切片用固定液的配置方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种切片用固定液的配置方法及其应用，属于临床学应用【技术领域】。其由甲醇、戊二醛、乙醚混合，用PBS缓冲液稀释；在上述溶液中溶液添加蔗糖充分混合调整pH值制备得到。通过前处理、蔗糖放置、包埋、切片和洗涤处理组织。本发明工作进程和步骤简单，技术人员的操作工作量减少，整个过程操作步骤少，所需时间缩短，未经脱水和浸蜡的组织能保持更高的新鲜度，针对免疫组化的抗原保持完整和优秀，能提供更为正确的诊断条件，不需使用二甲苯等高度污染的有毒试剂，减轻环境污染，增强对技术人员的身体健康的保障。
【专利说明】切片用固定液的配置方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种切片用固定液的配置方法及其应用，属于临床学应用【技术领域】。【背景技术】
[0002]病理组织学检查已经在医学史上有了一百多年的使用历史，通过病理组织切片检查，对于许多病情，尤其是肿瘤等病的病情得以最终的确定诊断。但是随着医学的发展，在常规肿瘤病理诊断中，有很多的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。
[0003]近年来，随着临床肿瘤的诊断和治疗技术的发展，也随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难肿瘤通过特殊的免疫组化就得到了更为明确的诊断。特别是某些疑难的肿瘤，如果不通过免疫组化技术就不能获得正确诊断，或形成严重的误诊。因此免疫组化尤其在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认识和重视，其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达65%-85%甚至以上。
[0004]免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面:
(O恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；
(2)确定转移性恶性肿瘤的原发部位；
(3)对某类肿瘤进行进一步的病理分型；
(4)软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；
(5 )发现微小转移灶,有助于临床治疗方案的确定,包括手术范围的确定。
[0005](6)为临床提供治疗方案的选择。
[0006]免疫组化在以前通常通过在石蜡切片或直接的冰冻切片上进行，但由于石蜡切片要通过脱水和脱蜡的相关过程处理，在这一系列的处理过程中组织中抗原原性损失较大，有些有效的抗原原性甚至全部消失，虽经过一些抗原修复的技术方法，但还是难以达到处理以前的水平，这样使得石蜡切片免疫组化诊断存在巨大缺陷，其诊断结果常常不能正确体现病情，甚至有时形成误导。而常规直接的冰冻切片，由于冷冻时组织内含水分快速膨胀，形成的冰晶撑破细胞膜等生物膜性结构，使得切片难以保持良好的形态，如此情况也会使得诊断的定位失去意义，甚至出现假阳性的可能。
[0007]本发明所切出的组织切片既能保证形态的完整性，基本上能够达到与石蜡切片同等的效果，同时又保证抗原性的基本不丢失。
[0008]与石蜡切片比较，还能体现出技术简单，整个操作的步骤少，工作量降低。
[0009]无乙醇，二甲苯等毒性较大的溶液使用，改善技术操作人员的工作环境，也无周围空气污染等特出的优点。
[0010]有关这种切片新技术和材料，以及在免疫组化上的实际应用，在江苏省人民医院的临床病理实验室进行过试用，并得以证实。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种切片用固定液的配置方法及其应用，其时间短，步骤简单，工作量减少，无毒性试剂污染等优点。
[0012]按照本发明提供的技术方案，是一种切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份计步骤如下:甲醇10-20份，戊二醛10-25份，乙醚5-15份，用质量浓度为5%的PBS缓冲液稀释上述物质至100份，形成溶液；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖300-500g，充分混合，形成混合液；再在混合液中用lmol/L的氢氧化钠或lmol/L的盐酸调整pH值最终至
