0110]这些发现促使我们随后去考虑是否来源于癌细胞的MV可能在体内也起到类似的作用并且通过使在肿瘤微环境中的正常细胞获得形成肿瘤的能力以促进肿瘤生长。为研究这个问题，可以利用以下事实:在将MDAMB231细胞注射到裸鼠体内前，将MDAMB231细胞暴露于有丝分裂阻滞剂丝裂霉素C，从而抑制其在一定条件下形成肿瘤的能力，在所述条件下其对照物(未经处理的MDAMB231细胞)能非常有效地诱导肿瘤形成(图25)。然而，当将经丝裂霉素C处理的MDAMB231细胞与相等数量的正常(未经转化的)NIH3T3成纤维细胞共同注射至小鼠体内时，6只小鼠中有4只形成了肿瘤，这表明从有丝分裂阻滞的癌细胞脱落的MV能够导致邻近的NIH3T3成纤维细胞转化，从而诱导肿瘤生长。有趣的是，随后发现在有丝分裂阻滞的MDAMB231细胞中敲除tTG的表达阻止了共同注射的NIH3T3成纤维细胞在小鼠中形成肿瘤。因而，这些结果与以下观点一致:癌细胞能够在体内产生MV，并且其导致在肿瘤微环境中的正常细胞促进肿瘤形成的能力依赖于tTG。
[0111]这些发现表明MV介导的tTG向受体细胞的转移是来源于MDAMB231细胞和U87细胞的MV转化成纤维细胞的能力所必须的。然后我们检测了是否单独的tTG就足以赋予受体细胞存活和转化的能力。我们发现稳定过表达具有Myc标签的tTG的NIH3T3成纤维细胞确实对由去血清诱导的凋亡具有抗性(图22)，使用MDC处理细胞后该抗性作用消失(图23)，但是其在软琼脂上不能形成集落，这与将来源于MDAMB231细胞的MV与表达对照载体的成纤维细胞一起培养后得到的结果不同(图24)。这表明尽管在正常细胞中tTG的过度表达/过度活化不足以完全诱导正常细胞转化(即，异位表达tTG的NIH3T3细胞未获得在锚定非依赖性条件下生长时形成集落的能力)，但是其能将转化状态的某些特性赋予正常细胞，使正常细胞能够在低血清条件下单层生长，以及对由无血清诱导的细胞死亡的敏感性减弱。然而，这些发现还表明为了能使受体细胞显示出细胞转化的主要标志之一即锚定非依赖性生长，来源于癌细胞的MV还可能将另一种蛋白与tTG—同转移。细胞骨架组分FN是一个特别有吸引力的候选物，因为其是tTG已知的结合配体并且其在来源于MDAMB231细胞和U87细胞的MV的蛋白质组学筛选中得到了鉴定(参见实施例3)。我们已通过免疫印迹分析确证FN在收集自各种癌细胞系中的MV中表达(图12)。然后，通过使用RGD-肽作为干扰FN与受体成纤维细胞表面的活化整合素结合能力的工具，我们对与MV相结合的FN在赋予成纤维细胞显示出锚定非依赖性生长的能力中的潜在作用进行了评估。在同时使用来源于MDAMB231或U87细胞的MV和RGD-肽或者对照RGE-肽中的一种来处理的成纤维细胞中进行锚定非依赖性生长检测，结果显示RGD-肽与TlOl—样阻断了 MV触发的对细胞转化的诱导作用，而对照肽则不能(图21和47)。
[0112]由于tTG和FN对来源于癌细胞的MV转化受体细胞的能力均具有重要作用，因而我们检测了是否其可能是合作引发了该细胞变化。为了解决这个问题，我们首先检测了 tTG是否在MV中与FN存在相互作用。如此前报道的结果，图26显示FN与MDAMB231全细胞裂解物中的tTG以及这些细胞脱落MV的裂解物免疫共沉淀。除了与单体形式的FN结合以外，tTG还与表观分子量为?440kDa的更大型的FN结合，其可能是交联的FN 二聚体并且仅能在MV的裂解物中检测到。在将MV裂解并将提取物进行免疫印迹分析前，使用tTG抑制剂TlOl对从MDAMB231细胞或U87细胞收集的完整的MV进行预处理，所述预处理对tTG与来自MV裂解物的单体FN进行免疫共沉淀的能力没有影响(图49)。然而，使用tTG抑制剂对MV进行预处理导致在MV裂解样品中检测到的?440kDa FN的量显著降低(图27)，这表明在来源于癌细胞的MV中更高分子量形式的FN是通过tTG与FN相互作用并交联而产生。
