游动细胞的分析和分选的制作方法

游动细胞的分析和分选的制作方法
【专利摘要】用于分选游动细胞的方法，其包括将游动细胞的初始群体引入微流体通道的入口中，游动细胞的初始群体均有第一平均游动性；在所述微流体通道中温育所述游动细胞的群体；以及在所述微流体通道的出口处收集游动细胞的分选群体。游动细胞的分选的群体具有高于第一平均游动性的第二平均游动性。
【专利说明】游动细胞的分析和分选
[0001]对相关申请的交叉应用
[0002]本申请要求提交于2011年5月20日，美国申请序列号N0.61/488，300的权益。前述的内容通过提述并入本文。
[0003]关于联邦资助研究的声明
[0004]本发明是由以下资助而完成的:由National Institutes of Health授予，资助号为 R01A1081534、R21A1087107、和 R21EB007707 的政府支持；根据 U.S.Army MedicalResearch Acquisition Activity Cooperative Agreement 的 Integration of Medicineand Innovative Technology (CIMIT)资助(DAMD17-02-2-0006);以及 U.S.Army MedicalResearch&Materiel Command (USAMRMC)和 Telemedicine&Advanced Technology ResearchCenter(TATRC)所授予的资助。政府可以在本发明中有某些权益。
发明领域
[0005]本发明涉及用于分析和分选游动细胞，例如，哺乳动物精细胞的系统和方法。
[0006]发明背景
[0007]五百三十万生育年龄的美国夫妇(9%)受不育的影响，其中男性因素占50%的情况。带有或不带有胞衆内精子注射(intra-cytoplasmic sperm injection, ICSI)的体外受精(In vitro fertilization, IVF)已经成为了现代临床实践中克服男性不育挑战的最常用的辅助生殖技术。IVF和ICSI的一个障碍在于从可能有低精子数(精子减少(oligozoospermia))和/或低精子游动性(oligospermaesthenia)的精液样品中鉴定和分离最具游动性和推定最健康的精子。
[0008]发明概述
[0009]如本文中所描述的游动细胞分选和分析系统可以在空间限制的微流体通道中对游动细胞的群体，如精子，进行原位和实时的成像、追踪、和分选。所述游动细胞分选和分析系统是不含化学品和不流动的系统，其能够进行迅速、高通量的细胞分析和分选。可以确定游动细胞的特征，如细胞的量、平均游动性、和具体细胞的游动性。对这类特征的分析在诊断多种可以影响生育力的病况，如低精子数(精子减少)和低精子游动性(oligospermaesthenia)中是重要的。此外,最具游动性的细胞被动地由该分选和分析系统分选而无需泵或其它外围设备。由高度游动性的精子构成的样品对于例如用在辅助生殖技术中是合意的。
[0010]在一般方面，用于分选游动细胞的方法包括将游动细胞的初始群体引入微流体通道的入口中，所述游动细胞的初始群体具有第一平均游动性；在所述微流体通道中温育游动细胞的群体；和在微流体通道的出口处收集游动细胞的经分选的群体。
[0011]实施方案可以包括以下的一种或多种。
[0012]游动细胞包括精细胞，例如，动物，例如哺乳动物精细胞。
[0013]所述方法还包括使微流体通道水平或垂直朝向。
[0014]温育游动细胞的群体包括在没有流动介质的情况下温育。[0015]温育游动细胞的群体包括将微流体通道加热至大约37°C。
[0016]温育游动细胞的群体包括以足以允许部分的游动细胞的初始群体沿微流体通道移动的时间温育所述游动细胞的群体，例如，温育大约20-60分钟，或大约30分钟。
[0017]微流体通道的高度小于游动细胞的尺寸(dimension)的大约20倍，例如，游动细胞的尺寸的大约3至10倍。
[0018]所述方法还包括确定第二平均游动性，其包括获得出口附近的游动细胞的可收集的群体的多张图像，例如，阴影图像，所述游动细胞的可收集的群体包括游动细胞的分选的群体；和分析所述多张图像。
[0019]所述方法还包括基于游动细胞的初始群体的平均途径速率(average pathvelocity, VAP)、直线速率(straight line velocity, VSL)、或直线性的至少一种而确定第一平均游动性。
[0020]所述方法还包括基于游动细胞的初始群体的平均途径速率(VAP)、直线速率(VSL)、或直线性的至少一种而确定第二平均游动性。
[0021]引入游动细胞的初始群体包括将精子的初始群体以至少大约IO3精子/μ L，例如，至少大约IO4精子/ μ L的浓度在介质中悬浮。介质中的游动细胞的分选的群体的浓度小于或等于1.6χ103精子/L。
[0022]在另一个一般方面，用于分析游动细胞的群体的方法包括将游动细胞的初始群体引入微流体通道的入口 ；在微流体通道中温育游动细胞的群体；获得微流体通道内的至少部分游动细胞的群体的 多张图像；以及基于所述多张图像确定至少部分游动细胞的群体的特征。
[0023]实施方案可以包括以下的一种或多种。
[0024]游动细胞包含精细胞，例如，动物，例如，哺乳动物精细胞。