8.0-9.3 ο
[0013]所述切片用固定液的应用，具体步骤如下:
(1)前处理:组织取材后直接放置于固定液内浸泡过夜固定，每ImL固定液浸泡一个组织标本；组织标本为l*lcm大小，1-2mm厚；
(2)蔗糖放置:将步骤(I)所得组织固定标本从固定液中取出，置于质量浓度为30%-50%的蔗糖水溶液中放置l_12h ；
(3)包埋:将步骤(2)所得组织浸入冰冻切片包埋剂OCT中浸透，放置l_24h；
(4)切片:步骤(3)所得组织冰冻切片机直接切片，并直接在冰冻切片机上沾片；
(5)洗涤:将切片后的组织经质量浓度为0.05%-0.10%，pH为7.4-8.6的标准磷酸缓冲液内冲洗一次，随即可以进行染色或免疫组化试验。
[0014]所述固定液的成分中:甲醇和戊二醛增强固定效果，乙醚加强渗透和穿透性，蔗糖增强组织透明度，PBS缓冲液保持溶液的酸碱度稳定，氢氧化钠和盐调配酸碱度。
[0015]本发明的有益效果:本发明使用这种固定液就能将待检的病理组织不经脱水浸蜡，直接在水溶解的条件下进行冰冻病理组织切片。这比较传统的石蜡切片方法有如下优点:工作进程和步骤简单，技术人员的操作工作量减少，整个过程操作步骤少，所需时间缩短，未经脱水和浸蜡的组织能保持更高的新鲜度，针对免疫组化的抗原保持完整和优秀，能提供更为正确的诊断条件，不需使用二甲苯等高度污染的有毒试剂，减轻环境污染，增强对技术人员的身体健康的保障。
【具体实施方式】
[0016]实施例1，一种切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份计步骤如下:
甲醇10份，戊二醛10份，乙醚5份，用质量浓度为5%的PBS缓冲液稀释上述物质至100份；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖300g，充分混合；充分混合后用lmol/L的氢氧化钠或lmol/L的盐酸调整pH值最终至8.0。
[0017]实施例2，一种切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份计步骤如下:
甲醇20份，戊二醛25份，乙醚15份，用质量浓度为5%的PBS缓冲液稀释上述物质至100份；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖500g，充分混合；充分混合后用lmol/L的氢氧化钠或lmol/L的盐酸调整pH值最终至9.3。
[0018]实施例3，一种切片用固定液的配置方法，配方比例按重量份计步骤如下:
甲醇15份，戊二醛20份，乙醚10份，用质量浓度为5%的PBS缓冲液稀释上述物质至100份；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖400g，充分混合；充分混合后用lmol/L的氢氧化钠或lmol/L的盐酸调整pH值最终至9。[0019]应用实施例1，所述切片用固定液的应用，具体步骤如下:
(1)前处理:对肺癌肿瘤组织取材后直接放置于固定液内浸泡过夜固定，每ImL固定液浸泡一个组织标本；组织标本为l*lcm大小，Imm厚；
(2)蔗糖放置:将步骤(I)所得组织固定标本从固定液中取出，置于质量浓度为30%的蔗糖水溶液中放置Ih ；
(3)包埋:将步骤(2)所得组织浸入冰冻切片包埋剂OCT中浸透，放置12h；
(4)切片:步骤(3)所得组织冰冻切片机直接切片，并直接在冰冻切片机上沾片；
(5)洗涤:将切片后的组织经质量浓度为0.10%,pH为7.4的标准磷酸缓冲液内冲洗一次，随即可以进行染色或免疫组化试验。
[0020]使用本固定液的新方法，可以通过具有不同抗体针对性的免疫组化技术，对各种肺癌的组织分型和肿瘤来源进行鉴定和区分。例如:非小细胞肺癌的来源是支气管上皮的鳞状上皮细胞，为鳞状上皮癌的组织分型。小细胞肺癌来自于淋巴细胞相关抗原的阳性反应，为淋巴瘤来源的恶性肿瘤类型。肺泡腺癌的来源在于腺上皮细胞和粘液性细胞，为腺上皮或粘液腺癌的类型细胞。有一种恶性程度比较高的“燕麦”样细胞肺癌，通过免疫组化可以发现是体现出一种恶黑样细胞的抗原阳性，可以确定来源于皮肤上的恶性黑色素细胞瘤的转移或诱发。有些肺部肿瘤细胞呈现间皮瘤抗原表现，这是典型的结缔组织来源的间质肿瘤。某些边缘型肺癌呈现纤维细胞的抗原表型，可以确定为来自肺包膜，即胸膜肿瘤的情况。
