检测莱姆病抗体的肽和方法
【专利摘要】本发明公开了可用于检测结合疏螺旋体属抗原的抗体的组合物(例如肽组合物)。所述肽组合物包含多肽序列，其包含疏螺旋体属VlsE蛋白质的IR6结构域中的变体。本发明还提供了包含这种肽组合物及可用于检测结合疏螺旋体属抗原的抗体和诊断莱姆病的装置、方法和试剂盒。
【专利说明】检测莱姆病抗体的肽和方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求2011年11月4日申请的美国临时申请N0.61/556，061的优先权，该申请全文并入本文作参考。
[0003]电子递交文本文件的描述
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[0005]发明背景
[0006]莱姆病是一种导致人体虚弱的病症，已经成为重要的公共卫生健康问题。该疾病是由于感染病原性疏螺旋体属(Borrelia)细菌(螺旋菌)所致，并且通过疏螺旋体属各物种感染的硬蜱虫(Ixodes ticks)叮咬传播。莱姆病的精确及早期检测对于有效治疗是关键因素。足以诊断莱姆 病的唯一临床症状是存在游走性红斑，具有牛眼状(bulls-eye)特殊外观的皮疹。然而，游走性红斑仅存在于感染早期，甚至不是在所有感染的个体中均出现。在不存在游走性红斑的情况中，与莱姆病相关的其它临床症状如Bell’ s麻痹单独或者组合均不能足够特异性地确定临床诊断。
[0007]在不存在游走性红斑的情况中，诊断莱姆病的基础是应答病原性疏螺旋体物种如伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelli)或者伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii)的抗体。在北美洲,疾病控制中心(X^DC)推荐一种两级(two-tier)方法对莱姆病进行血清学诊断，包括灵敏的第一级测定如ELISA，随后如果第一级测定是阳性或者意义不明的则进行western印迹。第一级测定传统上使用全细胞伯氏疏螺旋体属抗原或者重组疏螺旋体属蛋白质。但是这种测定可能难以解释，并且由于产生自接种而非感染的疏螺旋体属抗体而复杂化。此外，在一些疏螺旋体属测定中使用的全细胞超声降解物与密螺旋体属(Treponema)抗体反应。
[0008]最近,基于疏螺旋体属的可变表面抗原(VlsE)的保守IR6结构域的C6肽测定已经被广泛接受作为第一级测定，其对于传播性和末期莱姆病具有高度灵敏性。所述C6肽测定使用伯氏疏螺旋体VlsE蛋白的单独25个氨基酸的序列作为检测抗原。尽管已经建议C6肽测定可适用于单一级别方法诊断莱姆病，但是显然C6测定对于这种目的不够灵敏，因为其不能检测某些感染性疏螺旋体属菌株。
[0009]因此，本领域仍需要另外的检测疏螺旋体属抗原的测定及莱姆病的血清学诊断方法。
[0010]发明概述
[0011]本发明部分基于发现疏螺旋体属VlsE蛋白质的IR6结构域中某些序列变体可以提供针对广泛疏螺旋体属物种的抗体应答的强力(robust)检测。因此，本发明提供了可用于检测结合疏螺旋体属抗原的抗体及诊断莱姆病的组合物、装置、方法和试剂盒。
[0012]一方面，本发明提供了能结合识别疏螺旋体属抗原的抗体的肽。在某些实施方案中，所述肽包含VlsE IR6结构域及来自至少一种(如两种、三种等)其它疏螺旋体属抗原的序列。在某些实施方案中，所述至少一种其它疏螺旋体属抗原是表面抗原(例如0spC、p41或者其组合)。
[0013]在某些实施方案中，本发明的肽包含序列SEQ ID NO:1, L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-X11-V-L-R-G-X16-X17-K-D-G-X21-F-A-X24-X25 (SEQ ID NO:1)，其中 X11 是选自 V 和 L 的氨基酸，X16是选自L和I的氨基酸，X17是选自A和V的氨基酸，X21是选自R、D和N的氨基酸，X24是选自1、W和Y的氨基酸，X25是选自K和R的氨基酸。
[0014]在某些实施方案中，本发明的肽包含序列SEQ IDN0:1,及进一步包含另外的N-末端肽序列。所述另外的N-末端肽序列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多个氨基酸，可以是天然或非天然序列。在某些实施方案中，本发明的肽包含由SEQ ID NO:1定义的序列，及进一步包 含另外的C-末端序列。所述另外的C-末端肽序列可包含1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10或者更多个氨基酸，可以是天然或非天然序列。在某些实施方案中，所述非天然序列包含非-VlsE疏螺旋体属抗原(例如疏螺旋体属OspC或p41抗原)。