[0025]获得多张图像包括获得微流体通道内至少部分游动细胞的群体的多张阴影图像。
[0026]所确定的特征包括游动性、平均途径速率(VAP)、直线速率(VSL)、或直线性的至少一种。
[0027]所确定的特征包括以下的至少一种:⑴位于微流体通道的出口附近的游动细胞的分选的群体的特征，和(2)游动细胞的群体沿微流体通道长度的分布。
[0028]确定特征包括将位于微流体通道的出口附近的游动细胞的分选的群体的特征与以下的一者或两者比较:(1)游动细胞的初始群体的特征，和(2)在温育后的位于入口附近的游动细胞的剩余群体的特征。
[0029]所述方法还包括基于所述比较的结果确定微流体通道的分选能力。
[0030]确定特征包括将温育后位于入口附近的游动细胞的剩余群体的特征与温育后位于微流体通道的出口附近的游动细胞的分选群体的特征进行比较。
[0031]所述方法还包括基于所确定的特征确定游动细胞的初始群体的健康性。
[0032]所述方法还包括在微流体通道的出口处收集游动细胞的分选的群体。
[0033]温育游动细胞的群体包括在没有流动介质的情况下以足以允许精子的初始群体沿微流体通道移动的时间温育，例如，大约20-60分钟，或大约30分钟。
[0034]温育游动细胞的群体包括以足以允许部分精子的初始群体沿微流体通道游动的时间温育精子的群体。[0035]微流体通道的高度小于游动细胞的尺寸的大约20倍，例如，游动细胞的尺寸的大约3至10倍。
[0036]在另一个一般方面，用于分选游动细胞的装置包括微通道。微流体通道的高度选择为小于游动细胞的尺寸的大约二十倍。所述装置还包括连接至微流体通道的第一端且经配置以接受具有第一平均游动性的游动细胞的初始群体的入口，和连接至微流体通道的第二端的出口。微流体通道经配置以在第二端提供游动细胞的分选的群体而无需微通道中的流体流动。游动细胞的分选的群体具有高于第一平均游动性的第二平均游动性。
[0037]实施方案可以包括以下的一种或多种。
[0038]游动细胞包含精细胞,例如,动物,例如,哺乳动物精细胞。所述游动细胞的尺寸是精细胞的头部的直径。
[0039]游动细胞的尺寸是游动细胞的直径。
[0040]微流体通道的高度选择为游动细胞的尺寸的大约三倍至十倍，例如，小于大约200 μ m,例如小于大约60 μ m,例如，大约3-20 μ m。
[0041]至少部分基于通道中的游动细胞的温育时间和游动细胞的速度的至少一种而选择微流体通道的长度，例如，长度小于大约20mm，例如，大约12-15mm。
[0042]至少部分基于游动细胞在通道中的温育时间和游动细胞的速度的至少一种而选择微通道的长度。
[0043]微通道经配置以在温育时间后提供游动细胞的分选的群体。
[0044]微流体通道具有矩形横截面、梯形横截面、三角形横截面、圆形或椭圆形横截面、沿所述微通道的长度而变化的横截面、或有脊的横截面。
[0045]微流体通道是线性或弯曲的。
[0046]装置还包括经配置以捕获至少部分的微流体通道的多张图像的成像系统。成像系统包括经配置以照亮至少部分微流体通道的光源；和经配置以检查微流体通道的照亮的部分中的游动细胞的图像，例如，阴影图像的检测器。
[0047]所述装置还包括经配置以基于捕获的图像而确定微流体通道的被成像部分中的游动细胞的特征的分析模块。
[0048]“游动细胞(motile cell) ”是能够自发和主动移动，例如，通过鞭毛(flagella)和/或纤毛(cilia)移动的细胞。用于本申请的目的的例示性的游动细胞包括精细胞,例如，哺乳动物精细胞；嗜中性白细胞；巨噬细胞；白细胞；和某些细菌。
[0049]本文中所描述的系统和方法具有多种优势。例如，所述游动细胞分选和分析系统促进对具有高游动性的细胞，如精细胞的鉴定和选择。产生了高产率的游动细胞而不对细胞(甚至具有低细胞数或低细胞游动性的起始样品)有有害的效果。所述系统简单、紧凑、便宜、且不需要使用复杂的仪器或外围设备如管或泵。其结果不依赖操作者。所述游动细胞分选和分析系统对于希望选择高游动性细胞以用在辅助生殖技术中的生育诊所(fertility clinic)和希望在家庭中检查其生育性的个人可以是有用的。
[0050]除非另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有其在本发明所属的【技术领域】中普通技术人员所通常 理解的相同含意。尽管与本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明，下文会描述合适的方法和材料。本文中所提到的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献通过对其全文提述并入本文中。在矛盾的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、方法、和实例仅是例示性的，且不意图为限定性。
[0051]本发明的其它特征和优点鉴于以下的详述和根据权利要求是显而易见的。
[0052]附图简述[0053]图1是例示性的游动细胞分选和分析系统的示意图。
[0054]图2A是本文中所描述的游动细胞分选和分析系统的例示性微流体芯片的示意图。
[0055]图2B是图2A的例示性微流体芯片的分解图。
[0056]图3是例示性微流体通道的几何形状的示意图。