[0021]各种肺癌发生来源确定对病情的判断和预后，以及今后的治疗方案确定具有重大的关联，而明确的肺癌类型诊断也是目前胸腔外科临床病理的一个重大难题。而本发明所述应用和免疫诊断技术也就是为肺癌诊断进行了一些巨大的改进，对肺癌的临床诊断和治疗具有很大的推进作用，对肺癌的临床诊断和治疗现状具有很大的实际意义。
[0022]应用实施例2，所述切片使用的固定液的应用，具体步骤如下:
(1)前处理:对乳房癌肿瘤组织取材后直接放置于固定液内浸泡过夜固定，每ImL固定液浸泡一个组织标本；组织标本为l*lcm大小，2mm厚；
(2)蔗糖放置:将步骤(I)所得组织固定标本从固定液中取出，置于质量浓度为40%的蔗糖水溶液中放置5h ；
(3)包埋:将步骤(2)所得组织浸入冰冻切片包埋剂OCT中浸透，放置IOh；
(4)切片:步骤(3)所得组织冰冻切片机直接切片，并直接在冰冻切片机上沾片；
(5)洗涤:将切片后的组织经质量浓度为0.05%%，pH为8的标准磷酸缓冲液内冲洗一次，随即可以进行染色或免疫组化试验。
[0023]乳房癌的诊断也涉及到很多的免疫组化问题。主要的是三种抗原，雌激素受体，孕激素受体，以及HER2抗原。前两者一般抗原性强，在石蜡切片上就进行了广泛使用。但是还是存在着很多的假阳性和假阴性。后者则抗原反应不是很强，一般情况下目前临床只是作为诊断的参考指标。使用本发明所述应用和免疫组化诊断后，雌激素受体和孕激素受体的反应可以进一步增强和提高，免疫组化的水平可以说基本上能够杜绝假阳性和假阴性的干扰。而HER2的免疫组化，就能将原来不可确定的水平标准提高到基本能够确定做诊断的标准。这个抗原其实对乳房癌的发生发展和组织来源的确定其科学意义很大，只是以前不能充分地检测确定，所以其意义没有更多地被认识到和运用到。[0024]应用实施例3，所述切片使用的固定液的应用，具体步骤如下:
(1)前处理:对淋巴组织取材后直接放置于固定液内浸泡过夜固定，每ImL固定液浸泡一个组织标本；组织标本为l*lcm大小，1.5mm厚；
(2)蔗糖放置:将步骤(I)所得组织固定标本从固定液中取出，置于质量浓度为40%的蔗糖水溶液中放置12h ；
(3)包埋:将步骤(2)所得组织浸入冰冻切片包埋剂OCT中浸透，放置24h；
(4)切片:步骤(3)所得组织冰冻切片机直接切片，并直接在冰冻切片机上沾片；
(5)洗涤:将切片后的组织经质量浓度为0.8%，pH为8的标准磷酸缓冲液内冲洗一次，随即可以进行染色或免疫组化试验。
[0025]对淋巴瘤和白血病的认识。由于人体血液内各种功能性的细胞很多，不同的类型细胞都有其不同的功能，也携带多种细胞的不同抗原。即便到形成造血免疫系统的恶性肿瘤，也会形成对不同类型细胞来源的肿瘤需要进行鉴别的要求。但是以前对于淋巴瘤和白血病肿瘤细胞的细胞学鉴别诊断技术上一直存在技术手段的缺陷，使得对是否是淋巴造血系统恶性肿瘤，以及是那种淋巴造血系统恶性肿瘤，很多在具体针对性的病理细胞学诊断上不能正确地确定。这实际上也影响了这些肿瘤的正确治疗。
[0026]使用本发明所述应用，能够对是否是淋巴造血系统恶性肿瘤，是哪个类型的淋巴造血系统恶性肿瘤，可以说有一个诊断上的明确的鉴别和鉴定。这对今后对这类疾病的诊断和治疗能起到很直接和巨大的帮助作用，而且对今后新型的治疗肿瘤的特效性药物的发现和研发，以及今后的临床实际使用，都可以说是意义非凡。
【权利要求】
1.一种切片用固定液的配置方法，其特征是配方比例按重量份计步骤如下: 甲醇10-20份，戊二醛10-25份，乙醚5-15份，用质量浓度为5%的PBS缓冲液稀释上述物质至100份，形成溶液；在上述溶液中每IL溶液添加蔗糖300-500g，充分混合，形成混合液；再在混合液中用lmol/L的氢氧化钠或lmol/L的盐酸调整pH值最终至8.0-9.3。
2.权利要求1所述切片用固定液的应用，其特征是具体步骤如下: (1)前处理:组织取材后直接放置于固定液内浸泡过夜固定，每ImL固定液浸泡一个组织标本；组织标本为l*lcm大小，1-2mm厚； (2)蔗糖放置:将步骤(I)所得组织固定标本从固定液中取出，置于质量浓度为30%-50%的蔗糖水溶液中放置l_12h ； (3)包埋:将步骤(2)所得组织浸入冰冻切片包埋剂OCT中浸透，放置l_24h； (4)切片:步骤(3)所得组织冰冻切片机直接切片，并直接在冰冻切片机上沾片； (5)洗涤:将切片后的组织经质量浓度为0.05%-0.10%，pH为7.4-8.6的标准磷酸缓冲液内冲洗一次，随即可以进行染色或免疫组化试验。
【文档编号】G01N1/36GK103471903SQ201310453621
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】吴天骥 申请人:吴天骥