[0015]在其它实施方案中，本发明的肽包含序列SEQ ID NO:2，nrn2-S-P-n5-n6-P-L-K-K-D_D_N_I_A_A_A_X18_V_L_R_G_X23_X24_K_D_G_X28_F_A_X31_X32_A_V_c35_E_G_c38_Q_Q_E_G_A_Q_Q-P-S-C(SEQ ID NO: 2)，其中II1是选自A和V的氨基酸，n2是选自E和D的氨基酸，n5是选自K和R的氨基酸，n6是选自K和R的氨基酸，X18是选自V和L的氨基酸，X23是选自L和I的氨基酸，X24是选自A和V的氨基酸，X28是选自R、D和N的氨基酸，X31是选自1、W和Y的氨基酸，X32是选自K和R的氨基酸，C35是选自Q和R的氨基酸，C38是选自V和A的氨基酸。
[0016]在某些实施方案中，本发明的肽包含至少25、30、35、40、45或者更多个氨基酸。在某些实施方案中，本发明的肽是分离的(例如合成的和/或纯化的)肽。在某些实施方案中，本发明的肽与配体缀合。例如，在某些实施方案中，所述肽是生物素化的。在其它实施方案中，所述肽与抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或者亲和素(neutravidin)缀合。在其它实施方案中，所述肽与载体蛋白(例如血清白蛋白，匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)或者免疫球蛋白Fe结构域)缀合。在其它的实施方案中，所述肽与树状聚合物和/或多抗原性肽系统(MAPS)的一部分缀合。
[0017]在某些实施方案中，本发明的肽附着于或固定于固体支持物。在某些实施方案中，所述固体支持物是珠(例如胶体颗粒，纳米颗粒，胶乳珠等)、侧向流免疫测定装置中的流动通道(flow path)(例如多孔膜)、分析转子中的流动通道，或者管或孔(例如适于ELISA测定的平板)。
[0018]另一方面，本发明提供了包含本发明的一或多种肽的组合物。例如，在某些实施方案中，本发明提供了包含含有SEQ ID NO:1所示序列的肽、含有SEQ ID NO: 2所示序列的肽或者其混合物的组合物。在某些实施方案中，所述组合物包含2、3、4或更多种本发明的不同的肽的混合物，其中每种肽均包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2。
[0019]在某些实施方案中，所述肽与配体或信号部分缀合。例如，在某些实施方案中，所述肽是生物素化的。在其它实施方案中，所述肽与抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或者亲和素缀合。在其它实施方案中，所述肽与载体蛋白(例如血清白蛋白、匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)或者免疫球蛋白Fe结构域)缀合。在其它的实施方案中，所述肽与树状聚合物和/或多抗原性肽系统(MAPS)的一部分缀合。[0020]另一方面，本发明提供了包含编码本发明的肽的序列的核酸。此外，本发明提供了包含这种核酸的载体，及包含这种载体的宿主细胞。在某些实施方案中，所述载体是穿梭载体。在其它实施方案中，所述载体是表达载体(例如细菌或真核表达载体)。在某些实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞。在其它实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。
[0021]另一方面，本发明提供了装置。在某些实施方案中，所述装置可用于进行免疫测定。例如，在某些实施方案中，所述装置是侧向流免疫测定装置。在其它实施方案中，所述装置是分析转子。在其它实施方案中，所述装置是管或孔，如在适于ELISA测定的平板中。在其它的实施方案中，所述装置是电化学、光学或者光电传感器。
[0022]在某些实施方案中，所述装置包含本发明的肽。在其它实施方案中，所述装置包含本发明的不同肽的混合物。例如，在某些实施方案中，所述装置包含2、3、4或更多种不同的本发明的肽。在某些实施方案中，所述肽或者所述混合物中的每种肽均包含序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 2。在某些实施方案中，所述肽附着于或固定于所述装置上。