[0113]FN的二聚作用极大增强了其结合和活化细胞表面的整合素的能力。在癌细胞脱落的MV中tTG交联FN的能力提示FN的这种共价修饰形式具有加强整合素活化的能力。事实上，我们发现从去血清的MDAMB231细胞或U87细胞的培养基中分离的完整MV的制备物具有刺激信号活性的能力，所述信号已知是活化的整合素的下游信号包括FAK和ERK。而且，使用tTG抑制剂TlOl或干扰整合素信号的RGD肽能够阻断MV引起的这些激酶的活化，这进一步表明tTG和FN对MV的信号功能具有重要作用。
实施例2
[0114]该实施例对来源于MDAMB231细胞和U87细胞的MV中共同存在的蛋白进行了描述。使用MDAMB231乳腺癌细胞或U87脑肿瘤细胞脱落的MV进行蛋白质组学分析。下面的名单是由从MDAMB231和U87细胞的MV中得到鉴定的那些蛋白编译得到的(基于一般的细胞功能):对MDAMB231细胞和U87细胞脱落的微泡的蛋白质组学分析:核酸结合蛋白；真核翻译延伸因子I ;真核翻译延伸因子2 ;组蛋白簇I ;组蛋白簇2 ;RuvB-样蛋白I ;RuvB-样蛋白2 ;细胞外基质和质膜相关蛋白；膜联蛋白A2 ;CD9抗原；胶原蛋白；外_5’_核苷酸酶；包含EGF-样重复和盘状1-样结构域的蛋白3 ;纤连蛋白；半乳凝素3结合蛋白；整合素β I ；层粘连蛋白；赖氨酰羟化酶前体；主要组织相容性复合物；Na+/K+-ATP酶；转谷氨酰胺酶2亚型a ;代谢蛋白；醛缩酶A ;烯醇酶；铁蛋白；甘油醛-3-磷酸脱氢酶；L-乳酸脱氢酶A ;尼克酰胺磷酸核糖转移酶前体；磷酸甘油酸激酶I ;丙酮酸激酶；UDP-葡萄糖焦磷酸化酶；细胞骨架蛋白；肌动蛋白；辅肌动蛋白；伴侣蛋白；膜突蛋白；T-复合物蛋白I ;微管蛋白；波形蛋白；信号、传输、和其他功能蛋白；腺苷酸环化酶相关蛋白；α -2-巨球蛋白前体；热休克蛋白70kDa ;热休克蛋白90kDa ；HtrA丝氨酸肽酶I前体；含有缬酪肽的蛋白。
实施例3
[0115]该实施例提供了对获得实施例1中所述结果所使用的材料和方法的描述。
[0116]材料。4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、布雷菲德菌素A、丝裂霉素-C、和Exol来自Calbiochem,而TlOl来自Zedira0与罗丹明偶联的鬼笔环肽、EGF> Lipofectamine、Lipofectamine2000、蛋白G小珠、对照和tTG siRNA、和所有的细胞培养试剂均来自Invitrogen15FN抗体、MDC、和BPA来自 SigmaotTG和肌动蛋白抗体来自 Lab Vision/Thermo。脂後标记蛋白_2抗体来自Santa Cruz,以及HA和Myc抗体来自Covance。SteriflipPVDF-滤膜(0.45 μ m孔径)来自Millipore0针对I κ Ba、GFP的抗体，以及识别ERK, AKT,FAK和EGF受体的抗体来自Cell Signaling。
[0117]细胞培养。MDAMB231、U87、MCFlOA和HeLa细胞系在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中生长，而NIH3T3细胞系在含10%胎牛血清的DMEM培养基中生长。使用Lipofectamine将表达构建体转染至细胞，而使用Lipofectamine2000将对照和tTG siRNA引入细胞。如所示的，将细胞与含0.1 μ g/ml EGF、100 μ M MDC、10yM TlOlUO μ M BFA、和10 μ M Exol组合的无血清培养基培养。为阻滞MDAMB231细胞有丝分裂，使用10 μ g/ml的丝裂霉素-C处理细胞培养板2小时，随后洗去该溶液并将细胞在生长培养基(含10%FBS的RPM1-1640培养基)中恢复生长I天。
