一种检测特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的方法，该方法是以整合了人胰岛素基因的pZRHi-1质粒的大肠杆菌发酵液超滤制备的宿主总蛋白作为抗原，刺激家兔产生抗体，继而采用固定了人胰岛素的亲和色谱法祛除其中人胰岛素抗体，制备特异性抗体，再对其用辣根过氧化物酶标记后采用双抗体夹心法对待测样品进行残留宿主蛋白的检测；该方法灵敏度高、特异性强、重复性好，可有效控制RHI产品质量。
【专利说明】—种检测特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的检测方法，特别是用于检测通化东宝药业股份有限公司生产的工艺特异性的重组人胰岛素的大肠杆菌残留宿主蛋
白含量。
【背景技术】
[0002]重组人膜岛素(recombinant human insulin,以下简称RHI)自1982年美国FDA批准上市以来，便在全球范围内广泛应用于II型糖尿病的临床治疗。RHI通常是利用大肠杆菌工程菌来制备，正如其它重组蛋白一样，宿主蛋白在产品中有残留几乎是不可避免的，从而对产品造成污染。这些残留宿主蛋白在血液中的累计浓度达到IOOppm时，很可能会刺激人的免疫系统引起免疫反应，从而影响药物的疗效。
[0003]目前临床应用的RHI产品是由多个不同厂家生产的，而不同厂家的生产工艺不尽相同，例如，我单位(通化东宝药业股份有限公司)采用整合了人胰岛素基因的pZRH1-Ι质粒的大肠杆菌进行发酵生产RHI (甘舒霖牌重组人胰岛素)，该工艺具有发酵时间短、适合大批量生产、产品纯化过程简单及生产成本低等优点。不同厂家制备工艺上的差异造成RHI产品中残留宿主蛋白构成的不同。但当前用于RHI产品大肠杆菌残留宿主蛋白检测的通常是ELISA试剂盒，该试剂盒在制备抗体时所采用的抗原是普通大肠杆菌，所以在检测特异工艺RHI产品的残留宿主蛋白时，特异性低，灵敏度差，测定结果不能真实地反应出产品中残留宿主蛋白的含量，即便检测结果显示合格，也不能充分说明其安全。另外，截止目前，普通测定方法(如，高效液相法等)都不适用于具有工艺特异性的RHI中残留宿主蛋白的检测。
[0004]因此，提供一种灵敏度高、特异性强且重复性好的特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的检测方法，以便准确地测出残留宿主蛋白含量尤为重要，不但可以保证生物制品的安全性，也可作为生产过程中质量控制和工艺优化的重要参数。
[0005]我单位自1998年开始上市销售甘舒霖牌重组人胰岛素，填补了国内空白，目前已在临床上广泛应用，每年销售额10亿以上。随着生物药的发展和人们对该类药物的了解，生物药的安全问题越来越引起人们的重视。我单位以为病患提供更为安全、有效的药品为宗旨，因此，发明人针对我单位RHI产品的特异性工艺，研究得到本发明的检测大肠杆菌残留宿主蛋白含量的方法，主要用于该RHI成品及其生产过程中残留宿主蛋白的实时检测，也可为其它基因工程产品残留宿主蛋白检测技术提供借鉴。
【发明内容】
[0006]针对上述问题与不足，本发明提供一种特异性检测我单位RHI产品中大肠杆菌残留宿主蛋白含量的方法，该方法灵敏度高、特异性强、重复性好，以该检测方法控制舒霖牌重组人胰岛素的质量，能有效提高产品的安全性，保证其有效性。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:[0008]本发明提供了一种检测特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的方法，该检测方法包括以下步骤:
[0009](I)取含有整合了人胰岛素基因的pZRH1-Ι质粒的大肠杆菌发酵液，进行组织破碎，得到破碎液；