[0057]图4是经分选和未经分选的鼠类精子的平均途径速率(VAP)和直线速率(VSL)的绘图。
[0058]图5A和B分别是在水平和垂直朝向微通道中的鼠类精子游动性向量(vector)的革巴心图(bulls-eye plot)。
[0059]图6A-6C分别是在水平和垂直朝向微通道中的鼠类精子速度、精子直线性、和精子加速度的绘图。
[0060]图7是在温育I小时后例示性微流体芯片的微通道内的实验性和刺激的鼠类精子分布的绘图。
[0061]图8是实验和模拟的鼠类精子在例示性的微流体芯片的微通道中的分布作为温育时间的函数的绘图。
[0062]图9A-D分别是VAP、VSL和直线性，以及游动鼠类精子的百分数作为通道长度和温育时间的函数的绘图。
[0063]图10是鼠类精子VAP和VSL以及分选的精子的可收集精子百分数作为通道长度的函数的绘图。
[0064]图1IA-1ID分别是用微流体芯片分选的精子、用向上游动技术(swim_uptechnique)分选的精子、和未分选的精子的鼠类精子VAP、VSL、直线性、和游动精子的百分数的绘图。
[0065]图12是显示精子轨迹的图像。
[0066]图13是图12的精子轨迹的平均均方位移(average mean-squareddisplacement)拟合至持久性随机游走(persistent random walk, PRff)模型的绘图。
[0067]图14是进行持久性随机游走(PRW)的精子的轨迹的示意图。
[0068]图15是精子的分布作为通道长度的函数的绘图。
[0069]发明详述
[0070]参考图1，游动细胞分选和分析系统100在空间限制的微流体通道内原位和实时成像、追踪和/或分选游动细胞，如精子的群体。游动细胞分选和分析系统100是能够进行迅速、高通量细胞分析和分选的无化学品和不流动的系统。可以确定游动细胞的特征，如细胞的量、平均游动性、和具体细胞的游动性。这类特征的分析在对多种可能影响生育性的病况，如低精子数(精子减少)和低精子游动性(oligospermasthenia)的诊断中是重要的。此外，多数游动细胞被动地由所述分选和分析系统分选而无需泵或其它外围设备。主要由高度游动性的精子构成的样品，对于例如在辅助生殖技术中使用是合意的。[0071]所述例示性分选和分析系统100包含微流体芯片102，其包含一个或多个微流体通道200。在一些实施方案中，所述微流体芯片102与成像系统106整合，所述成像系统捕获微流体芯片的一个或多个微流体通道中的精子的图像。对图像的分析允许确定微流体通道中的精子的特征，如数目、游动性、速率、加速度、和/或方向性。此外，微流体通道中的精子是在沿通道移动(例如，通过游泳或其它种类的自我推进运动)的同时受分选的，这样使得可以在通道的出口处提取高品质游动精子的分选样品。
[0072]在以下的描述中，游动细胞分选和分析系统是参照精子而描述的。然而，应当理解其它游动细胞，如嗜中性白细胞、巨噬细胞、白细胞，和某些细菌，如细菌大肠杆菌也可以用于该系统。
[0073]微流体芯片的结构和制作
[0074]参考图2A和2B，微流体芯片102具有一个或多个微流体通道200a, 200b, 200c, 200d。将精子通过，例如用移液管204注射而引入入口206a, 206b, 206c, 206d以用于分选和/或分析。在如下文所讨论的充足的温育期之后，将分选的精子的样品从出口 208a，208b, 208c, 208d提取。
[0075]微流体芯片102是由基层210、中间层212、和覆盖层214所形成的多层结构。通道200在中间层212中形成，入口 206和出口 208在基层210中形成。各个通道200的第一端与其对应的入口 206对齐，并且各个通道200的第二端与其对应的出口 208对齐，由此产生经由通道200的从入口 206至对应的出口 208的流动通道。在一些实施方案中，通道200稍微延伸超出它们对应的入口和出口 206、208。该通道的大小可以接受例如微升或毫升体积的含有待分析和/或分选的精子的溶液。所述通道可以进一步调整大小和形状以达到如以下所描述的，有效 的分选。
[0076]所述微流体芯片对于以水平配置(即，通道水平朝向)或垂直配置(即，通道垂直朝向)的分选和分析而言是可操作的。
[0077]基层210向微流体芯片102提供结构支持，且是由足够刚性的材料，如合适厚度的聚甲基丙烯酸甲酯(poly (methylmethacrylate), PMMA;McMaster Carr, Atlanta, GA)形成，其中所述厚度如约1.5mm(例如，约Imm至4mm)。如需要，则使用激光切割器(VersaLaser?, Scottsdale, AZ)将大块PMMA切割成为合意大小以供用于微流体芯片(例如，24mm x40mm)，和切割用于入口 206和出口 208的孔。在一些实例中，出口 208大于入口206以协助收集到达通道208的出口端的精子。例如，在一些实施方案中，入口 206具有约
0.375mm或0.65mm(例如，约0.3mm至1.2mm)的直径且出口具有约0.375mm或约2mm(例如，约0.3mm至3.4mm)的直径。