[0023]另一方面，本发明提供了检测样品中疏螺旋体属抗原表位的抗体的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将样品与本发明的肽接触，并检测包含所述肽的抗体-肽复合物的形成，其中所述复合物的形成是所述样品中存在疏螺旋体属抗原表位的抗体的指征。在某些实施方案中，所述疏螺旋体属抗原来自感染性疏螺旋体属物种如伯氏疏螺旋体、阿氏疏螺旋体或者伽氏疏螺旋体。在某些实施方案中，所述方法包括将样品与2、3、4或更多种不同的本发明的肽的混合物接触。
[0024]在某些实施 方案中，所述肽或者所述混合物中的每种肽均是分离的(例如合成的和/或纯化的)肽。在某些实施方案中，所述肽或肽混合物附着于或固定于固体支持物上。在某些实施方案中，所述固体支持物是珠(例如胶体颗粒，纳米颗粒，胶乳珠等)，侧向流免疫测定装置中的流动通道(例如多孔膜)，分析转子中的流动通道，或者管或孔(如在适于ELISA测定的平板中)。在某些实施方案中，所述固体支持物包括金属、玻璃、基于纤维素的材料(例如硝化纤维素)或者聚合物(例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、尼龙、聚砜等)。在某些实施方案中，所述肽或者不同肽的混合物附着于树状聚合物和/或掺入MAPS系统中。在某些其它实施方案中，所述肽或不同肽的混合物附着于BSA。
[0025]在某些实施方案中，检测步骤包括进行ELISA测定。在其它实施方案中，检测步骤包括进行侧向流免疫测定。在其它实施方案中，所述检测步骤包括进行凝集反应测定。在其它实施方案中，所述检测步骤包括将样品在分析转子中旋转。在其它实施方案中，所述检测步骤包括使用Western印迹、狭线印迹或者斑点印迹分析样品。在其它的实施方案中，所述检测步骤包括用电化学传感器、光学传感器或者光电传感器分析样品。
[0026]在某些实施方案中，所述样品是体液，如血液、血清、血浆、脑脊液、尿液、粘液或者唾液。在其它实施方案中，所述样品是组织(例如组织匀浆)或者细胞裂解物。在某些实施方案中，所述样品来自野生动物(例如鹿，或者啮齿类动物如小鼠、金花鼠、松鼠等)。在其它实施方案中，所述样品来自实验室动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴、灵长目动物等)。在其它实施方案中，所述样品来自驯养动物或者野化动物(feral animal)(例如狗、猫、马)。在其它的实施方案中，所述样品来自人。
[0027]另一方面，本发明提供了诊断对象中莱姆病的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将来自对象的样品与本发明的肽接触，并检测包含所述肽的抗体-肽复合物的形成，其中所述复合物的形成是对象患有莱姆病的指征。在某些实施方案中，所述方法包括将所述样品与2、3、4或更多种不同的本发明的肽的混合物接触。
[0028]在某些实施方案中，所述肽或所述混合物中的每种肽均是分离的(例如合成的和/或纯化的)肽。在某些实施方案中，所述肽或者不同肽的混合物附着于或固定于固体支持物上。例如，在某些实施方案中，所述固体支持物是珠(例如胶体颗粒，纳米颗粒，胶乳珠等)、侧向流免疫测定装置中的流动通道(例如多孔膜)、分析转子中的流动通道、或者管或孔(例如在适于ELISA测定的平板中)。在某些实施方案中，所述固体支持物包含金属、玻璃、基于纤维素的材料(例如硝化纤维素)或者聚合物(例如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚砜等)。在某些实施方案中，所述肽或者不同肽的混合物附着于树状聚合物和/或掺入MAPS系统中。在某些其它实施方案中，所述肽或者不同肽的混合物附着于BSA。
[0029]在某些实施方案中，所述检测步骤包括进行ELISA测定。在其它实施方案中，所述检测步骤包括进行侧向流免疫测定。在其它实施方案中，所述检测步骤包括进行凝集反应测定。在其它实施方案中，所述检测步骤包括将样品在分析转子中旋转。在其它实施方案中，所述检测步骤包括使用Western印迹、狭线印迹或者斑点印迹分析样品。在其它的实施方案中，所述检测步骤包括用电化学传感器、光学传感器或者光电传感器分析样品。