[0010](2)将步骤(I)得到的破碎液超滤，得到宿主细胞总蛋白；
[0011](3)将步骤(2)得到的宿主细胞总蛋白对家兔进行皮下注射免疫；
[0012](4)取免疫后的家兔血清，采用G蛋白亲和色谱柱进行纯化，得到纯化血清抗体；
[0013](5)使人胰岛素与CNBr活化的Sepharose4Fastflow色谱柱填料偶联,处理后得到人胰岛素亲和色谱柱；
[0014](6)将步骤(4)得到的纯化血清抗体通过步骤(5)制得的人胰岛素亲和色谱柱进行纯化，制得特异性抗体；
[0015](7)将步骤(6)得到的特异性抗体用辣根过氧化物酶标记，得酶标抗体；
[0016](8)按照双抗体夹心法对待测样品进行测定，得到待测样品的大肠杆菌残留宿主
蛋白含量。
[0017]本发明的技术方案是以整合了人胰岛素基因的pZRH1-Ι质粒的大肠杆菌发酵液破碎、超滤制备的宿主总蛋白作为抗原，刺激家兔产生抗体，继而采用固定了人胰岛素的亲和色谱法祛除其中人胰岛素抗体，制备特异性抗体，对其采用辣根过氧化物酶标记后采用双抗体夹心法检测待测样品中的残留宿主蛋白。
[0018]在检测残留菌体(宿主)蛋白过程中，抗体的选择是非常关键的。目前，用于RHI残留宿主蛋白检测的市售试剂盒均采用的普通大肠杆菌作为抗原，由于我单位RHI产品的工艺特异性，用该类试剂盒检测残留宿主蛋白，无法得到真实、准确的结果，也就不能达到控制产品质量的目的，从而使该产品的临床应用存在安全隐患或影响药物疗效。本发明的检测方法采用了工艺特异性的基因工程大肠杆菌发酵液，即含有整合了人胰岛素基因的pZRH1-Ι质粒的大肠杆菌发酵液经破碎、超滤后得到的总蛋白作为抗原，因该基因工程大肠杆菌是针对舒霖牌重组人胰岛素的生产工艺及产品特点而特定制备的，因此，所得抗原有效保证了检测的特异性。此外，因抗原中不可避免的夹带了人胰岛素抗原，继而产生人胰岛素抗体，为避免出现假阳性现象，影响结果，本发明的检测方法中还有用人胰岛素亲和色谱柱纯化血清抗体的步骤，以祛除血清抗体中的人胰岛素抗体，得到特异性抗体，既保证了检测的灵敏度，又不破坏其他特异性抗体。
[0019]上述检测方法中所述的“含有整合了人胰岛素基因的pZRH1-Ι质粒的大肠杆菌”是通过以下方法制得的:
[0020]A、获得人胰岛素基因:合成人胰岛素原基因序列，且该人胰岛素原基因序列包含一个 5' Cla I 和一个 3' Hind III 位点；
[0021]B、将人胰岛素原基因导入质粒进行基因重组:用Cla I和Hind III限制性内切酶将pZRH1-Ι质粒和人胰岛素原基因分别切开，再用DNA连接酶将所述基因与质粒连接，得到能表达出人胰岛素基因的重组质粒；
[0022]C、将重组质粒导入到受体细胞中:向大肠杆菌的培养液中加入氯化钙或硫酸镁，再加入步骤B得到的重组质粒，经培养得到含有整合了人胰岛素基因的pZRH1-Ι质粒的大肠杆菌。[0023]其中，所述的步骤A优选为用固相亚磷酰胺法合成人胰岛素原基因序列；
[0024]所述的步骤B具体为:分别向pZRH1-1质粒和包含一个5' Cla I和一个3' Hind III位点的人胰岛素原基因中加入Cla I和Hind III限制性内切酶，在35-39°C作用约I 小时，然后在60-65°C下保持10-15分钟终止反应；将两份反应液混合后加入DNA连接酶， 14-18°C下反应10-12小时,得到能表达出人胰岛素基因的重组质粒；
[0025]所述的步骤C具体为:向大肠杆菌的培养液中加入氯化钙或硫酸镁(制备感受 态细胞)，再加入步骤B得到的重组质粒，置0-4°C冰浴25-35分钟，然后置40-45 °C水浴 80-100秒，再置0-4°C冰浴1-2分钟，最后置35-39°C水浴3-5分钟，即可得到含有整合了人 胰岛素基因的pZRH1-1质粒的大肠杆菌。
[0026]所述的PZRH1-l质粒是大肠杆菌所含的一种质粒，可通过购买得到。