[0078]中间层212是由粘合至基层210的材料，如双面粘合(double-sidedadhesive, DSA)薄膜(iTapestore, Scotch Plains, NJ)所形成的。通道 200 由在中间层 212中激光切割多边形(laser cutting polygon),如矩形区域(rectangular section)所形成，所述中间层自身也激光切割至合意的大小(例如，基层210的大小)。通道200的高度是由中间层212的厚度所决定的，其在下文非常详细地讨论。通道200的长度和宽度分别由切割中间层212的多边形的长度和宽度所决定。例如，和如下文非常详细地描述，所述通道可以是约1-1Omm宽(例如，约4mm宽)和约1 -20mm长(例如，约3mm, 7mm, 10mm, 15mm,或20mm长)。在一些情况中，在中间层中形成了不同长度和/或宽度的多个通道。[0079]在将通道200切割入中间层212后，将中间层粘合至基层210，使得各个通道200的第一和第二端都与对应的入口和出口 206、210对齐或稍微延伸超出。覆盖层214粘合至中间层的暴露的面上由此封闭通道200，所述覆盖层214是例如具有与基层210和中间层212相同侧面尺寸的玻璃片。在图2所描绘的实施方案中，微流体芯片102的朝向使得覆盖层214在底部。在其它的实施方案中，所述微流体芯片102的朝向可以使得所述覆盖层214在顶部或使得通道200的顶部敞开。
[0080]一般地，本文中描述的微流体芯片102是被动的，即，不偶联至主动流动系统。也就是说，游动细胞自身在微流体芯片102中沿微通道200移动(例如，游动)而不被推动或要不然由外来驱动的流体流(即，游动细胞所悬浮于的介质的流动)所移动。
[0081]成像系统的操作
[0082]再次参考图1，在一些实施方案中，所述精子分选和分析系统100包含与任选的成像系统106整合的微流体芯片102，其结构在上文中描述。微流体芯片102与成像系统106的整合使得能够追踪和分析一个或多个微流体通道200中的精子的群体或单个精子。在一些实施方案中，所述成像系统106是无透镜成像系统，其实现对微流体芯片102的一个或多个通道200的自动和宽视场(wide field_of-view)成像。在其它实施方案中，成像系统104是带有例如IOx物镜的光学显微镜。
[0083]成像系统106包含光源108，如发光二极管(LED)或其它光源。所述光源108照亮微流体芯片102的一个或多个通道200。图像传感器110置于微流体芯片102相对于光源108的反面。当光射向(incident on)通道200,被照亮的通道中的精子衍射和传导光。精子衍射的光所生成的阴影由图像传感器110所成像，生成通道200中的精子的群体的阴影图像(即，通道200中每个精子都作为阴影而成像的图像)。所述图像传感器可以是任意合适的传感器，如电荷稱合元件(charge-coupled device, CCD)传感器(Imperx, Boca Raton, FL)或基于互补型金属氧化物半导体(complementarymetal-oxi de-semi conductor, CMOS)芯片的传感器。
[0084]无透镜成像系统106快速地(例如，约一秒)生成通道中的精子的阴影图像，且具有宽广的视场(field of view, F0V)。例如，成像系统106的FOV可以是从几毫米乘以几毫米(例如，4mm x5.3mm)直至大到几厘米乘以几厘米(例如,3.725cm x2.570cm),或另一种适于对一个或多个通道200的部分或全部成像的大小(例如，达10条平行通道)。
[0085]在一些情况中，成像系统106的FOV可以涵盖几十万个个体精子。此外，因为成像系统106的宽广的F0V，每个个体精子都可以在成像系统的FOV中停留相对较长的时间。因此，可以对较大数目的精子整体地或个体地，在较长时间内追踪和分析精子运动和活性，使得能够获得准确的统计数据。在一些实施方案中，成像系统106经设计为以足够的对比度和信噪比对FOV内的待单独检测或计数的精子进行成像，其在一些情况中可以导致牺牲空间分辨率。
[0086]人工和/或自动地使用图像分析软件(例如，ImagePro software, MediaCybernetics, Inc.，MD)处理图像以对所成像的通道中的单独的精子或精子的群体(例如，游动精子)进行计数、鉴定、追踪、和分析活性。例如，为分析为了得到特别的通道中的精子分布而获得的图像，进行每张图像中的对精子的自动计数和鉴定。将计数的结果与衍射理论(diffraction theory)比较,其包括图像传感器110的活性区域(例如，(XD传感器的活性表面)和成像的微观物体(例如，精细胞)的位置之间的距离作为关键参数。为了定量地调查细胞阴影直径对检测的信号强度的影响，将捕获的精细胞的衍射特征(diffraction signature)拟合至模型。在无透镜成像系统的实例中，系统的操作可以通过求Rayleigh-So_erfeld衍射公式的数值解来建模。
[0087]大面积的CXD的使用和合适的软件处理-如基于视频的粒子追踪代码-的组入，使得能够实现高度的可放大性(scalability)，使得例如可以同时监测和分析数百万精子。
[0088]精子分选和分析系统的使用