[0030]在某些实施方案中，所述样品是体液，如血液、血清、血浆、脑脊液、尿液或者唾液。在其它实施方案中，所述样品是组织(例如组织匀浆)或细胞裂解物。在某些实施方案中，所述对象是野生动物(例如鹿，或者啮齿类动物如小鼠、金花鼠、松鼠等)。在其它实施方案中，所述对象是实验室动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猴、灵长目动物等)。在其它实施方案中，所述对象是驯养动物或野化动物(feral animal)(例如狗、猫、马)。在其它的实施方案中，所述对象是人。
[0031]再一方面，本发明提供了试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含本发明的肽。在某些实施方案中，所述试剂盒包含2、3、4或更多种不同的本发明的肽。所述肽可包含序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2。在某些实施方案中，所述肽附着于或者固定于固体支持物上。例如，在某些实施方案中，所述固体支持物是珠(例如胶体颗粒、纳米颗粒、胶乳珠等)、侧向流免疫测定装置中的流动通道、分析转子中的流动通道，或者管或孔(例如在平板中)。在某些实施方案中，所述肽或者不同肽的混合物附着于树状聚合物和/或掺入MAPS系统中。在某些其它实施方案中，所述肽或者不同肽的混合物附着于BSA。
[0032]在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含一群珠或包含平板(例如适于ELISA测定的平板)。在其它实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种装置，如侧向流免疫测定装置、分析转子、Western印迹、斑点印迹、狭线印迹、电化学传感器、光学传感器，或者光电传感器。在某些实施方案中，所述一群珠、平板或者装置可用于进行免疫测定。例如，在某些实施方案中，所述一群珠、平板或者装置可用于检测抗体-肽复合物的形成，所述复合物包含来自样品的抗体和本发明的肽。在某些实施方案中，本发明的肽或者不同肽的混合物附着于或者固定于珠、平板或装置上。
[0033] 在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含说明书。例如，在某些实施方案中，所述试剂盒包含表明怎样使用本发明的肽检测疏螺旋体属抗原的抗体或者诊断莱姆病的说明书。在某些实施方案中，所述试剂盒包含表明怎样使用一群珠、平板或装置(例如包含本发明的肽或不同肽的混合物)检测疏螺旋体属抗原的抗体或者诊断莱姆病的说明书。[0034]本发明的其它方面和实施方案通过如下详细描述将显而易见。
[0035]附图简述
[0036]图1是间接夹心测定的示意图，其可用于检测疏螺旋体属抗原的抗体。在这个实施方案中，抗-人IgG/IgM或抗-狗IgG/IgM抗体固定于合适基质(例如硝化纤维素膜)的测试位点。检测样品中的抗体由固定的抗体结合。然后针对合适的疏螺旋体属抗原的检测样品抗体将结合本发明的肽。当本发明的肽与生物素缀合时，可使用胶体金标记的链霉抗生物素蛋白检测在测试位点上所述肽的存在。可意识到所述间接夹心测定可以反向操作，即本发明的肽可固定在基质上以捕获检测样品中的抗-疏螺旋体属抗体，及与标记(如胶体金)缀合的抗-人IgG/IgM或抗-狗IgG/IgM抗体可用于检测在测试位点上与固定的肽结合的抗体的存在。
[0037]图2是基于图1的间接夹心测定的侧向流免疫测定装置的示意图。在侧向流免疫测定装置的这个实施方案中，将样品应用于样品加样垫，然后流经缀合物垫至测试膜。肽-生物素-链霉抗生物素蛋白-金复合物随着样品经过缀合物垫而溶解，然后在本发明的肽与合适的抗疏螺旋体属抗原抗体之间形成复合物。所述测试位点包含样品合适的抗-1gG或抗-1gM抗体，其结合样品中所有抗体。例如，蛋白质L可用于代替抗-1gG或抗-1gM抗体。如果样品中足够的抗体结合本发明的肽，则在测试位点将出现阳性信号。在侧向流免疫测定装置的另一实施方案中，本发明的肽固定在测试位点(T)，与可检测标记(例如胶体金颗粒)缀合的样品合适的抗-1gG或抗-1gM抗体(例如抗-人或抗-狗)存在于缀合物垫中。样品经过缀合物垫使得标记的抗体溶解，检测样品中存在的任何抗-疏螺旋体属抗原抗体结合标记的抗体，这种抗体复合物被在测试位点上的固定的本发明疏螺旋体属肽捕获，从而 产生阳性信号。在任一实施方案中，所述装置可进一步包含对照位点(C)，在此固定识别缀合物垫中标记的肽或标记的抗体的结合配偶体。
