专利名称：一种干式免疫检测试纸条及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于临床医学诊断领域，具体涉及一种干式免疫检测检测试纸条及其制备方法与应用。
背景技术：
现如今干式免疫定量检测一般由体外免疫层析试剂条进行检测，试纸条主要是将亲和技术、印记技术、免疫标记和层析技术的组合，一般包括样品垫、滤血膜、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫等四层到五层(四层一般将滤血功能与样品垫组合)，示踪粒子(胶体金、荧光等)标记的抗体包被在结合垫上。专利CN102192983A对传统的免疫层析膜的结合方式进行了改变，变成三膜系统一GE公司旗下Whatman开发的膜Fusion5、硝酸纤维素膜、吸水纸，有效地提高了检测的灵敏度和特异性。然而，膜Fusion5孔径较大，抗体难以固定需要制备特殊的STONE用以固定抗体，工艺较为复杂，同时通过专利CN102192983A制备的试纸条层析的时间需要十分钟，检测时间长
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种操作简单、层析迅速、特异性强、检测结果准确、稳定性强的干式免疫检测试纸条及其制备方法与应用。本发明通过以下技术方案实现:一种干式免疫检测试纸条，在塑料底衬上从左到右依次粘有样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，硝酸纤维素膜右端设有相互平行的质控线和检测线；硝酸纤维素膜左端设有示踪粒子标记抗体/抗原包被线和封闭蛋白线I，封闭蛋白线I为封闭蛋白液I包被硝酸纤维素膜形成的线，抗体/抗原包被线为示踪粒子标记抗体/抗原喷到封闭蛋白线II上形成的线，其中，封闭蛋白线II为封闭蛋白液II包被硝酸纤维素膜形成的线。所述的检测线上包被有抗体或抗原，检测线上包被有抗体为针对待测抗原的单抗或多抗，或者为针对待测抗体的抗原的单抗或多抗；检测线上包被抗原为待测抗原的竞争性抗原。所述的示踪粒子为胶体金颗粒、荧光颗粒、胶乳颗粒、磁性颗粒中的任意一种。所述的荧光颗粒可以是荧光素(cy5、cy7)、羧基荧光素、2-甲氧基荧光素、罗丹明、藻红蛋白、量子点中的一种。所述封闭蛋白液I与封闭蛋白液II均包含酪蛋白与BSA。所述的封闭蛋白液I的制备方法:用三蒸水溶解质量比为1:5-2:1的酪蛋白与BSA，然后配置成浓度不高于15%的溶液。所述的封闭蛋白液II的制备方法:用三蒸水溶解质量比为1:5-1:1的酪蛋白与BSA，然后配置成浓度不高于15%的溶液。本发明公开了一种干式免疫检测试纸条的制备方法，包括以下步骤:(I)样品垫的制备:将样品垫用lOOmmol/L pH7.2 PBS缓冲液浸泡2 4小时，取出后25°C干燥8小时。(2)硝酸纤维素膜的处理:
A、检测线的制备:将待测物质相对应的抗原/抗体用20mmol/LpH7.2的PB缓冲液稀释到2.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm在离硝酸纤维素膜右端4.0cm处划线得到检测线；
B、质控线的制备:将兔抗鼠IgG抗体按4mg/ml的浓度,0.8ul/cm在硝酸纤维素膜右端
3.5cm处划质控线，该线与检测线平行，与检测线间隔5_，然后在干燥箱内20°C鼓风干燥12h ；
C、封闭蛋白线的制备:将封闭蛋白液I包被于硝酸纤维素膜左端6mm处，包被量为1.5ul/cm ；
D、示踪粒子标记抗体/抗原包被线的制备:采用封闭蛋白液II划线于硝酸纤维素膜左端1.5mm处,包被量为1.3ul/cm,置于25°C干燥2h,然后用示踪粒子标记的抗体/抗原在封闭蛋白II的位置划线置于25°C干燥4h，密封干燥保存。(3)吸水垫的制备:吸水纸裁剪成30*2.7cm每条。(4)组装:塑料底衬，样品垫和吸水 纸为本领域通用的部件。将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试纸条。本发明公开了一种干式免疫检测试纸条的应用，所述的干式免疫检测试纸条通过双抗夹心法或者竞争法原理定量测定待测物质，适用于所有的采用双抗夹心或竞争法模式的心肌类、肾脏类、肿瘤类、传染病类等疾病的诊断。本发明通过采用包被于硝酸纤维素膜上的示踪粒子标记抗体包被线，且采用封闭蛋白线的方式取代常用的包被示踪粒子标记抗体的结合垫，一方面层析时间只需45s-60s，检测时间大大缩短、特异性与稳定性加强、检测结果更加准确，另一方面，还大大节约了材料，节省了成本。
