专利名称：一种检测大白菜中芸苔根肿菌的方法
技术领域：
本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种检测大白菜中芸苔根肿菌的方法。
背景技术：
联合国粮食农业组织将大白菜定位为最重要的二十种蔬菜之一，是重要的食物来源。芸苔根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)是鞭毛菌亚门(Mastigomycotina)中的专性寄生菌，可导致油菜、青菜、芥菜、榨菜等十字花科植物病害-根肿病的产生，芸苔根肿菌也可侵染大白菜，引起大白菜根肿病。根肿病是十字花科作物重要的土传病害，可在植物主根和侧根上形成大小不同、形状不一的肿瘤。根部受害后可影响植物地上部分的生长，使叶色变淡，生长迟缓，矮化，发病严重时可造成植株成片萎蔫和死亡。该病原菌以休眠孢子在土壤中越冬，能够存活10年以上，可经土壤、水流、种子传播，以游动孢子侵入植物的根毛。近年来，根肿病危害逐年加重，我国西南、华中、东北和华东各大种植区都出现过较大规模的流行。根肿病已成为十字花科作物主要病害，危害面积约6000万亩，平均产量损失达209Γ30%，严重田块产量 损失达60%以上，甚至绝收。每年导致油菜经济损失约10亿元、蔬菜经济损失约200亿，极大地制约了油料和蔬菜产业的持续稳定发展及农民增收。对于根肿病的防治，目前尚缺乏高效、低毒、低残留、低成本的化学药剂，而有效控制根肿病的生防制剂数量也很少，并容易受环境条件的影响；在农业防治方面，对根肿病的研究不够系统、全面，存在不少弊端。因此，及早发现病原，掌握根肿病的发病情况对于根肿病的预防、监测、防治至关重要。目前，芸苔根肿菌的检测仍主要依赖于传统的症状观察、病原鉴别，不仅耗时耗力，且常常依赖于人的经验判断，若需准确识别病害并非易事，并且所需的离体植物组织样本量大。聚合酶链式反应(PCR)可对植物样本和土壤样本中的病原菌进行检测,操作方便，在一定程度上简化了芸苔根肿菌的检测，但是需要核酸提取过程，时间较长，且常规PCR诊断常受假阳性和假阴性的影响，重复性和准确性较差，因此，有必要找到一种替代方法来准确判断病原菌存在与否。傅里叶变换红外光谱技术(FT-1R)作为一种测定样品分子结构的工具已经被广泛地应用在化学、农业、生物科学、医药等众多领域，是分析物质结构的有效手段，自20世纪70年代兴起后得到了迅猛的发展。90年代以来，利用FT-1R技术对微生物进行分类、鉴定和检测的研究也悄然兴起。核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物等细胞大分子物质的结构和组成信息可以反映在红外光谱图上。虽然，组成细菌细胞的生化物质基本相同，但是其中的某些功能基团的差异可以成为区分和鉴定不同菌株的基础，以此作为一种鉴定检测微生物的快速无损的新型方法(代群威，董发勤.FTIR技术在几株细菌鉴定的应用[J].西南科技大学学报，2009，24(I):114-117) 0刘刚等利用FT-1R技术成功地鉴别了食用菌的不同种类(刘刚，刘建宏，等.食用菌的傅里叶变换红外光谱鉴定[J].光谱学与分析光谱.2004，24(8):941-945)，区分了同一种食用菌的不同部位以及不同产地，慈云祥等对几种微生物红外光谱进行了比较(慈云祥，臧凯赛，等.几种微生物的红外光谱研究[J].高等学校化学学报，2002,23 ):1047-1049)。目前尚未针对有FT-1R应用于芸苔根肿菌检测的相关报道，
发明内容
本发明提供了一种检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，应用傅里叶变换红外光谱技术，实现了大白菜中芸苔根肿菌的快速、无损、准确的检测。一种检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，包括:(I)取大白菜的根或叶，制成压片；(2)采集所述压片的红外光 谱图；(3)对红外光谱图进行分析:若由根制成压片的红外光谱图在1748.16±0.75cm^\2851.24±0.ΟδαιΓ1和3013.23±0.28cm-1范围中至少一处出现特征峰，则说明大白菜的根感染芸苔根肿菌；若由叶制成压片的红外光谱图在1252.54±0.δΟαιΓ1和1051.98±4.23cm_1范围中至少一处出现特征峰，则说明大白菜的叶感染芸苔根肿菌。病原菌侵染寄主植物后，寄主植物的核酸、蛋白的代谢发生变化，并合成积累一些次生代谢物质、相关酶类等，同时，病原菌自身的物质组成也与寄主植物有差别，这些差别物质的结构和组成信息可以反映在红外光谱图上，形成特征峰。