[0038]图3是双抗原夹心测定的示意图，其可用于检测疏螺旋体属抗原的抗体。在这个实施方案中，本发明的肽在测试位点固定在合适的基质上(例如硝化纤维素膜，ELISA平板的孔)。检测样品中的抗体由固定的本发明的肽结合。然后合适的疏螺旋体属抗原的检测样品抗体将结合与检测分子(例如胶体金，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(ALP))缀合的第二组本发明的肽，其检测与在测试位点固定的第一组肽结合的抗体的存在。
[0039]图4是侧向流免疫测定装置的示意图，其可用于检测疏螺旋体属抗原的抗体。在侧向流免疫测定的这个实施方案中，本发明的肽在测试位点固定在合适基质上(例如硝化纤维素膜)。检测样品中抗-疏螺旋体属抗体由固定的本发明的肽结合。在该系统中加入金-缀合的蛋白质A和/或金缀合的蛋白质G，其结合捕获的抗-疏螺旋体属抗体的Fe部分，从而产生阳性信号。在这个实施方案中，所述装置可进一步包含对照位点，在此固定了识别金-缀合的蛋白质A和/或金-缀合的蛋白质G的结合配偶体。这种结合配偶体可包括但不限于抗-蛋白质A、抗-蛋白质G、小鼠IgGjP /或其它相似的IgG分子。
[0040]图5是侧向流免疫测定装置的示意图，其可用于检测疏螺旋体属抗原的抗体。在侧向流免疫测定装置的这个实施方案中，本发明的肽在测试位点固定在合适基质上(例如硝化纤维素膜)。检测样品中抗-疏螺旋体属抗体由固定的本发明的肽结合。抗-疏螺旋体属抗体可以由本发明的金-缀合的肽检测，从而产生阳性信号。在这个系统中加入金-缀合的蛋白质A和/或金缀合的蛋白质G，以通过结合捕获的抗-疏螺旋体属抗体的Fe部分而增强信号。在这个实施方案中，所述装置可进一步包含对照位点，在此固定了识别金-缀合的蛋白质A和/或金-缀合的蛋白质G的结合配偶体。这种结合配偶体可包括但不限于抗-蛋白质A、抗-蛋白质G、小鼠IgGjP /或其它相似的IgG分子。
[0041]发明详述
[0042]如本文所用，如下术语应具有如下含义:
[0043]如本文所用，术语“抗原”是指能由抗体识别的分子。抗原可以是例如肽或者其修饰形式。抗原可包含一或多个表位。
[0044]如本文所用，术语“表位”是抗原的一部分，其由抗体特异性识别。例如，表位可包含或者由肽(如本发明的肽)的一部分组成。表位可以是线性表位、顺序表位或者构象表位。在某些实施方案中，表位可包含非连续区域。
[0045]术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文可互换使用，涵盖了 DNA、RNA、cDNA，无论单链还是双链的，以及其化学修饰形式。
[0046]本文使用的单个字母氨基酸缩写具有其在本领域中的标准含义，本文中描述的所有肽序列均根据惯例书写，N-末端在左侧，C末端在右侧。
[0047]根据需要，其它术语在如下详细描述中定义。
[0048]组合物和装置
[0049]本发明部分基于发现疏螺旋体属VlsE蛋白的IR6结构域中某些序列变体提供针对广泛疏螺旋体属物种的抗体应答的强力检测。因此，一方面，本发明提供了能结合识别疏螺旋体属抗原的抗体的肽。
[0050]在某些实施方案中，本发明的肽包含VlsE IR6结构域或者其片段及来自至少一种(例如2、3种等)其它疏螺旋体属抗原的序列(例如包含表位的序列)。在某些实施方案中，所述至少一种其它疏螺旋体属抗原是表面抗原或者是选自OspA、OspB、OspC、p41及其组合的抗原。因此，例如在某些实施方案中，本发明的肽包含:(i)VlsE IR6结构域，或者其片段，及Qi)包含OspA蛋白的表位的序列,包含OspB蛋白的表位的序列,包含OspC蛋白的表位的序列，包含P41蛋白的表位的序列，或者这些序列的组合。在其它实施方案中，本发明的肽包含:(i) VlsE IR6结构域，或者其片段，(ii)包含OspC蛋白的表位的序列，及(iii)包含p41蛋白的表位的序列。
[0051 ] 在某些实施方案中，本发明的肽包含或者由SEQ ID NO:1所示序列L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-X11-V-L-R-G-X16-X17-K-D-G-X21-F-A-X24-X25 (SEQ ID NO:1)组成，其中 X11 是选自 V 和L的氨基酸，X16是选自L和I的氨基酸，X17是选自A和V的氨基酸，X21是选自R、D和N的氨基酸，X24是选自1、W和Y的氨基酸，X25是选自K和R的氨基酸。