[0118]从癌细胞中分离微泡。对于使用MV制备物的各次实验而言，从5.0xlO6个血清饥饿的MDAMB231细胞或U87细胞中(相当于两个接近融合的150毫米培养皿的量)收集条件培养基并根据此前的描述从培养基中分离MV。简言之，将条件培养基连续进行两次离心；第一次为300gl0分钟使完整的细胞成团，第二次为2，000g20分钟使细胞碎片成团。为制备MV裂解物，在100，OOOg条件下对条件培养基第三次离心2小时，使用PBS洗涤所得团块，然后在 250 μ I 细胞裂解缓冲液(25mM TrisUOOmM NaCl、l%Triton X-1OOUmM EDTAUmMDTTUmM NaV04、lmMi3-磷酸甘油、和lyg/mL抑肽酶)裂解。为制备用于基于细胞的检测和所示其他实验的完整MV，我们使用孔径为0.45 μ m的Millipore Steriflip PVDF-滤膜对部分纯化的条件培养基(已除去细胞和细胞碎片的培养基)进行过滤。然后将截留在PVDF膜上的微泡重悬于无血清培养基中，每次制备均能得到足够的微泡以处理针对给定实验的受体细胞的6孔板中的2-3孔。
[0119]免疫印迹分析和免疫沉淀。使用Bio-Rad DC蛋白检测测定全细胞裂解物(WCL)的蛋白浓度，而通过将MV的裂解物从用于各个检测的实验条件的5.0xlO6个血清饥饿的MDAMB231细胞或U87细胞的条件培养基中分离，然后将其在250 μ I细胞裂解缓冲液中裂解，来对MV的裂解物进行归一化以便进行比较。对于免疫沉淀而言，将等体积的MV裂解物或SOOyg WCL与tTG抗体和蛋白G小珠共同培养。在某些实施例中，将来自细胞的培养基与tTG或纤连蛋白抗体以及蛋白G小珠共同培养。对离心收集的小珠-抗体-蛋白复合物、以及WCL (40 μ g)和MV提取物(75 μ I)进行SDS-PAGE分离并将所述蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜。将滤膜与在TBST (20mM Tris、135mM NaCl、和0.02%吐温20)中稀释的所述一抗共同培养。通过使用辣根过氧化物酶偶联的二抗随后暴露于ECL试剂(AmershamBiosciences)对一抗进行检测。
[0120]免疫荧光。使用3.7%的多聚甲醛对细胞进行固定，然后使用含0.l%Triton X-100的磷酸盐缓冲液(PBS)对一些样品进行透化处理。将透化和非透化样品与tTG抗体培养，然后与俄勒R绿488偶联的二抗培养。使用与罗丹明偶联的鬼笔环肽对肌动蛋白染色，使用DAPI进行核染色。使用荧光显微镜对细胞进行目测检测，使用IPLABS获取和处理图像。
[0121]实时图像荧光显微镜。使用荧光显微镜目测检查瞬时表达GFP-PM的MDAMB231细胞，其为靶向Lyn中序列的质膜的GFP标记形式。在15分钟内每30秒获取一次转染子的图像。
[0122]转酰胺基作用检测。根据此前的描述通过掺入裂解蛋白的BPA读取全细胞裂解物的转酰胺基作用活性，使用分光光度检测测定重组tTG (0.ΙμΜ)的转酰胺基作用活性，所述重组tTG暴露于浓度渐增的TlOl。通过在含有40mM N’N-二甲基酪蛋白、2mM BPA、40mMCaCl2、和40mM 二硫苏糖醇的缓冲液中将等量的(75 μ I)各MV样品培养15分钟读取MV的转酰胺基作用活性。通过加入Laemmli样品缓冲液随后煮沸终止反应。然后通过SDS-PAGE分离反应物并将所述蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜。使用含10%牛血清白蛋白的BBST(100mM硼酸、20mM硼酸钠、0.0P/oSDS,0.01%吐温20、和80mM NaCl)封闭滤膜，然后在室温条件下将其与辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素培养I小时，随后使用BBST充分洗涤，所述辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素使用含5%牛血清白蛋白的BBST稀释。在将膜暴露于ECL试剂后目测检查BPA掺入N’ N-二甲基酪蛋白的情况。