[0027]上述步骤A、B、C中涉及的各物质的用量为常规用量，属于本领域公知技术，在此 不再赘述。
[0028]本发明检测方法所述步骤(I)中的组织破碎，可通过超声破碎方式实现，如，300 瓦功率，超声30?60秒；
[0029]所述步骤(2)中的超滤，是将破碎液用8_12k，优选IOk (即，截留分子量为I万道 尔顿，下同)的超滤膜进行超滤，得到的超滤液即为宿主细胞总蛋白，进一步，得到的是宿主 细胞总蛋白溶液，可Bradford或双缩脲方法测出宿主细胞总蛋白浓度；
[0030]所述步骤(3)的具体免疫方法为:分别以浓度为0.8?1.6mg/ml和0.2?0.5mg/ ml的宿主细胞总蛋白液先后两次对家兔进行皮下多点注射免疫，首次免疫配合0.5ml完全 弗氏佐剂，二次免疫配合0.5ml不完全弗氏佐剂，两次免疫间隔12-16天；
[0031]所述的步骤(4)具体为:将G蛋白亲和柱色谱(S卩，G蛋白s印harose4FAST FLOW色 谱柱)用8-12倍柱体积的pH7.0的20mM磷酸缓冲液冲洗平衡；取免疫后家兔血清用pH7.0 的20mM的磷酸缓冲液稀释8-12倍，经0.45 y m滤膜过滤后上柱，用8_10倍柱体积的pH2.7 的0.1M甘氨酸(可简写为Gly)缓冲液洗脱，收集洗脱液，该洗脱液用pH9.0的IM Tris-HCl 缓冲液中和至PH7.0 ;将中和的洗脱液在4°C下于pH7.0的PBS缓冲液中透析过夜，得到纯 化血清抗体，可用Bradford法测定抗体浓度,并进行效价检测。
[0032]本发明所述方法中溶液的单位M、mM均为浓度单位，分别表示摩尔每升和毫摩尔每升。
[0033]所述步骤(5)的人胰岛素亲和色谱柱的制备方法为:
[0034]1、CNBr活化的Sepharose4Fastflow可购买得到，且CNBr (溴化氰)对 Sepharose4Fastflow (琼脂糖凝胶)进行活化的方法为本领域公知方法，在此不再赘述；将 CNBr活化的Sepharose4Fastflow与预冷的0.5?1.5mM HCl溶液混合，充分溶胀，装柱后 用预冷的0.5?1.5mM HCl溶液冲洗，然后，以pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl的混合 溶液冲洗，得到预处理Sepharose4Fastf low ；
[0035]I1、将I?2mg/ml的人胰岛素水溶液在pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合 溶液中透析；
[0036]II1、将预处理Sepharose4Fastflow与透析过的人胰岛素水溶液在室温下混合 2?6小时后重新装柱，用pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液冲洗，得到偶联 Sepharose4Fastflow ；[0037]IV、将偶联Sepharose4Fastf low加入到pH8.0的0.2M Gly溶液中，混合I?5小 时；重新装柱后分别以PH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液和pH4.0的0.1M NaAc 与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，得到人胰岛素亲和色谱柱。
[0038]所述步骤(5)的人胰岛素亲和色谱柱的制备方法进一步为:
[0039]1、将 CNBr 活化的 Sepharose4Fastf low 与预冷的 0.7 ?1.3mM HCl 溶液按 1: 80-120(w/v)的比例混合，溶胀20?60分钟，装柱后用320-480倍量(v/w)的预冷的0.7?