[0089]将悬浮于生物相容性介质(biocompatiblemedium),如 Human Tubal Fluid (HTF)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的精子使用例如移液管经由通道的入口 206引入微流体芯片102的微流体通道200中。通道可以已经含有生物相容性介质。将微流体芯片102在37°C温育足以允许游动精子沿通道朝向通道的出口 208移动的时间。例如，所述温育期间可以是约20-40分钟，例如约30分钟或小于约I或2小时，或小于会导致在出口处的精子疲劳的时间的量。在温育期间后，将精子从出口 208，例如通过使用剥离器(stripper)或带有例如精细的移液尖(fine tip)的移液管，或通过向芯片入口泵入介质而提取。因为只有游动精子可以沿通道的长度移动，从出口提取的精子是游动精子；可以优化温育期以仅获得高游动性精子(例如，通过选择在给定的时间量内到达出口处的精子)。留在入口附近的精子是较少游动的精子，其不能够沿通道的全长移动，或非游动精子，其仅经由随机运动(randommotion)而移动。因此，微流体芯片102实现对精子的简单、被动、无流动的分选，并且允许提取闻游动性精子的样品。
[0090]除了分选外，精子分选和分析系统100还使得能够进行多种类型的分析，如对平均精子游动性的分析和对单个精子的途径和游动性的追踪和分析。例如，可以定量完整精子样品或提取的分选精子样 品的速率、加速度、方向性、或游动性以，例如鉴定高品质精子样品或诊断出精子样品的问题(例如，将样品诊断为精子减少或oligospermaethenic样品)
[0091]精子分选系统100是在水平配置(即，流过通道206为水平的)或在垂直配置(即，流过通道206为垂直的，且将重力用作分选精子中的额外的辨别因子(discriminator))都可操作的。为了在体内使卵子受精，由于女性/雌性生殖系统的解剖学和/或位置，可能需要精子对抗重力向卵子移动。因此，以垂直朝向进行精子分析和/或分选可以提供比在水平朝向进行分析和/或分选更符合实际的对精子的表征或选择。
[0092]在一些实施方案中，为了降低当使用无透镜CXD成像系统用于精子计数时的错误，可以基于模型而估计成像系统所能分辨的最大精子浓度(例如，如在Ozcan和Demirci, Lab Chip, 2008, 8，98-106中所描述的，通过提述将其内容并入本文中)。例如，对于4mm x5.3mm的CCD面积，该模型预测最大可分辨的精子浓度为1.6xl03精子/L。当将精子样品置于用于分选的微流体通道，尤其是较长的通道时，可以对游动精子所位于的通道的出口端进行精子监测。在该区域。精子的浓度低于在入口附近的精子的浓度。因此，可以将高于最大可分辨精子浓度的精子浓度，如高达临床观察到的浓度的精子浓度，引入通道的入口而不降低成像系统在通道出口处附近的分辨能力。如在以下实例中所例示的，引入高于最大可分辨精子浓度的精子浓度的能力得到了实验验证:尽管在入口处引入浓度2xl04精子/ μ L的精子，在通道的出口附近并没有观察到分选的精子的重叠的阴影。[0093]影响分选能力的参数
[0094]再次参考图2，当经由入口 206将精子引入微流体通道200时，游动精子在微流体通道内移动。微流体通道200代表对精子的空间限制的环境，其导向游动精子使其沿微流体通道的长度朝出口 208移动。作为结果，在充足的温育期之后，高游动性精子的群体到达出口附近而较少游动或不游动精子的群体留在其在入口 206附近的原本位置或其附近。因此精子在微流体通道中的空间限制导致根据通道内的精子的游动性的被动分选。
[0095]微流体通道的几何性状可以影响通道内精子分选的效率。例如，微流体通道的尺寸和形状影响通道内的流体阻力。此外，精子运动还受到精子间相互作用的影响，其部分受通道内可用的空间影响。
[0096]为达成对微流体通道内的精子的空间限制，可以基于通道内待分选的精子的尺寸而选择通道的高度和/或宽度(即，中间层212的厚度和切割进中间层的多边形的宽度)。例如，参见图3，通道200的高度可以选择为待分选类型的精子的头302的尺寸d (或者更加一般性地，基于待分选的游动细胞的尺寸，如直径)的较小的倍数。在一些实例中，高度是精子头部的尺寸的3-10倍，或小于精子头部的尺寸d的20倍。在其它的实例中，可以基于精子头部的尺寸d或游动细胞的尺寸而选择通道200的宽度W。如在图3中所示，尺寸d是椭圆形精子头部302的短直径。在其它实施方案中，尺寸d可以是椭圆形精子头部302的长直径d’，或精子头部的长和短直径的平均值。
[0097]更具体地，对于具有大约2-3 μ m头部尺寸d的人精子，通道200的高度可以是，例如，6-30 μ m，或小于60 μ m。对于具有大约10 μ m头部尺寸d的啮齿类(例如，小鼠)精子，通道200的高度h可以是约30-100 μ m，或50 μ m，或小于200 μ m。对于具有约4-5 μ m的头部尺寸d的牛精子，通道200的高度h可以是约，例如，10-50 μ m，或小于100 μ m。对于具有约3-4 μ m的头部尺寸d的马精子，通道200的高度h可以是约，例如，10-40 μ m，或小于80μηι。对于具有约4 μ m的头部尺寸d的羊精子(ram sperm),通道200的高度h可以是约，例如，10-40 μ m，或小于80 μ m。对于具有约4_5 μ m的头部尺寸d的兔精子，通道200的高度h可以是约，例如，10 -50 μ m，或小于100 μ m。对于具有约3 μ m的头部尺寸d的猫精子，通道200的高度h可以是约，例如，10-30 μ m,或小于60 μ m。对于具有约3_4 μ m的头部尺寸d的狗精子，通道200的高度h可以是约，例如，10-40 μ m，或小于80 μ m。对于具有约5μηι的头部尺寸d的猪精子(boar sperm),通道200的高度h可以是约,例如，15-50 μ m,或小于ΙΟΟμπι。对于来自其它物种的精子，可以相应地调整通道的大小。在一些实施方案中，通道的尺寸是基于无量纲的量(dimensionless quantity),其经由在空间限制的环境中的对精子运动的模拟而确定，如在下文中更详细地描述。