图1:本发明干式免疫检测试纸条结构示意 图2:C反应蛋白胶体金检测试纸条的标准曲线；
图3:胱抑素C荧光检测试纸的标准曲线；
图4:甲胎蛋白荧光检测试纸的标准曲线；
其中，图1:1、样品垫；2、吸水垫；3、硝酸纤维素膜；4、检测线；5、质控线；6、包被线；7、封闭蛋白线I。
具体实施例方式通过以下具体实施例对本发明作进一步阐述，以下实施例仅用于说明，而不用于限制本发明的保护范围。实施例1 C反应蛋白胶体金检测试纸的制备与使用 1、C反应蛋白胶体金检测试纸的制备
(I)胶体金一抗体复合物的制备
a、制备生物素化C反应蛋白(CRP)单克隆抗体复合物:先用6-氨基己糖与生物素连接制得长臂生物素，按照每毫升鼠抗人CRP单克隆抗体加80 μ g生物素加入进行反应lh，生成长臂生物素N-羟基丁二酰胺酯，即为生物素化CRP单克隆抗体复合物，通过1% BSA pH7.5透析出去游离生物素；
b、制备胶体金标记亲和素:用1%碳酸钾溶液调节胶体金pH值至7.5，按照IOyg链亲和素/ml胶体金的量加入链亲和素溶液充分混匀，置于25°C水浴反应30分钟后再加入5%BSA，封闭20分钟后，离心取沉淀，用BSA恢复其终浓度为1%，4°C保存备用；
C、胶体金一抗体复合物的制备:按50yg CRP单抗-生物素/ml胶体金的量将抗体-生物素加入胶体金中，37°C搅拌反应40分钟，加入5%BSA，封闭搅拌20分钟，6000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀以金标抗体保存液恢复体积，4°C保存。(2)封闭蛋白液的制备
封闭蛋白液I的制备方法:用三蒸水溶解质量比为1:5的酪蛋白与BSA，然后配置成浓度3%的溶液。封闭蛋白液II的制备方法:用三蒸水溶解质量比为1:1的酪蛋白与BSA，然后配置成浓度5%的溶液。(3)免疫层析试纸条的组装 a、硝酸纤维素膜的处理 检测线的制备:将鼠抗人C反应蛋白单克隆抗体用20mmol/L pH7.2的PB缓冲液稀释到2.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm在离硝酸纤维素膜右端4.0cm处划线得到检测线。质控线的制备:将兔抗鼠IgG抗体按4mg/ml的浓度，0.8ul/cm在硝酸纤维素膜右端3.5cm处划质控线，该线与检测线平行，与检测线间隔5_，然后在干燥箱内20°C鼓风干燥 12h。封闭蛋白线:将封闭蛋白液I包被于硝酸纤维素膜左端6mm处，包被量为1.5ul/cm。胶体金抗体包被线:采用封闭蛋白液II包被上述处理的硝酸纤维素膜，包被于膜左端1.5mm处，包被量为1.3ul/cm，置于25°C干燥2h，然后用胶体金一抗体复合物在封闭蛋白II的位置划线置于25°C干燥4h，密封干燥保存。b、样品垫的制备
将样品垫用lOOmmol/L PBS缓冲液浸泡2 4小时，取出后25°C干燥8小时。C、吸水垫的制备 吸水纸裁剪成30*2.7cm每条。d、组装
塑料底衬、样品垫和吸水纸为本领域通用的部件。将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上(如附图1)。将贴好的中间物用斩切机切成5.6cm宽一条的试纸条。2、CRP胶体金检测试纸条的使用 (I)定性检测
把待检样品滴加在本试纸条的样品垫上，45s-60s后即可出现定性结果:若在试纸的质控线和检测线的位置处分别出现一条紫红色的条带，表明待检液中含有相应的抗原即为阳性样品；若仅在试纸的质控线位置处出现紫红色的条带，表明待检液中含有相应的抗原在检测下限以下即为阴性样品；若在试纸的质控线和检测线的位置处都无紫红色的条带出现，表明该检测结果为无效结果。(2)定量检测 a、标准曲线的绘制