被芸苔根肿菌侵染大白菜的根在1748.16 ±0.75CHT1 (指在1748.16cm_1处左右浮动±0.75CHT1，其他依次类推)、2851.24±0.05cm—1和3013.23±0.28cm—1范围具有特征峰，被芸苔根肿菌侵染大白菜的叶在1252.54±0.50cm_\l051.98±4.23cm_1具有特征峰，而健康大白菜的根或叶在上述任一波段范围并没有特征峰。因此，根据待检测大白菜的根或叶的红外光谱图，观察特征峰，即可确定大白菜的根或叶是否感染芸苔根肿菌。在对由根或叶制成的压片进行红外光谱图的采集时，采集波段范围可以为4000"400cm_1o为使检测速度更快，优选的，若由根制成压片，红外光谱图的采集波段为HOOllOOcnT1 ；若由叶制成压片，红外光谱图的采集波段为ΚΚΚΤΠΟΟαιΓ1。所述红外光谱图可由傅里叶变换红外光谱分析仪进行采集。在红外光谱图采集前，需先制备用于光谱分析的大白菜的根或叶的压片，具体方法为:将大白菜的根或叶冷冻干燥后研磨成粉末，与溴化钾混匀，压制成压片。大白菜的根或叶粉末的粒径影响红外光谱图质量，所述大白菜的根或叶粉末的粒径为小于2 μ m。粒径过大，制备的压片透光性差，散射作用强，易造成红外光谱图基线的漂移，谱带发生畸变。显然的，溴化钾的粒径小于2 μ m。为避免水分对红外光谱分析的影响，混匀前，溴化钾应干燥除水。
所述大白菜的根或叶粉末与溴化钾的重量比为1:10(Γ3:100，优选为1:100。溴化钾可以稀释大白菜的根或叶粉末，并易于压片的压制成型。大白菜的根或叶粉末与溴化钾的重量比维持在适宜的范围，有利于全面的采集特征峰信号，既可防止大白菜的根或叶粉末过多导致的吸收饱和现象，也能避免大白菜的根或叶粉末过少所导致的弱信号的特征峰的丢失。为得到高质量的红外光谱图，所述压片的厚度要均匀一致，一般，所述压片的厚度为 0.5 Imm0采集红外光谱图时，扫描次数为32 128次，优选的，所述扫描次数为32次。适宜的扫描次数可以增强待检测样品在红外区的信息，减弱背景噪声，提高光谱信噪比。采集红外光谱图时，扫描分辨率为0.12512(3!^1,优选的，所述扫描分辨率为4cm-10分辨率过高，扫描速度慢，影响检测速度；分辨率过低，会导致待检测样品信息的丢失，影响检测的准确性。所述红外光谱图的采集过程中，通常需向所述傅里叶变换红外光谱分析仪的样品区连续通入干燥空气，用以驱除水蒸气，避免水蒸气的干扰。与现有技术相比，本发明的有益效果为:本发明检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，应用傅里叶变换红外光谱技术，可快速、无损、准确的检测大白菜中芸苔根肿菌，操作方便，不依赖于人的经验，且安全性、重复性高，为有效的预防和控制大白菜根肿病提供了新的技术手段`。
图1为被芸苔根肿菌感染的大白菜的根在^OO^OOcnT1波段范围的红外光谱图；图2为健康大白菜的根在4000^00(^-1波段范围的红外光谱图；图3为被芸苔根肿菌感染的大白菜的叶在4000300(31^1波段范围的红外光谱图；图4为健康大白菜的叶在4000 50001^波段范围的红外光谱图；图5为大白菜样品Dl、W1、S1和S2基因组PCR扩增电泳图；其中，Marker(DL2000)的大小依次为 IOObp、250bp、500bp、750bp、IOOObp 和2000bp图6为大白菜的根样品Dl在^(ΚΓδΟΟαιΓ1波段范围的红外光谱图；图7为大白菜的根样品Wl在4000^00(^-1波段范围的红外光谱图；图8为大白菜的根样品SI在^(ΚΓδΟΟαιΓ1波段范围的红外光谱图；图9为大白菜的叶样品S2在^(ΚΓδΟΟοπΓ1波段范围的红外光谱图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。实施例1样品的制备大白菜样品采集自中国辽宁省沈阳市下属的新民市。大白菜样品:感染芸苔根肿菌的大白菜的根；健康大白菜的根(指未感染芸苔根肿菌)；
感染芸苔根肿菌的大白菜的叶；健康大白菜的叶(指未感染芸苔根肿菌)。被芸苔根肿菌侵染的大白菜的基本鉴别和判定基于常规的症状观察和特异性PCR实验技术的应用(R.Faggian S.Parsons.Arapid diagnostic test for clubroot [J].Horticulture Australia)。(I)将大白菜样品于_70°C冰冻干燥后，置于研钵中，用研杵研磨成粒径小于2μπι的粉末；(2)将分装在离心管中的溴化钾置于冻干机内干燥，干燥后，取IOOmg溴化钾与Img大白菜样品粉末置于离心管中，混合均匀；(3)将上述的混合物以100kg/cm2 (1200psi)的压力压制约8分钟，制成厚度为