[0098]在一些实施方案中，可以调节微流体通道的形状以实现对通道内的精子更有效的分选。例如，可以使用不直的通道(例如，弯曲的通道、S形的通道、正弦曲线形的通道(sinusoidal channel)、正方形通道(square channel)、或成角度的通道(angledchannel))。微流体通道的宽度从通道的入口端到通道的出口端可以改变(例如，收缩或发散的通道)。微流体通道的侧壁可以是成角度的，以产生例如，具有宽的底部和窄的顶部的通道(例如，具有梯形横截面的通道)，或者具有另一种横截面，如三角形横截面、圆形或椭圆形横截面、或另一种形状的横截面的通道。横截面还还可以具有脊、如从人字形结构(herringbone structure)形成的脊或从矩形直肋(rectangular fin)形成的脊。通道的深度可以沿通道的长度而变化。其它形状或具有其它几何特征的通道也可以使用。
[0099]还选择微流体通道200的长度以达成对通道内精子的有效的分选。对于给定的温育时间，选择通道的长度，使其足够短以使得游动精子能够在温育时间之内到达通道的出口，但还使其足够长以使得在通道的出口处的游动精子和在入口处的较少游动和不游动的精子之间有充足的分离。例如，对于30分钟的温育期和对于具有80-120 μ m/s的速率的小鼠精子，可以选择12_15mm的通道长度。对于同样的30分钟温育期但是对于具有约50 μ m/s的速率的人精子，可以选择8-12mm的通道长度。
[0100]还可以使其它设计参数变化以优化微流体通道的分选能力。例如，可以使通道中的游动细胞的温育时间变化。可以沿通道施加化学、生物、或温度梯度。可以改变固定的或动态的介质(medium)和表面参数,如例如营养物和氧气的扩散转运(diffusivetransport),其例如经由存在其它细胞,如卵丘细胞(cumulus cell)而达成。可以改变精子所悬浮于的分选介质的性质，如例如，介质的密度、表面张力、孔隙率、和/或粘度。还可以改变其它设计参数以影响微流体通道的分选能力。
[0101]在一些情况中，根据微通道中的精子游动性的模型的特定情况(specificationof a model of sperm motility)而选择微流体芯片102的设计参数的一些或全部。该模型可以模拟单个精子和/或精子的群体在空间限制的环境中的行为，包括，例如精子间的相互作用和精子和微通道的表面之间的相互作用。所述模型可以组入如例如整体水动力学效果(collective hydrodynamic effect)、精子疲劳(sperm exhaustion)、精子聚集或其它相互作用、精子间相互作用水动力学所导致的协同性、精子和通道壁之间的相互作用所导致的协同性、和/或来自精子的鞭毛的波动形式的因素。此外，该模型可以组入通道几何参数，包括长度、 宽度、高度、和形状。
实施例
[0102]本发明由以下实施例进一步描述，其不限制描述于权利要求中的本发明的范围。
[0103]一般地，以下实施例展现了微流体芯片分选游动细胞，如精子的能力。高度游动性的细胞可以从芯片内的微流体通道的出口回收，而较少游动或不游动的细胞存留在通道中。微流体芯片的分选能力取决于多个参数，包括通道尺寸和温育时间。游动细胞的特征，如游动性的多种动力学参数，可以通过分析微流体通道中的游动细胞的图像而确定。
[0104]实施例1:精子样品的制备
[0105]从7至12周龄的B6D2F1小鼠获得了精液样品，所述小鼠来自JacksonLaboratories (Bar Harbor, ME)。使小鼠暴露于CO2直至不动，并且然后通过颈脱位法(cervical dislocation)安乐死。在中央部分(midsection)做小切口(small incision),使皮肤拨开(reflected back),并用锐剥离(sharp dissection)进入腹膜以暴露内脏。将两块脂肪垫(fat pad)都拉下以暴露睾丸和附睾(epididymides)。将附睾尾和输精管的切片(section of caudaepididymis and vas deferens)切下并放置于中心孔培养皿(center-well dish)中，其含有补充以IOmg mL—1牛血清白蛋白(BSA) (Sigma, StLouis, MO)的 300 μ L的Human Tubal Fluid (HTF)(Irvine Scientific, Santa Ana, CA)。在解剖显微镜下，在以一对镊子固定附睾，同时在附睾的远端部分做切口以使得精子流出。通过以胰岛素针(insulin needle)将器官稳定并以一对镊子从一端至另一端缓慢移动而将精子推出。然后将培养皿置于培养箱(37°C，5%C02)中10分钟以允许所有精子游出附睾。将附睾、输精管、和较大的碎片(larger pieces of debris)人工提取并丢弃。