[0123]扫描电子显微镜(SEM)和免疫-SEM。使用在0.05M 二甲胂酸缓冲液(pH=7.4)中稀释的2%EM-级戊二醛将在Lab-Tek腔室玻片(Nunc)上生长的MDAMB231细胞固定I小时。对于免疫-SEM而言，将过滤分离得到的来源于MDAMB231细胞的MV加入Lab-Tek腔室玻片，待其附着后，然后使用在PBS中的2%EM-级戊二醛固定I小时。在0.0lM甘氨酸中封闭15分钟后，在含5%BSA、0.1%明胶和5%山羊血清的PBS中再封闭30分钟后，将MV与在PBS中稀释的tTG抗体(2 μ g/mL)培养I小时。使用PBS洗涤后，将MV样品与在PBS中稀释的6nm金粒子偶联的山羊抗小鼠IgG (Electron Microscopy Sciences)培养I小时。使用在PBS中的1%的四氧化锇将细胞和免疫标记的MV样品后固定I小时并使用含25%、50%、70%、95%、和100%乙醇的梯度乙醇溶液脱水，随后将其置于CPD-30临界点干燥机(BAL-TECSCD050)上。然后使用钼将细胞溅射镀膜，使用无定形碳将免疫标记的MV溅射镀膜，随后在Leol550场发射扫描电子显微镜上观察。
[0124]细胞生长检测。将NIH3T3细胞以10X IO4个细胞/孔的密度接种于6孔板的各孔中并且将其置于含2%CS且添加或未添加来源于5.0XlO6个MDAMB231细胞或U87细胞的MV的DMEM培养基中。连续三天每日一次收集一组培养基并计数，并为其余细胞补充培养基(包括添加新分离的MV)。进行三次检测并将所得结果取平均值和绘图。
[0125]锚定非依赖性生长检测。将与或未与来自5.0XlO6个MDAMB231细胞或U87细胞的MV培养的亲代NIH3T3细胞或MCF10A细胞，或者稳定过表达对照载体、野生型tTG、或Cdc42F28L的NIH3T3细胞以7 X IO3个细胞/ml的密度接种于培养板中，6孔板中已加入含0.6%琼脂糖的生长培养基，上述细胞在含0.3%琼脂糖，加入或不加所示的不同抑制剂的培养基中。连续12天每3天补充一次软琼脂培养基(包括加入新制备的MV和使用所示的不同抑制剂处理)，同时计数形成的集落数。各次检测均至少进行三次并将所得结果取平均值和绘图。
[0126]细胞死亡检测。将NIH3T3细胞或MCFlOA细胞接种于6孔板的各孔中，然后使用含2%CS的培养基或无血清培养基培养，如文所示，所述培养基未添加或添加了来源于
5.0X106个MDAMB231细胞或U87细胞的MV以及未加入或加入MDC或TlOl。两天后将培养基固定并用DAPI染色用于荧光显微镜观察。通过核皱缩或起泡鉴定发生凋亡的细胞，通过计算各条件下凋亡细胞数与总细胞数的比值确定死亡细胞百分率。这些实验至少进行三次并将各次实验的结果平均值和绘图。
[0127]流式细胞术。使用过滤法(上文所述)从5.0XlO6个模拟转染的MDAMB231细胞或瞬时表达GFP的MDAMB231细胞的条件培养基中分离完整的MV并将其重悬于含0.1%BSA的PBS中。使用BD LSR II流式细胞仪通过细胞栅分选尺寸在?1-3 μ m之间的细胞并确定其是否表达GFP来对MV样品进行评估。对各样品收集至少500个细胞，然后使用BD FACSDiva软件对数据进行分析。实验进行至少三次，从各次实验中获得相近的结果。