[0052]在某些实施方案中，本发明的肽包含或者由如下序列组成:L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-V-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-1-K(SEQ ID NO:3) ；L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-1-K(SEQ ID NO:4) ；L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-V-V-L-R-G-1-A-K-D-G-R-F-A-1-K(SEQ ID NO:5) ；L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-L-V-L-R-G-1-A-K-D-G-R-F-A-1-K(SEQ ID NO:6) ；L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-V-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-1-K(SEQ ID NO:7) ；L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-1-K(SEQ ID NO:8) ；L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-V-V-L-R-G-1-V-K-D-G-R-F-A-1-K(SEQ ID NO:9) ；L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-L-V-L-R-G-1-V-K-D-G-R-F-A-1-K(SEQ ID NO:10) ；L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-V-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-1-K (SEQ ID
【权利要求】
1.分离的肽，其包含序列L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-X11-V-L-R-G-X16-X17-K-D-G-X21-F-A-X24-X25 (SEQ ID NO:1)，其中X11是选自V和L的氨基酸，X16是选自L和I的氨基酸，X17是选自A和V的氨基酸，X21是选自R、D和N的氨基酸，X24是选自1、W和Y的氨基酸，以及X25是选自K和R的氨基酸。
2.权利要求1的分离的肽，其包含另外的N末端肽序列，其中所述另外的N末端肽序列是天然VlsE序列或者非-VlsE疏螺旋体属抗原。
3.权利要求2的分离的肽，其中所述另外的N末端肽序列是序列nrn2-S-P-n5-n6-P(SEQ ID NO:149)或者其片段，其中Ii1是选自A和V的氨基酸，n2是选自E和D的氨基酸，n5是选自K和R的氨基酸，以及n6是选自K和R的氨基酸。
4.权利要求1的分离的肽，其包含另外的C末端肽序列，其中所述另外的C末端肽序列是天然VlsE序列或者非-VlsE疏螺旋体属抗原。
5.权利要求4的分离的肽，其中另外的C末端肽序列是序列V-C2-E-G-C5-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S-C (SEQ ID NO: 150)或者其片段，其中C2是选自Q和R的氨基酸，以及C5是选自V和A的氨基酸。
6.权利要求4的分离的肽，其中另外的C末端肽序列是序列A-V-C3-E-G-C6-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S (SEQ ID NO: 151)或者其片段，其中C3是选自Q和R的氨基酸，以及C6是选自V和A的氨基酸。
7.权利要求1的分离的肽，其包含至少30、35、40或45个氨基酸。
8.权利要求1的分离 的肽，其中所述分离的肽与配体缀合。
9.权利要求1的分离的肽，其中所述分离的肽是生物素化的。
10.权利要求1的分离的肽，其中所述分离的肽与链霉抗生物素蛋白缀合。
11.权利要求1的分离的肽，其附着于或者固定于固体支持物。
12.权利要求1的分离的肽，其附着于或者固定于珠、侧向流免疫测定装置中的流动通道、微量滴定板中的孔或者转子中的流动通道。
13.权利要求1的分离的肽，其中所述肽包含选自SEQID NO:3-146的序列。
