一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒。该试剂盒包括：包被东部马脑脊髓炎病毒抗原的酶标反应板、洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM二抗、底物溶液和终止液，其中所述东部马脑脊髓炎病毒抗原为东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白。本发明所述的试剂盒可快速检测马科动物的东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体，使用安全。
【专利说明】—种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及采用ELISA方法检测东部马脑脊髓炎病毒抗体的试剂盒，尤指一种间接ELISA检测IgM抗体的试剂盒，适用于对马科动物血清中的东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体进行检测，属于动物检验检疫领域。
【背景技术】
[0002]东部马脑脊髓炎病毒(Easternequine encephalomyelitis virus, EEEV)是一种经节肢动物传播的病毒，属于披膜病毒科甲病毒属。病毒可感染马、鸟以及人类，可经Aedes, Coquillettidia和Culiseta属的蚊虫盯咬传播。该病毒在蚊虫和鸟类之间循环传播。马匹感染之后致死率可达到90%。本病的诊断方法包括临床检查，病理学检查，病毒分离和血清学检测。但对于实验室而言，往往并不能得到有关临床方面的信息，仅仅是接到独立的血清，有时仅凭抗体效价很难确定其感染情况。
[0003]血凝抑制试验(HI)和病毒中和实验(VN)是诊断疑似病例的标准方法，但在本病的地方流行地区，马匹往往接种过相关疫苗，使得实验室的血清学检测工作复杂化。
[0004]研究表明，对于马而言，感染本病后3天就可检出IgM抗体，但中和抗体7天后才能检出。而且IgM抗体可以持续30天左右。但IgG抗体可持续90天以上。因此检测IgM抗体对于马匹早期感染以及鉴别免疫接种抗体有一定意义。研究表明，E2蛋白暴露在病毒的表面，是决定病毒抗原性的主要成份，能够诱导动物产生中和抗体。
[0005]由于E2可诱生中和抗体，因此成为疫苗、诊断制剂研究的重点。本研究利用E2蛋白富含抗原表位，具有种特异性这一特点，运用原核高效表达系统进行E2结构蛋白的表达，以期获得大量纯化的E2重组蛋白，建立EEEV特异性IgM间接ELISA诊断方法，可应用到国内疫情监测和进出口马属动物的检测，为我国EEEV检测提供新的检测方法，同时为开发拥有自主知识产权的国产EEEV诊断试剂奠定基础。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，该试剂盒采用东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白作为包被抗原，可快速、准确地对马科动物的东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体作出评价。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0008]一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其包括:包被东部马脑脊髓炎病毒抗原的酶标反应板、洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM 二抗、底物溶液和终止液，其中所述东部马脑脊髓炎病毒抗原为东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白。该E2重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
[0009]进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照为东部马脑脊髓炎病毒IgM阳性血清；阴性对照为东部马脑脊髓炎病毒抗体呈阴性的马血清。[0010]进一步地，上述试剂盒中，所述洗涤液为PBST洗涤液(含0.5%Tween-20的
0.01mol/L、ρΗ7.4 的 PBS 溶液)。
[0011]所述样品稀释液为1%卵清蛋白溶液，取卵清蛋白lg，溶于IOOmLlXPBST缓冲液中。
[0012]所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。
[0013]所述底物溶液由5.0mL的TMB (lmg/mL)，42.5mL的柠檬酸-醋酸缓冲液(0.1mol/L, pH5.0),和2.5mL尿素过氧化氢(3mg/mL)混合而成。
[0014]本发明还提供了上述检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0015](I)东部马脑脊髓炎病毒抗原的制备:从东部马脑脊髓炎病毒总RNA中扩增获得了 E2基因片段，构建原核表达载体，在基因工程菌中高效表达，并将表达的E2重组蛋白纯化；
[0016](2)将步骤(I)得到的东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白包被于酶标反应板；
[0017](3)试剂盒组装:将步骤(2)制备的包被东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白的酶标反应板与洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM 二抗、底物溶液和终止液组装成试剂盒。
[0018]上述步骤中，E2重组蛋白包被于酶标反应板的具有方法为:将纯化的E2重组蛋白用包被液(PH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释为0.20 μ g/mL, 100 μ L/孔加入酶标反应板，包被条件为37°C lh，然后于4°C条件下过夜，然后弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，拍干反应板，加入I %卵清蛋白，100 μ L/孔，37 °C封闭2h，弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，拍干反应板，然后真空包装，存于4°C备用。
[0019]本发明的优点是:本发明选择东部马脑脊髓炎病毒保守的E2糖蛋白作为目标，经重组表达获得了 E2蛋白，以重组蛋白作为抗原建立了间接ELISA检测方法并研制出试剂盒，取得了优异的技术效果:
[0020]I)简便快速:可快速的对马科动物的东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体作出评价。
[0021]2)特异:与西部马脑脊髓炎病毒IgM阳性血清及委内瑞拉马脑脊髓炎病毒IgM阳性血清不发生交叉反应。
[0022]3)稳定:重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好。
[0023]4)安全:不接触病毒，不具有生物安全问题。
[0024]下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为EEEV-E2基因片段RT-PCR扩增产物电泳结果，M，DL2000分子量标准；1，阴性对照；2，EEEV-E2基因RT-PCR扩增产物。