[0106]将精子悬液置于0.5mL Eppendorf试管中，并向顶部添加一层薄的无菌胚胎测试的矿物油(sterile embryo tested mineral oil) (Sigma, St Louis, MO)以在允许气体迁移(gas transfer)的同时防止蒸发。然后将打开的试管置于37°C的培养箱中30分钟以获能(capacitation)。在获能后,温和敲击试管以混合精子悬液。
[0107]将获能精子的10 μ L样品移液至新的Eppendorf试管中并置于60°C水浴中以获得用于使用 Mak丨CiW Counting Chamber (Sef1-Medical Instruments, Haifa,以色列)计数的死亡精子样品。将剩余精子悬液在HTF-BSA介质中调节至小于5000精子/ μ L的浓度，并用于下面实施例中所描述的实验。特别地，引入微流体芯片中的精子的浓度在1500-4000精子/ U L的范围间，其如使用ImagePro软件(Media Cybernetics, Inc., MD)的图像分析所确认。
[0108]在下面的一些实施例中，在引入微流体芯片之前，使用向上游动法将精子预分选。在精子提取之后，将40 μ L的新鲜HTF/BSA介质添加至0.5mLEppendorf试管中的精子悬液顶部，并将一层薄的无菌胚胎测试的矿物油置于介质顶部。将试管放置于37°C的温育箱中
1.5小时以允许精子分离。将从Eppendorf试管顶部收回的精子引入微流体芯片中。
[0109]实施例2-高游动性精子的分选
[0110]为了展示微流体芯片基于游动性分选精子的能力，将在入口和出口处的精子游动性与未分选精子的精子游动性比较，所述比较基于使用光学显微镜获得的系列图像。该分选测试使用了具有以下参数的微流体芯片:通道长度7mm、通道宽度4mm、通道高度50 μ m、入口直径0.65_、和出口直径2_。设计较大的出口直径以容易地将精子从通道提取。
[0111]将通道装有含IOmg IIir1BSA的新鲜HTF介质。将出口通道装有2 μ L的HTF/BSA介质且在顶部置有一层薄矿物油以避免蒸发。在获能后移去IuL获能的精子并添加至入口。将微流体芯片置于37°C的培养箱中30分钟。在温育期结束时，使用带有IOx物镜的显微镜(TE2000;Nikon,日本)以每0.4-1秒一中贞的速率使用Spot软件(Diagnostic Instruments, Inc., version4.6, Sterling Heights, MI)在入口和出口二者处的 1.2mm x0.9mm区域摄取20张连续图像。为了验证，将在多个通道位置处的显微镜分析与通道的CXD分析比较。
[0112]基于连续显微镜图像，将在入口和出口处随机选择的精子的精子计数和游动性彼此比较、与预分选的对照样品比较、和与未分选的精子比较。定量了定义精子游动性的运动学参数(kinematic parameter)，包括平均途径速率(VAP)、直线速率(VSL)、和直线性(VSL/VAP)。VAP定义为在观察时间期间在精子的平均运动方向上沿精子所经过的距离的速率，而VSL定义为沿精子的轨迹的起始点和终点之间直线距离的速率。仅追踪了显示游动性的精子，虽然也观察了非游动精子。
[0113]参考图4，分选后，在出口处的精子的游动性(即VAP和VSL)比未分选的精子和在入口处的精子显著更高，(p〈0.01;n=33-66;括弧指示组之间具有p〈0.01的统计学显著性)。
[0114]分选测试的结果指示微流体芯片可以成功地分选最具游动性的精子，在分选过程完成后可以，例如通过剥离器尖端或通过从入口泵入介质，将其在出口处收集。此外，考虑到甚至在分选之后的较广范围的精子速率，基于单芯片的处理和监测可以使得能够使用垂直或水平配置而分离最高品质的游动精子。
[0115]实施例3-通道朝向对于精子分选的效果
[0116]为了确定通道朝向对精子游动性的效果，记录了水平和垂直通道朝向二者中的精子运动。通道具有7mm的长度、4mm的宽度、50 μ m的高度。通道装有补充以IOmg mL^BSA的新鲜HTF介质。如以上所描述的将I μ L精子样品从向上游动柱的最顶端取出并移液进通道的入口中。使用无透镜的CCD传感器，以每秒一帧的速率记录了十五张连续的阴影图像。(XD传感器覆盖了整个通道使得记录了通道中的所有精子。使用Photoshop (Adobe, SanJose, CA)鉴定并追踪了游动精子。
[0117]为了对垂直配置的精子成像，将微流体芯片夹在CXD传感器上并将整个系统旋转90度。当微流体芯片垂直放置后，使用来自相同雄性供体小鼠的精子重复上述的制备和成像步骤，在成像期间将系统保持垂直朝向。
[0118]对随机选自每种配置的十个精子进行了游动性分析。特别地，记录了以水平和垂直朝向二者的精子运动，并将结果在祀心图中作为游动性向量(motility vector)显示,如分别在图5A和5B中所显示的。相邻同心圆之间的距离是ΙΟΟμπι。在两种配置中，精子都展不了运动式样和方向上的很大的多样性。