制备好的CRP胶体金检测试纸条样品垫上加入不同浓度CRP抗原标准品(取六个不同浓度，分别为0.5、1、3、10、100、200mg/L，每个浓度设3个重复)，60 s后，通过南京基蛋生物科技有限公司的FIA8100系列免疫定量分析仪读取信号，实验结果及分析见表1:
表1 CRP标准品检测结果
权利要求
1.一种干式免疫检测试纸条，其特征在于，在塑料底衬上从左到右依次粘有样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，硝酸纤维素膜右端设有相互平行的质控线和检测线；硝酸纤维素膜左端设有示踪粒子标记抗体/抗原包被线和封闭蛋白线I，封闭蛋白线I为封闭蛋白液I包被硝酸纤维素膜形成的线，抗体/抗原包被线为示踪粒子标记抗体/抗原喷到封闭蛋白线II上形成的线，其中，封闭蛋白线II为封闭蛋白液II包被硝酸纤维素膜形成的线。
2.根据权利要求1所述的一种干式免疫检测试纸条，其特征在于所述的示踪粒子为胶体金颗粒、荧光颗粒、胶乳颗粒、磁性颗粒中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种干式免疫检测试纸条，其特征在于所述的检测线上包被有抗体或抗原。
4.一种干式免疫检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)样品垫的制备:将样品垫用100mmol/LPBS缓冲液浸泡2 4小时，取出后25°C干燥8小时； (2)硝酸纤维素膜的处理: A、检测线的制备:将待测物质相对应的抗原/抗体用20mmol/LpH7.2的PB缓冲液稀释到2.0mg/ml的浓度，0.8ul/cm在离硝酸纤维素膜右端4.0cm处划线得到检测线； B、质控线的制备:将兔抗鼠IgG抗体按4mg/ml的浓度,0.8ul/cm在硝酸纤维素膜右端 3.5cm处划质控线，该线与检测线平行，与检测线间隔5_，然后在干燥箱内20°C鼓风干燥12h ； C、封闭蛋白线的制备:将封闭蛋白液I包被于硝酸纤维素膜左端6mm处，包被量为1.5ul/cm ； D、示踪粒子标记抗体/抗原包被线的制备:采用封闭蛋白液II划线于硝酸纤维素膜左端1.5mm处,包被量为1.3ul/cm,置于25°C干燥2h,然后用示踪粒子标记的抗体/抗原在封闭蛋白II的位置划线置于25°C干燥4h，密封干燥保存； (3)吸水垫的制备:吸水纸裁剪成30*2.7cm每条； (4)组装:将上述硝酸纤维素膜、吸水垫、样品垫粘贴在塑料底衬上，将贴好的中间物用斩切机切成一定宽度的试纸条。
5.根据权利要求4所述的一种干式免疫检测试纸条的制备方法，其特征在于所述封闭蛋白液I与封闭蛋白液II均包含酪蛋白与BSA。
6.根据权利要求4或5所述的一种干式免疫检测试纸条的制备方法，其特征在于所述的封闭蛋白液I的制备方法:用三蒸水溶解质量比为1:5-2:1的酪蛋白与BSA，然后配置成浓度不高于15%的溶液。
7.根据权利要求4或5所述的一种干式免疫检测试纸条的制备方法，其特征在于所述的封闭蛋白液II的制备方法:用三蒸水溶解质量比为1:5-1:1的酪蛋白与BSA，然后配置成浓度不高于15%的溶液。
8.一种干式免疫检测试纸条应用于双抗夹心法或者竞争法原理的免疫定量检测。
全文摘要
本发明涉及一种干式免疫检测试纸条及其制备方法与应用。该试纸条在塑料底衬上从左到右依次粘有样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，硝酸纤维素膜右端设有相互平行的质控线和检测线；硝酸纤维素膜左端设有示踪粒子标记抗体/抗原包被线和封闭蛋白线Ⅰ，封闭蛋白线Ⅰ为封闭蛋白液Ⅰ包被硝酸纤维素膜形成的线，抗体/抗原包被线为示踪粒子标记抗体/抗原喷到封闭蛋白线Ⅱ上形成的线，其中，封闭蛋白线Ⅱ为封闭蛋白液Ⅱ包被硝酸纤维素膜形成的线。该试纸条应用于双抗夹心法或者竞争法原理的免疫检测，操作简单、层析迅速、特异性强、检测结果准确、稳定性强。
文档编号G01N33/558GK103226143SQ20131011715
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月7日 优先权日2013年4月7日
发明者苏恩本, 王勇, 焦丽蓉 申请人:南京基蛋生物科技有限公司