1.3mM HCl 溶液冲洗，再以 80-120 倍量(v/w)的 pH8.3 的 0.2M NaHCO3 与 0.5M NaCl 的混 合溶液冲洗，得到预处理Sepharose4Fastf low ；
[0040]I1、将I?2mg/ml人胰岛素溶液在pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液 中透析40?80分钟；
[0041]II1、将预处理Sepharose4Fastflow与透析过的人胰岛素水溶液按1:4_8 (w/v)的 比例，在室温下混合2?4小时后重新装柱，用320-480倍量(v/w)的pH8.3的0.2M NaHCO3 与0.5M NaCl混合溶液冲洗，得到偶联Sepharose4Fastf low ；
[0042]IV、将偶联 Sepharose4Fastflow 加入到 80-120 倍量(v/w)的 pH8.0 的 0.2M Gly 溶液中混合I?3小时；重新装柱后分别以pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液 和pH4.0的0.1M NaAc与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，洗掉多余的人胰岛素配体，得到人胰 岛素亲和色谱柱，该人胰岛素亲和色谱柱的填料可置于10?30%乙醇溶液中于2?6°C下 保存。
[0043]所述步骤(5)的人胰岛素亲和色谱柱的制备方法优选为:
[0044]1、将 CNBr 活化的 Sepharose4Fastflow 与 2 ?6°C下预冷的 ImM HCl 溶液按 1: 90-110 (w/v)的比例混合，溶胀20?40分钟，装柱后用380-420倍量(v/w)的2?6°C下 预冷的ImMHCl溶液冲洗，再以90-110倍量(v/w)的pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl的 混合溶液冲洗，得到预处理Sepharose4Fastflow ；
[0045]I1、将1.4mg/ml人胰岛素溶液在pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液中 用2?4K的透析膜透析50?70分钟；
[0046]II1、将预处理Sepharose4Fastflow与透析过的人胰岛素水溶液按1:5_7 (w/v)的 比例，在室温下混合3小时后重新装柱，用380-420倍量(v/w)的pH8.3的0.2M NaHCO3与 0.5M NaCl混合溶液冲洗，得到偶联Sepharose4Fastf low ；
[0047]IV、将偶联 Sepharose4Fastflow 加入到 90-110 倍量(v/w)的 pH8.0 的 0.2M Gly 溶液中混合2小时；重新装柱后再分别以90-110倍量(v/w)的pH8.3的0.2M NaHCO3与 0.5M NaCl混合溶液和pH4.0的0.1M NaAc与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，反复3次，洗掉 多余的人胰岛素配体，得到人胰岛素亲和色谱柱，该人胰岛素亲和色谱柱的填料可置于20% 乙醇溶液中4°C下保存。
[0048]所述步骤(6)的具体为:步骤(5)得到的人胰岛素亲和色谱柱，用30-40倍柱体积 的pH7.0的20mM磷酸缓冲液冲洗平衡，将2_6倍柱体积的步骤(4)得到的纯化血清抗体加 到色谱柱上，先以30-40倍柱体积的pH7.0的20mM磷酸缓冲液冲洗，再以6_8倍柱体积的 PH2.7的0.1M Gly溶液冲洗，收集洗脱液，以IM pH9.0的Tris-HCl缓冲液中和至pH7.0左 右，即为宿主蛋白特异性抗体。
[0049]所述步骤(7)的具体为:[0050]取辣根过氧化物酶(HRP)溶于去离子水中制成浓度为4_6mg/ml的溶液，以此溶液体积设定为1，加入0.1-0.3倍体积的0.1M NaIO4，常温混合20_30min ;再加入15-25倍体积的PH4.4的ImM NaAc-HAc缓冲液，用IOK超滤杯浓缩至原体积(即，I倍体积)，得到氧化 HRP ；
[0051]取适量步骤(6)制得的特异性抗体用IOK超滤杯在pH9.5的0.0lM碳酸盐缓冲液中浓缩至8-12mg/ml的溶液；
[0052]向氧化HRP溶液(I倍体积)中加入0.01-0.03倍体积的pH9.5的0.2M碳酸盐缓冲液，混匀后立即加入到等体积的特异性抗体溶液中，常温反应2-4h ;再加入0.08-0.12倍体积的4mg/ml的NaBH4,于4°C下反应2_4h ;用50K超滤杯在pH7.2的PBS缓冲液中置换2-4 次,浓缩至1-1.5倍体积，得到酶标抗体；该酶标抗体可加1-2倍体积pH7.2的PBS缓冲液和2-4倍体积甘油，于_20°C下保存。
[0053]所述步骤(8)的具体为:
[0054]取适量步骤(6)得到的特异性抗体用pH9.5的0.05M CB稀释一倍后加到反应板各孔中，加盖，2?6°C培养约24小时，次日，用WB洗涤液充分洗涤，甩干；
[0055]分别向各孔内加入0.2-0.3倍特异性抗体体积的试样(包括标准品、对照品和待测样品)，培养2-3小时；再分别向各孔中加入等特异性抗体体积的稀释10倍的酶标抗体， 置40?45°C温箱培养约60分钟；移去液体，用WB洗涤液洗涤，甩干；