[0128]蛋白质组学分析。使用SDS-PAGE分离来源于MDAMB231细胞和U87细胞的MV的裂解物(每个样品?30yg)，然后根据生产厂商提供的实验步骤使用胶体蓝染色试剂盒(Invitrogen)染色。从凝胶上切下蛋白，然后使用胰蛋白酶消化。在康奈尔蛋白质组学实验室使用4000Q阱(三重串联四极杆线性离子阱)在线LC/MS/MS系统(Applied Biosystems/MDS Sciex)或Synapt HDMS系统(Waters)对所得的蛋白样品进行分析。通过对NCBI refseq蛋白数据库进行蛋白比对检索完成蛋白鉴定。
[0129]小鼠研究。将5x10s个稳定表达对照或tTG siRNA的有丝分裂阻滞(使用丝裂霉素C)的MDAMB231细胞与5x10s个NIH3T3成纤维细胞和生长因子减少的Matrigel (BDBiosciences)组合以使得最终溶液中含30%的Matrigel。将所述细胞制备物皮下注射至6-8周龄雌性NIH-1II裸鼠的胁腹部。作为对照，将亲代MDAMB231细胞和NIH3T3细胞(每个细胞系5xl05个细胞)分别与生长因子减少的Matrigel (终浓度为30%的Matrigel)组合，然后也注射到小鼠体内。一个月后，处死动物并将各实验条件下所形成的肿瘤切下并计数。该涉及小鼠的实验方案由康奈尔动物资源和教育中心(CARE)批准进行。
[0130]为获得图51所示的结果，使用下述程序。体外脂质体成分检测，将含有35%磷脂酰乙醇胺、25%磷脂酰丝氨酸、5%磷脂酰肌醇、和35%胆固醇的脂质混合物重悬于TBSM缓冲液中(20mM Tris, pH7.5、150mM NaCl、和2mM MgCl2)以制备合成脂质体。将所述脂质通过8微米滤膜挤出，13，OOOrpm离心15分钟成团，再重悬于TBSM缓冲液中。然后将等量的脂质制备物与重组野生型tTG或BSA培养15分钟，随后在室温条件下13，OOOrpm离心10分钟。使用截止分子量为IOK的离心浓缩器将上清液浓缩至?30 μ L，将成团的脂质体重悬于30 μ L TBSM缓冲液中。在凝胶上分离各样品，然后使用Quick Blue染色以检测蛋白。
[0131]尽管已通过特定的实施方式(其中的一些是优选的实施方式)来具体地显示和描述本发明，本领域技术人员应该理解在不脱离本申请所公开的本发明的主旨和范围的前提下可以在形式和细节上对本申请进行多种改变。
【权利要求】
1.一种表征微泡的方法，所述方法包括: i)获取包括微泡的样品； ii)检测所述微泡中的组织谷氨酰胺转移酶(tTG)和/或交联的纤连蛋白(FN);和 如果在样品中存在与微泡相结合的tTG则将所述微泡鉴定为tTG阳性，以及如果在样品中不存在与微泡相结合的tTG则将所述微泡鉴定为tTG阴性，和/或如果样品中存在与微泡相结合的交联FN则将所述微泡鉴定为交联FN阳性，以及如果样品中不存在与微泡相结合的交联FN则将所述微泡鉴定为交联FN阴性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括来自诊断为患有癌症、疑似患有癌症、或存在癌症风险的个体的液体生物样品。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测所述微泡包括通过将所述微泡捕获在结合配体上来从所述液体生物样品中分离所述微泡。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述结合配体附着于固体基质上。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述结合配体选自纤连蛋白、抗-纤连蛋白抗体或其纤连蛋白结合片段、 重组tTG或其衍生物、抗-tTG抗体、及其tTG结合片段。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述个体已被诊断为患有癌症并且正在接受癌症治疗。