0.5 lmm的薄盘状的压片。实施例2傅里叶变换红外光谱(FTIR)的采集及数据分析用傅里叶变换红外光谱分析仪对实施例1制备的压片进行扫描，获取大白菜样品的红外光谱，比较分析芸苔根肿菌感染的大白菜样品与健康大白菜样品的红外光谱。扫描过程中，向傅里叶红外光谱分析仪内的样品区连续的通入干燥空气，以驱赶水蒸气。红外光谱扫描条件如下:温度:室温(25°C )；扫描范围:4000 50001 1-1；
分辨率McnT1 ;扫描次数:100次。红外光谱数据的分析由Grams32@ 软件(Galactic Industries, Salem, NH, USA)分析后获得，分析光谱范围即4000100(^-1区段。吸收峰的位置由样品重量的中心点确定，光谱分析得到的平均值是基于平行性试验、基线校准、数据正常化，在此基础上通过同一软件可测得吸收峰的光谱范围。光谱分析的均值以及正常化的调整虽然只能从视觉表征上给出差异，但是光谱的各项参数、均值的计算、统计分析、基线校准等因素均会被考虑在内。表I受芸苔根肿菌感染与健康大白菜的根样品(n=3)的主要吸收峰比较
权利要求
1.一种检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，其特征在于，包括: (1)取大白菜的根或叶，制成压片； (2)采集所述压片的红外光谱图； (3)对红外光谱图进行分析: 若由根制成压片的红外光谱图在1748.16±0.75cm^\2851.24±0.ΟδαιΓ1和3013.23±0.28cm-1范围中至少一处出现特征峰，则说明大白菜的根感染芸苔根肿菌； 若由叶制成压片的红外光谱图在1252.54±0.50CHT1和1051.98±4.23CHT1范围中至少一处出现特征峰，则说明大白菜的叶感染芸苔根肿菌。
2.如权利要求1所述的检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，其特征在于，所述压片的制备方法为:将大白菜的根或叶冷冻干燥后研磨成粉末，与溴化钾混匀，压制成压片。
3.如权利要求2所述的检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，其特征在于，所述大白菜的根或叶粉末的粒径小于2 μ m。
4.如权利要求2所述的检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，其特征在于，所述大白菜的根或叶粉末与溴化钾的重量比为1:100~3:100。
5.如权利要求2所述的检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，其特征在于，所述压片的厚度为0.5 1mm。
6.如权利要求1所述的检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，其特征在于，所述红外光谱图的采集波段为4000~400-1'
7.如权利要求6所述的检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，其特征在于， 若由根制成压片，红外光谱图的采集波段为HOOllOOcm-1 ； 若由叶制成压片，红外光谱图的采集波段为lOOCTlSOOcm-1。
全文摘要
本发明公开了一种检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，包括取大白菜的根或叶，制成压片；采集所述压片的红外光谱图；对红外光谱图进行分析；若由根制成压片在1748.16±0.75cm-1、2851.24±0.05cm-1和3013.23±0.28cm-1范围中至少一处出现特征峰，则大白菜的根感染芸苔根肿菌；若由叶制成压片在1252.54±0.50cm-1和1051.98±4.23cm-1范围中至少一处出现特征峰，则大白菜的叶感染芸苔根肿菌。本发明检测大白菜中芸苔根肿菌的方法，应用傅里叶变换红外光谱技术，可快速、无损、准确的检测大白菜中芸苔根肿菌，操作方便，不依赖于人的经验，且安全性、重复性高。
文档编号G01N21/35GK103115891SQ20131001918
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者李斌, 单长林, 黄洁琼, 葛梦禹, 石雨, 谢关林 申请人:浙江大学