[0119]为了进一步表征水平和垂直朝向的精子运动，追踪了了精子运动途径并且使用ImagePro软件(Media Cybernetics, Inc., MD)测量了移动距离。定量了定义精子游动性的运动学参数，包括平均途径速率(VAP)、直线速率(VSL)、和直线性(VSL/VAP)。仅追踪了显示了游动的精子，虽然也观察了非游动精子。
[0120]参考表1，对于 所选的十个水平和垂直精子每一个都定量了 VAP、VSL、和直线性。如可见，精子细胞H2和H9显示了水平配置中最高的游动性，且精子细胞Vl和V2显示了垂直配置中最高的游动性。
[0121]表1.所选的精子的精子游动性
【权利要求】
1.一种用于分选游动细胞的方法，其包括: 将游动细胞的初始群体引入微流体通道的入口中，其中所述游动细胞的初始群体具有第一平均游动性； 在所述微流体通道中温育所述游动细胞的群体；和 在微流体通道的出口处收集游动细胞的分选的群体，其中所述游动细胞的分选的群体具有高于第一平均游动性的第二平均游动性。
2.权利要求1的方法，进一步包括使所述微流体通道朝向水平或垂直方向。
3.权利要求1的方法，其中温育所述游动细胞的群体包括在没有流动介质的情况下温育。
4.权利要求1的方法，其中温育所述游动细胞的群体包括以足以允许游动细胞的初始群体的部分沿微流体通道移动的时间温育所述游动细胞的群体，例如，温育大约20-60分钟，或大约30分钟。
5.权利要求1的方法，其中所述微流体通道的高度小于大约所述游动细胞的尺寸的大约20倍，例如，所述游动细胞的尺寸的大约3至10倍。
6.权利要求1的方法，进一步包括确定所述第二平均游动性，其包括: 获得在出口附近的游动细胞的可收集的群体的多张图像，例如，阴影图像，所述游动细胞的可收集的群体包括游动细胞的分选的群体；和分析所述多张图像。
7.权利要求1的方法，` 其中引入游动细胞的初始群体包括以至少大约IO3精子/y L的浓度，例如，以至少大约IO4精子/ μ L的浓度在介质中悬浮精子的初始群体，和 其中介质中的游动细胞的分选的群体的浓度小于或等于大约1.6χ103精子/ μ L。
8.一种用于分析游动细胞的群体的方法，其包括: 将游动细胞的初始群体引入微流体通道的入口； 在所述微流体通道中温育所述游动细胞的群体； 获得所述微流体通道内的所述游动细胞的群体的至少一部分的多张图像；和 基于所述多张图像而确定所述游动细胞的群体的至少一部分的特征。
9.权利要求8的方法，其中所述确定的特征包括游动性、平均途径速率(VAP)、直线速率(VSL)、或直线性的至少一种。
10.权利要求8的方法，其中所测定的特征包括以下的至少一种: (1)位于所述微流体通道的出口附近的游动细胞的分选的群体的特征，和 (2)游动细胞的群体沿微流体通道长度的分布。
11.权利要求8的方法，其中确定特征包括将位于微流体通道的出口附近的游动细胞的分选的群体的特征与以下之一或二者相比较: (1)游动细胞的初始群体的特征，和 (2)在温育后的位于入口附近的游动细胞的剩余的群体的特征。
12.权利要求8的方法，进一步包括基于确定的特征而确定游动细胞的初始群体的健康性。
13.权利要求8的方法，其中温育游动细胞的群体包括在没有流动介质的情况下以足以允许精子的初始群体的部分沿微流体通道移动的时间温育，例如，大约20-60分钟，或大约30分钟。
14.权利要求8的方法，其中所述微流体通道的高度小于所述游动细胞的尺寸的大约20倍，例如，所述游动细胞的尺寸的大约3至10倍。
15.用于分选游动细胞的装置，其包含: 微通道，选择微流体通道的高度以使其小于游动细胞的尺寸的大约二十倍； 入口，其连接至微流体通道的第一端并且经过配置以接受具有第一平均游动性的游动细胞的初始群体； 出口，其连接至微流体通道的第二端； 其中所述微流体通道经配置以在第二端提供所述游动细胞的分选的群体而无需微通道中的流体流动，游动细胞的分选的群体具有高于第一平均游动性的第二平均游动性。
16.权利要求15的装置，其中选择所述微流体通道的高度为游动细胞的尺寸的大约三至十倍，例如，小于大约200 μ m,例如，小于大约60 μ m,例如，大约3-20 μ m。
17.权利要求15的装置，其中部分基于游动细胞在通道中的温育时间和游动细胞的速度的至少之一而选择所述微流体通道的长度，例如，所述长度小于大约20_，例如，大约12-15mm。
18.权利要求15的 装置，其中所述微流体具有矩形横截面、梯形横截面、三角形横截面、圆形或椭圆形横截面、沿所述微通道的长度而变化的横截面、或有脊的横截面。
19.权利要求15的装置，其中所述微流体通道是线性或弯曲的。
20.权利要求15的装置，还包括成像系统，所述成像系统经配置以捕获微流体通道的至少部分的多张图像，所述成像系统包含: 光源，其经配置以照亮所述微流体通道的至少部分；和 检测器，其经配置以检测微流体通道的被照亮部分中游动细胞的图像，例如，阴影图像。
21.权利要求20的装置，还包含分析模块，所述分析模块经配置以基于所捕获的图像而确定微流体通道的成像部分中游动细胞的特征。
【文档编号】G01N21/00GK103781916SQ201280035984
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年5月18日 优先权日:2011年5月20日
【发明者】U.德米尔西, X.张, E.卡亚尔普, H.萨法伊, S.塔索格鲁 申请人:布里格姆及妇女医院股份有限公司