[0056]再向各孔内加入等特异性抗体体积的底物液(底物液，即0.1M Na2HPO4 (Na2HPO4 ? 12H2035.8g/L) 5.14ml, 0.05mol/L 枸橼酸(10.5g/L) 4.86ml 混匀，加入邻苯二胺(OPD) 4mg,置棕色小瓶中，临用时加30%H2024.0uL,混匀)，置黑暗处15?25分钟； 然后，向各孔内加0.5倍特异性抗体体积的2M H2SO4，终止反应。采用酶标分光光度计测 450nm处的吸光度值(A)，计算可得出大肠杆菌残留宿主蛋白含量。
[0057]本发明所述的检测方法用于检测甘舒霖牌重组人胰岛素，特别是其原料，与采用市售试剂盒检测相比，特异性强，灵敏度高(检测限低)，能准确反映出待测品中残留宿主蛋白的含量，可在实际生产中对RHI中残留宿主蛋白进行实时检测，起到有效控制产品质量的效果。发明人对本发明的检测方法进行了方法验证，结果证明该检测方法特异性强，重现性、稳定性良好。
[0058]发明人进一步通 过具体实验来验证本发明的有益效果。
[0059]再次重申:以下实验只是本发明研制过程中众多试验中的例举性实验，并未涵盖和穷尽了发明人为本发明所做的所有实验，目的仅仅在于用那些数据来阐述本发明的有益效果。
[0060]一、检测灵敏度比较
[0061]1、实验材料:
[0062]供试品:将按照本发明检测方法的步骤(2)所制得的宿主细胞总蛋白溶液用去离子水稀释至浓度分别为:0.5ng/ml>1.0ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、IOOng/ ml。CYGNUS试剂盒:购自CYGNUS公司，批号:13612。
[0063]2、试验方法
[0064]分别按照CYGNUS试剂盒说明书记载方法及本发明检测方法对上述已知不同浓度残留宿主蛋白溶液进行测定，并分别进行线性回归分析。[0065]3、实验结果
[0066]以CYGNUS试剂盒测得各浓度宿主细胞总蛋白溶液的吸光度见表1，以该测定结果绘制的标准曲线见图1 ;以本发明的检测方法测得各浓度宿主细胞总蛋白溶液的吸光度见表2，以该测定结果绘制的标准曲线见图2。
[0067]表I以CYGNUS试剂盒测定不同浓度供试品的结果
【权利要求】
1.一种检测特异性重组人胰岛素大肠杆菌残留宿主蛋白的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤: (1)取含有整合了人胰岛素基因的PZRH1-1质粒的大肠杆菌发酵液，进行组织破碎，得到破碎液； (2)将步骤(I)得到的破碎液超滤，得到宿主细胞总蛋白； (3)将步骤(2)得到的宿主细胞总蛋白对家兔进行皮下注射免疫； (4)取免疫后的家兔血清，采用G蛋白亲和色谱柱进行纯化，得到纯化血清抗体； (5)使人胰岛素与CNBr活化的Sepharose4Fastflow色谱柱填料偶联,处理后得到人胰岛素亲和色谱柱； (6)将步骤(4)得到的纯化血清抗体通过步骤(5)制得的人胰岛素亲和色谱柱进行纯化，制得特异性抗体； (7)将步骤(6)得到的特异性抗体用辣根过氧化物酶标记，得酶标抗体； (8)按照双抗体夹心法对待测样品进行测定，得到待测样品大肠杆菌残留宿主蛋白的含量。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的含有整合了人胰岛素基因的PZRH1-1质粒的大肠杆菌通过以下方法得到: A、获得人胰岛素基因:合成人胰岛素原基因序列，且该人胰岛素原基因序列包含一个5' Cla I 和一个 3' Hind III 位点； B、将人胰岛素原基因导入质粒进行基因重组:用ClaI和Hind III限制性内切酶将PZRH1-1质粒和人胰岛素原基因分别切开，再用DNA连接酶将所述基因与质粒连接，得到能表达出人胰岛素基因的重组质粒； C、将重组质粒导入到受体细胞中:向大肠杆菌的培养液中加入氯化钙或硫酸镁，再加入步骤B得到的重组质粒，经培养得到含有整合了人胰岛素基因的pZRH1-Ι质粒的大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤A为用固相亚磷酰胺法合成人膜岛素原基因序列。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤B具体为:分别向pZRH1-1质粒和包含一个5' Cla I和一个3' Hind III位点的人胰岛素原基因中加入Cla I和Hind III限制性内切酶，在35-39°C作用I小时，然后在60_65°C下保持10-15分钟终止反应；将两份反应液混合后加入DNA连接酶，14-18°C下反应10-12小时，得到能表达出人胰岛素基因的重组质粒。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤C具体为:向大肠杆菌的培养液中加入氯化钙或硫酸镁，再加入步骤B得到的重组质粒，置0-4°C冰浴25-35分钟，然后置40-45°C水浴80-100秒，再置0_4°C冰浴1_2分钟，最后置35_39°C水浴3_5分钟，即可得到含有整合了人胰岛素基因的pZRH1-Ι质粒的大肠杆菌。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)为将破碎液用8-12k超滤膜进行超滤，得到宿主细胞总蛋白。