[0026]图2为pET32a-EEEV-E2菌液PCR扩增产物的电泳结果，M，DL2000分子量标准；I?2，菌液PCR阳性结果；3，菌液PCR阴性结果。
[0027]图3为重组蛋白EEEV-E2的SDS-PAGE分析，M，蛋白质分子量；1，重组菌未诱导表达产物；2，重组菌诱导表达菌液上清；3，重组菌诱导表达4h产物；4，重组菌诱导表达6h产物。[0028]图4为重组蛋白EEEV-E2纯化前后的SDS-PAGE分析，M，蛋白质分子量；1、2，His.Bind Kits纯化前蛋白；3，纯化的重组蛋白。
[0029]图5为EEEV E2重组蛋白的western blotting鉴定。Μ,蛋白质分子量标准；1，pET32a空载体表达菌；2，重组表达菌未诱导产物；3，重组表达菌诱导6h表达产物。
【具体实施方式】
[0030]实验材料
[0031]TRIZ0L,购自 Invitrogen 公司；
[0032]限制性内切酶EcoR 1、Hind III，购自TaKaRa公司；
[0033]One-step RNA RT-PCR 试剂盒，购自 TaKaRa 公司；
[0034]胰蛋白胨及酵母粉:购自Oxiod公司；
[0035]IPTG, X-Gal 等:购自 TaKaRa 公司；
[0036]T4DNA连接酶:购自TaKara公司；
[0037]DNA快速纯化回收试剂盒，Min1-BEST质粒提取试剂盒，DL2000Maker，Ex HS Taq,
6X loading buffer,均购自 TaKaRa 公司；
[0038]三羟甲基氨基甲烷(Tris-碱)、甘氨酸:购自上海生物工程公司；
[0039]N’ N’ 一二甲基甲叉双丙稀酰胺、丙烯酰胺:购自华美生物工程公司；
[0040]BugBuster Protein Extraction Reagent,购自 Novagen 公司；
[0041]HIS.BIND蛋白纯化试剂盒,购自Novagen公司；
[0042]山羊抗马IgM 二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记，KPL公司产品。
[0043]底物TMB (Sigma)、BSA (MP Biomedicals)、明胶(MP Biomedicals)、脱脂奶(BD),购自中科科奥生物科技有限公司。
[0044]96孔平底聚苯乙烯酶标板,美国corning公司产品。
[0045]实施例1包被抗原E2重组蛋白的获得
[0046]1、方法
[0047]I) EEEV E2编码基因的序列分析
[0048]运用DNAMAN6.0，DNASTAR7.0，VECT0R NTI Advancel0.0软件包对东部马脑脊髓炎病毒E2蛋白的基本特性(包括分子量，等电点及潜在糖基化位点)进行预测。
[0049]2)EEEV E2基因特异性引物的设计与合成
[0050]分析GenBank 数据库中的 EEEV ssp.North American variant 株结构蛋白基因E2，通过序列比对，采用01igo6.0软件，设计了 I对包含E2完整基因的引物，命名为EEEV-E21和EEEV-E22，并在引物中引入酶切位点，旨在将E2基因克隆入表达载体pET32a，构建原核表达质粒pET32a-EEEV-E2。
[0051]引物编号、长度等见表1，其中斜体下划线表示引入的酶切位点。
[0052]表IEEEV结构蛋白基因E2引物编号、序列、目的片段长度及引入的内切酶
[0053]
【权利要求】
1.一种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:包被东部马脑脊髓炎病毒抗原的酶标反应板、洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM 二抗、底物溶液和终止液，其中所述东部马脑脊髓炎病毒抗原为东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，E2重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2 所示。
3.根据权利要求1或2所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。
4.根据权利要求3所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为PBST洗涤液。
5.根据权利要求3所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为I %卵清蛋白溶液。
6.根据权利要求3所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述终止液为2mol/L H2SO4溶液。
7.根据权利要求3所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述底物溶液为由5.0mL的浓度为lmg/mL TMB, 42.5mL的浓度为0.lmol/L,pH5.0朽1檬酸-醋酸缓冲液，和2.5mL的浓度为3mg/mL尿素过氧化氢组成的混合溶液。
8.—种检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤: (O东部马脑脊髓炎病毒抗原的制备:从东部马脑脊髓炎病毒总RNA中扩增获得了 E2基因片段，构建原核表达载体，在基因工程菌中高效表达，并将表达的E2重组蛋白纯化，该E2重组蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:2所示； (2)将步骤(I)得到的东部马脑脊髓炎病毒的E2重组蛋白包被于酶标反应板； (3)试剂盒组装:将步骤(2)制备的包被东部马脑脊髓炎病毒E2重组蛋白的酶标反应板与洗涤液、样品稀释液、辣根过氧化酶标记的山羊抗马IgM 二抗、底物溶液和终止液组装成试剂盒。
9.根据权利要求8所述检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，E2重组蛋白包被于酶标反应板的具体方法为:将纯化的E2重组蛋白用包被液稀释为0.20 μ g/mL, 100 μ L/孔加入酶标反应板,包被条件为37°C Ih,然后于4°C条件下过夜，然后弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，拍干反应板，加入I %卵清蛋白，100 μ L/孔，37°C封闭2h，弃去孔内液体，然后用洗涤液洗涤，拍干反应板，然后真空包装，存于4°C备用，其中，所述包被液为PH9.6的碳酸盐缓冲液。
10.权利要求1-7任一所述的检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体的ELISA试剂盒在检测东部马脑脊髓炎病毒IgM抗体中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK103575909SQ201310541091
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】谷强, 高志强, 刘环, 张鹤晓, 于军超, 张伟, 蒲静, 乔彩霞, 张利峰, 周琦, 汪琳, 吴丹 申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心