7.一种将个体诊断为具有循环微泡的方法，所述循环微泡为 A)组织谷氨酰胺转移酶(tTG)阳性或tTG阴性，和/或 B)交联纤连蛋白(FN)阳性或交联FN阴性； 所述方法包括: I)检测来自个体的样品中的与微泡相结合的tTG，如果存在tTG，则将所述个体鉴定为具有与tTG相结合的循环微泡，如果不存在与微泡相结合的tTG，则将所述个体鉴定为不具有与tTG相结合的循环微泡；和/或 II)检测所述样品中的与微泡相结合的交联FN，如果存在交联FN，则将所述个体鉴定为具有与交联FN相结合的循环微泡，如果不存在与微泡相结合的交联FN，则将所述个体鉴定为不具有与交联FN相结合的循环微泡。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述样品包括来自诊断为患有癌症、疑似患有癌症、或存在癌症风险的个体的液体生物样品。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述检测所述样品包括通过将所述微泡捕获在结合配体上来从所述液体生物样品中分离所述微泡。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述结合配体附着于固体基质上。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述结合配体选自纤连蛋白、抗-纤连蛋白抗体或其纤连蛋白结合片段、重组tTG或其衍生物、抗-tTG抗体、及其tTG结合片段。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述个体已被诊断为患有癌症并且正在接受癌症治疗。
13.一种在个体中抑制物质从包括组织谷氨酰胺转移酶(tTG)的微泡转移至所述个体中的一个或多个细胞的方法，包括给予所述个体具有细胞不透性的tTG抑制剂。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述个体已诊断为患有癌症、疑似患有癌症、或存在癌症风险。
15.一种包括分离的微泡群的组合物，其中所述微泡包含组织谷氨酰胺转移酶 (tTG)，其中所述分离的微泡群附着于tTG结合配体，或者附着于重组tTG或其衍生物，或者附着于交联FN结合配体之上。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述结合配体附着于固体基质上。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述结合配体选自纤连蛋白、重组tTG或其衍生物、抗-tTG抗体、及其组合。
18.一种分离细胞膜结构的方法，包括提供可能包含所述膜结构的样品，将所述样品与组织谷氨酰胺转移酶(tTG)或其衍生物混合，如果样品中存在所述膜结构，允许其形成膜结构与tTG或其衍生物的复合物，以及从样品中分离所述tTG与所述膜结构的所述复合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品包括来自诊断为患有癌症、疑似患有癌症、或存在癌症风险的个体的液体生物样品。
20.根据权利要 求18所述的方法，其中所述膜结构是从细胞脱落的。
【文档编号】G01N33/53GK103477225SQ201280018703
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年2月17日 优先权日:2011年2月17日
【发明者】R·塞立昂, M·安东雅克, W·K·塞立昂, 李波 申请人:康奈尔大学