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(5)具体为: .1、将CNBr活化的Sepharose4Fastf low与预冷的0.5?1.5mM HCl溶液混合，充分溶胀，装柱后用预冷的0.5?1.5mM HCl溶液冲洗，再以pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，得到预处理Sepharose4Fastflow ； I1、将I?2mg/ml的人胰岛素水溶液在pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液中透析； II1、将预处理Sepharose4Fastflow与透析过的人胰岛素水溶液在室温下混合2?·6小时后重新装柱，用pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液冲洗，得到偶联Sepharose4Fastflow ； IV、将偶联Sepharose4Fastflow加入到pH8.0的0.2M Gly溶液中，混合I?5小时；重新装柱后分别·以PH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液和pH4.0的0.1M NaAc与·0.5M NaCl的混合溶液冲洗，得到人胰岛素亲和色谱柱。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(5)具体为:
1、将CNBr 活化的 Sepharose4Fastflow 与预冷的 0.7 ?1.3mM HCl 溶液按 1:80-120(w/v)的比例混合，溶胀20?60分钟，装柱后用320-480倍量(v/w)的预冷的0.7?1.3mMHCl溶液冲洗，再以80-120倍量(v/w)的pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，得到预处理Sepharose4Fastf low ； I1、将I?2mg/ml人胰岛素溶液在pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液中透析40?80分钟； II1、将预处理Sepharose4Fastflow与透析过的人胰岛素水溶液按1:4_8 (w/v)的比例，在室温下混合2?4小时后重新装柱，用320-480倍量(v/w)的pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液冲洗，得到偶联Sepharose4Fastf low ； IV、将偶联Sepharose4Fastflow 加入到 80-120 倍量(v/w)的 pH8.0 的 0.2M Gly 溶液中混合I?3小时；重新装柱后分别以pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液和PH4.0的0.1M NaAc与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，得到人胰岛素亲和色谱柱，该人胰岛素亲和色谱柱的填料可置于10?30%乙醇溶液中2?6°C下保存。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的步骤(5)具体为: I、将CNBr 活化的 Sepharose4Fastf low 与 2 ?6°C下预冷的 ImM HCl 溶液按 1:90-110(w/v)的比例混合，溶胀20?40分钟，装柱后用380-420倍量(v/w)的2?6°C下预冷的ImM HCl溶液冲洗，再以90-110倍量(v/w)的pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，得到预处理Sepharose4Fastf low ； II、将1.4mg/ml人胰岛素溶液在pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液中用2?4K的透析膜透析50?70分钟； III、将预处理Sepharose4Fastflow与透析过的人胰岛素水溶液按1:5_7(w/v)的比例，在室温下混合3小时后重新装柱，用380-420倍量(v/w)的pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5MNaCl混合溶液冲洗，得到偶联Sepharose4Fastf low ； IV、将偶联Sepharose4Fastflow 加入到 90-110 倍量(v/w)的 pH8.0 的 0.2M Gly 溶液中混合2小时；重新装柱后分别以pH8.3的0.2M NaHCO3与0.5M NaCl混合溶液和pH4.0的·0.1M NaAc与0.5M NaCl的混合溶液冲洗，得到人胰岛素亲和色谱柱，该人胰岛素亲和色谱柱的填料可置20%乙醇溶液中4°C下保存。
【文档编号】G01N33/68GK103439512SQ201310326398
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月30日 优先权日:2013年7月30日
【发明者】冷春生 申请人:通化东宝药业股份有限公司