14.权利要求1的分离的肽,其中所述分离的肽包含来自序列nnS-Pn-P-L-K-K_D_D_N_I_A_A_A_X18_V_L_R_G_X23_X24_K_D_G_X28_F_A_X31_X32_A_V_c35_E_G_c38_Q_Q_E_G_A_Q-Q-P-S-C (SEQ ID NO:2)的至少30、35、40或45个连续氨基酸，其中Ii1是选自A和V的氨基酸，n2是选自E和D的氨基酸，n5是选自K和R的氨基酸，n6是选自K和R的氨基酸，X18是选自V和L的氨基酸，X23是选自L和I的氨基酸，X24是选自A和V的氨基酸，X28是选自R、D和N的氨基酸，X31是选自1、W和Y的氨基酸，X32是选自K和R的氨基酸，C35是选自Q和R的氨基酸，以及C38是选自V和A的氨基酸。
15.包含第一种分离的肽和第二种分离的肽的分离的肽的混合物，其中第一种分离的肽与第二种分离的肽不同，并且其中第一种和第二种分离的肽均包含序列L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-X11-V-L-R-G-X16-X17-K-D-G-X21-F-A-X24-X25 (SEQ ID NO:1)，其中 X11 是选自 V 和 L 的氨基酸，X16是选自L和I的氨基酸，X17是选自A和V的氨基酸，X21是选自R、D和N的氨基酸，X24是选自1、W和Y的氨基酸，以及X25是选自K和R的氨基酸。
16.包含三种或更多种不同的分离的肽的分离的肽的混合物，其中每种分离的肽均包含序列 L_K_K_D_D_N_I_A_A_A_Xn_V_L_R_G_X16_X17_K_D_G_X21_F_A_X24_X25 (SEQ ID NO:1)，其中X11是选自V和L的氨基酸，X16是选自L和I的氨基酸，X17是选自A和V的氨基酸，X21是选自R、D和N的氨基酸，X24是选自1、W和Y的氨基酸，以及X25是选自K和R的氨基酸。
17.权利要求15或16的混合物，其中每种分离的肽均与配体缀合。
18.权利要求15或16的混合物，其中一或多种所述分离的肽是生物素化的。
19.权利要求15或16的混合物，其中一或多种所述分离的肽与链霉抗生物素蛋白缀合。
20.权利要求15或16的混合物，其中每种分离的肽均固定于固体支持物。
21.检测样品中疏螺旋体属抗原表位的抗体的方法，所述方法包括: 将样品与权利要求1的分离的肽接触；及 检测包含所述分离的肽的抗体-肽复合物的形成， 其中所述复合物的形成是所述样品中存在疏螺旋体属抗原表位的抗体的指征。
22.权利要求21的方法，其中所述疏螺旋体属抗原来自伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、阿氏疏螺旋体(Borreliaafzelli)或者伽氏疏螺旋体(Borreliagarinii)物种。
23.权利要求21的方法，其中所述分离的肽固定于固体支持物。
24.权利要求23的方法，其中所述固体支持物是珠、侧向流测定装置中的流动通道、微量滴定板中的孔或者转子中的流动通道。
25.权利要求21的方法，其中所述检测步骤包括(i)进行ELISA测定，(ii)进行侧向流测定，Qii)进行凝集反应测定，Qv)进行Western印迹、狭线印迹或者斑点印迹,或者(v)通过分析转子分析样品。
26.权利要求21的方法，其中所述样品来自人、犬或者马对象。
27.权利要求21的方法，其中所述样品是血液、血清、脑脊液、尿液或者唾液样品。
28.权利要求21的方法，包括将所述样品与权利要求1的两种或更多种分离的肽接触。
29.诊断对象中莱姆病的方法，所述方法包括: 将来自所述对象的样品与权利要求1的分离的肽接触；及 检测包含所述肽的抗体-肽复合物的形成，其中所述复合物的形成是所述对象患有莱姆病的指征。
30.试剂盒，其包含权利要求1的一或多种分离的肽及标记试剂，所述标记试剂能结合识别所述一或多种分离的肽的表位的抗体。
31.权利要求30的试剂盒，其中所述一或多种分离的肽附着于固体支持物。
32.权利要求30的试剂盒，其中所述一或多种分离的肽附着于珠、管或孔、侧向流测定装置或者分析转子。
33.权利要求30的试剂盒，其中所述标记试剂是与可检测标记缀合的抗人或抗犬IgG抗体。
34.权利要求33的试剂盒，其中所述可检测标记是胶体金颗粒。
【文档编号】G01N33/543GK103998459SQ201280062344
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年11月5日 优先权日:2011年11月4日
【发明者】R·K·梅拉, K·P·阿伦, D·M·布莱利, J·沃克, C·奎斯科 申请人:爱贝斯股份有限公司