热休克蛋白47胶质瘤相关肿瘤抗原及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物制药领域，涉及热休克蛋白47胶质瘤相关肿瘤抗原，具体涉及热休克蛋白47作为与预后相关的恶性胶质瘤特异性肿瘤抗原以及所述抗原的两个CTL表位及其九肽氨基酸序列，和所述CTL表位诱导T细胞反应用于临床预后判定，及其在制备恶性胶质瘤免疫治疗疫苗中的用途。本发明通过qPCR和蛋白免疫印迹的方法，证实热休克蛋白47在胶质母细胞瘤上高表达；同时验证了CTL表位与临床预后的相关性，本发明的热休克蛋白47胶质瘤相关肿瘤抗原可进一步制备包含该抗原的组合物和化合物及制备免疫治疗的制剂，用于判定恶性胶质瘤预后和免疫治疗。
【专利说明】热休克蛋白47胶质瘤相关肿瘤抗原及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，涉及热休克蛋白47胶质瘤相关肿瘤抗原，更具体地， 涉及热休克蛋白47作为与预后相关的恶性胶质瘤特异性肿瘤抗原以及所述抗原的两个 CTL表位及其九肽氨基酸序列，及其所述CTL表位诱导T细胞反应用以临床预后判定，及其 在制备恶性胶质瘤免疫治疗疫苗中的用途。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了胶质瘤（glioma)是中枢神经系统最常见的肿瘤，其中恶性胶质 瘤（WHO III、IV级）治愈率低，复发率高，预后极差，尤其是对于IV级的胶质母细胞瘤 (glioblastoma，GBM)患者。临床实践显示，由于大多数胶质瘤呈浸润性生长，与正常组织无 明显分界，所以单靠手术无法根治。目前，对于GBM推荐标准治疗方案，即手术后同步放化 疗加6个疗程的替莫唑胺（TMZ)化疗，其平均生存期仅为12-15个月。因此，对于恶性胶质 瘤，寻找更有效的治疗方法是目前临床急需解决的难题。目前免疫治疗，尤其是利用自身T 细胞杀伤显微手术后残留的肿瘤细胞，得到了业内极大的关注。
[0003] 热休克蛋白（heat shock protein, HSP)是进化上高度保守的蛋白，其功能涉及细 胞生物学的各个方面。HSP目前分成如下六类：HsplOO, Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40和小分 子HSP。就免疫的角度而言，HSP本身可以作为抗原，或者作为抗原呈递的辅佐分子。研究 显示，HSP可以绑定抗原肽从而呈递给抗原呈递细胞（antigen presentation cell, APC)。 癌症细胞上的HSP肽复合物能够激发自身的适应性和固有免疫系统。国际专利公布号 W02009/117116EN热休克蛋白GP96的疫苗接种及其使用方法中，公开了被基因修饰以 表达编码分泌形式的热休克蛋白（hsp) gp96多肽的核酸的肿瘤细胞。该HSP-96肽疫苗已经 安全地用于GBM患者的临床治疗（Crane CA, etal. Clin Cancer Res, 2013; 19:205-214.)。
[0004] HSP47,亦称SERPINH1或者colligin2,作为胶原特定的分子伴侣，其参与各种胶 原前蛋白成熟的各个过程。对于胶质瘤而言，目前有关HSP47的文献报道中，涉及HSP47在 胶质瘤血管上的表达（Mustafa D，et al.fcain Pathol, 2010;20:50-65. );HSP47 参与了胶 质瘤新生血管的发生发展（Mustafa DA, et al.Molecular&cellular proteomics:MCP, 200 7;6:1147-1157.)。迄今，尚未见HSP47作为恶性胶质瘤相关抗原或者其他肿瘤的相关抗原 的报道。
[0005] 表位是抗原分子中可与CTUTh和B细胞表面受体结合，诱导特异性细胞免疫和体 液免疫，进而产生免疫保护作用的一段氨基酸序列。有研究提出，通过筛选富含多个CTL、 Th和B细胞优势表位的氨基酸序列为抗原，可达到既能诱导免疫应答又可减少免疫病理反 应的目的；能够有效增强表位提呈的效率，解决表位疫苗的免疫原性弱目的。胶质瘤相关抗 原的T细胞表位能诱导T细胞反应从而杀伤肿瘤细胞，在已报道的胶质瘤相关抗原中，涉及 1'细胞表位的有下列基因 ：3六町-1，5六1?1'-3，11-13代(3印如四2(*3111，1^41，6六1^3，頂-2，￡ phA2, EGFRvIII, HER-2, gplOO, MAGE-1, gBK, TRP-2, Sox2, Soxll, Sox6, HSD3B7 等。其相应的 T细胞表位如表1所示。
[0006] 表1胶质瘤相关抗原的表位肽
[0007] Author Year Gene name HLA classification Amino Acid position Sequence
[0008]
【权利要求】
1. 热休克蛋白47 (HSP47)在制备判定恶性胶质瘤预后与免疫治疗的制剂中的用途。
2. 按权利要求1所述的用途，其中用于恶性胶质瘤预后判定的是检测HSP47特异性T 细胞免疫应答，T细胞免疫应答阳性者预后好、阴性者预后差。
3. 按权利要求2所述的用途，其中检测T细胞免疫应答为针对HSP47的部分序列，包括 但不限于： (a) HSP47 上第 184-192 位氨基酸序列 KLPEVTKDV ; (b) HSP47上第3-11位氨基酸序列LLLLSAFCL。
4. 按权利要求2或3所述的用途，其中用于检测T细胞免疫应答的方法为基于 IFN-ga_a的ELISPOT法、基于流式技术的IFN-ga_a细胞内染色法、Tetramer流式检测法 以及其他T细胞免疫应答的定量方法；按所述的每种方法的特定要求判定T细胞免疫应答 的阳性与阴性。
5. 按权利要求1的用途，其中所述的免疫治疗的制剂是免疫治疗恶性胶质瘤的治疗性 疫苗。
6. 按权利要求5所述的用途，其中所述的治疗性疫苗为DNA、病毒载体、细菌载体或蛋 白亚单位疫苗。
7. 按权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述的治疗性疫苗包括但不限于下述序 列： (a) HSP47 上第 184-192 位氨基酸序列 KLPEVTKDV ; (b) HSP47上第3-11位氨基酸序列LLLLSAFCL。
【文档编号】G01N33/68GK104374918SQ201310362324
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月17日 优先权日:2013年8月17日
【发明者】吴哲褒, 徐建青, 周良辅, 仇超, 蔡霖, 林绍坚 申请人:复旦大学