乙型肝炎表面抗原测定试剂盒以及检测方法
【专利摘要】本发明提供一种乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，包括试剂M、试剂R1、试剂R2以及校准品，试剂M中组分包括亲和素包被磁微粒，亲和素包被磁微粒经诊断试剂防腐剂处理；试剂R1中的组分包括生物素化Anti-HBs、磷酸盐缓冲液以及诊断试剂防腐剂；试剂R2中的组分包括吖啶酯标记的Anti-HBs、磷酸盐缓冲液以及诊断试剂防腐剂；对照组包括人源性乙肝表面抗原、新生牛血清以及诊断试剂防腐剂。本发明涉及的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，制备简单，使用方便，易于储存，可用于定量测定人体血清（血浆）中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的浓度，HBsAg检测可用于辅助诊断HBV感染和预防HBV通过血制品传播，也可用于急性、慢性乙肝患者的病程监测。
【专利说明】乙型肝炎表面抗原测定试剂盒以及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及乙型肝炎诊断试剂盒，具有设计基于双抗原化学发光原理的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的一种传染性疾病。HBV可以通过血液和体液直接传播，常见的传播方式包括输血、注射、伤口接触、母婴传播等；常见的临床症状有不适、发热、黄疸、无症状肝炎、暴发性肝炎以及慢性肝炎等，慢性感染易发展成为肝癌，因此，检测乙型肝炎的工作至关重要。
[0003]目前，常用的检测方法是免疫学检测，免疫学检测时基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对被检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质，激素等微量生物活性物质。免疫学检测经理了放射免疫检测、酶联免疫检测以及光生物学标记免疫检测技术三个阶段，使免疫学检测向着敏感性、准确性以及操作简捷性的方向发展。
[0004]化学发光免疫分析是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并借助其发光强度直接测定免疫结合。该方法灵敏度高、检测范围宽，是免疫学检测重要的发展方向。
【发明内容】
[0005]本发明解决了现有技术中的不足，提供一种灵敏度高、误差小、安全快速检测的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒及检测方法。
[0006]本发明的技术方案为:一种乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，包括试剂M、试剂R1、试剂R2以及校准品，所述试剂M中组分包括亲和素包被磁微粒，所述亲和素包被磁微粒经诊断试剂防腐剂处理；所述试剂Rl中的组分包括生物素化Ant1-HBs、磷酸盐缓冲液以及诊断试剂防腐剂；所述试剂R2中的组分包括吖啶酯标记的Ant1-HBs、磷酸盐缓冲液以及诊断试剂防腐剂；所述对照组包括人源性乙肝表面抗原、新生牛血清以及诊断试剂防腐剂。
[0007]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述亲和素包被磁微粒的亲和素为链霉亲和素、中性亲和素或类亲和素，所述亲和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三铁为内核表面包裹活性基团的聚合物，所述磁微粒的直径为1.5um。
[0008]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，试剂Rl和试剂R2中所述磷酸缓冲液的浓度均为0.01M，pH值为7.4。
[0009]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述诊断试剂防腐剂为0.1%的Proclin300 防腐剂。
[0010]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括,所述试剂Rl的量为6ml,所述试剂R2的量为12ml,所述试剂M的量为3ml。
[0011]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述校准品包括校准品I和校准品2两组，所述校准品I的量为0.5ml，HBsAg浓度为0.1 IU/ml，所述校准品2的量为0.5ml, HBsAg浓度为30IU/ml。
[0012]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，一种使用该乙型肝炎表面抗原测定试剂盒的检测方法，包括以下几步:
[0013](I)在将待测样品和含有生物素化Ant1-HBs的试剂Rl进行反应，形成含有抗原-抗体复合体的反应液I ;
[0014](2)在反应液I中加入含有亲和素包被磁微粒的试剂M,反应液I中的复合体在生物素和亲和素的相互作用下形成固相，得到了反应液2 ；
[0015](3)反应液2置于一个磁场内，检测其中的磁微粒将被吸附，通过洗涤液洗涤，将未结合物冲洗除去，得到反应液3 ；
[0016](4)在反应液3中加入含有吖啶酯标记的Ant1-HBs的试剂R2，吖啶酯标记的Ant1-HBs与磁微粒上的HBsAg复合物反应，得到反应液4 ；
[0017](5)将反应液4置于化学发光测定仪上进行检测，在磁场中磁微粒将被吸附，通过洗涤液洗涤，将未结合物冲洗除去；然后，注入化学发光激发液I及化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；产生的光强度与样本内乙型肝炎表面抗原浓度成正比。
[0018]本发明的一个较佳实施例中，进一步包括，所述化学发光激发液I中含有过氧化氢，所述化学发光激发液2中含有氢氧化钠，所述洗涤液含有磷酸盐缓冲液。
[0019]本发明的解决了现有技术的缺陷，具有以下有益效果:
[0020]1.本发明涉及的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，制备简单，使用方便，易于储存，可用于定量测定人体血清(血浆)中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的浓度，HBsAg检测可用于辅助诊断HBV感染和预防HBV通过血制品传播，也可用于急性、慢性乙肝患者的病程监测。使用该试剂盒来的检测方法是基于双抗原化学发光原理，该方法灵敏度高、误差小、安全快速。
【具体实施方式】
[0021 ] 为了使本【技术领域】的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0022]本发明一种乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，组要组成成分如下:
[0023]试剂Rl:每瓶6ml，内含有生物素化Ant1-HBs，0.0lMpH值7.4磷酸盐缓冲液，
0.l%Proclin300诊断试剂防腐剂；
[0024]试剂R2:每瓶12ml，内含有吖啶酯标记的Anti_HBs，0.0lMpH值7.4磷酸盐缓冲液,0.l%Proclin300诊断试剂防腐剂；其中，吖唳酯标记的Ant1-HBs以吖唳酯通过偶联剂偶联Ant1-HBs，偶联剂可以选择二甲基亚胺或戊二醛或者其他业内常用的偶联剂；
[0025]试剂M:每瓶3.0ml,内含亲和素包被的磁微粒,经0.l%Proclin300诊断试剂防腐剂防腐处理；其中，亲和素包被磁微粒的亲和素为链霉亲和素、中性亲和素或类亲和素，亲和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三铁为内核表面包裹活性基团的聚合物，所述磁微粒的直径为1.5um。
[0026]校准品(Cal):本发明实施例中的校准品分为I和2两组，均内含人源性的乙肝表面抗原(HBsAg),新生牛血清,0.l%Proclin300诊断试剂防腐剂；校准品浓度如下:Call的近似浓度为0.10IU/ml, Cal2的近似浓度为30.00IU/ml。
[0027]本发明的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒用于测定人血清(血浆)中乙型肝炎表面抗原的浓度，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙肝病毒颗粒的外壳成分，是乙肝病毒HBV感染的首选免疫学标志物。HBsAg检测可用于辅助诊断HBV感染和预防HBV通过血制品传播，也可用于急、慢性乙肝患者的病程监测。
[0028]本发明使用该试剂盒的检测原理是采用双抗原化学发光原理，步骤如下:
[0029]第一步反应:将样本和生物素化乙肝病毒表面抗体(Ant1-HBs)(试剂Rl)进行反应，如果标本中含有HBsAg，将形成抗原-抗体复合体。
[0030]第二步反应:加入亲和素包被的微粒(试剂M)，复合体在生物素和亲和素相互作用下形成固相。
[0031]第三步反应:将反应液置于一个磁场内，检测中的磁微粒将被吸附，通过洗涤，将未结合物冲洗除去。
[0032]第四步反应:加入卩丫唳酯标记的Ant1-HBs (试剂R2),与磁颗粒上的HBsAg复合物反应。
[0033]将反应液置于一个磁场内，检测中的磁微粒将被吸附，通过洗涤，将未结合物冲洗除去；然后，注入化学发光激发液I及化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；产生的光强度与样本内HBsAg浓度成正比。样本内分析物的量由所储存的多点校准曲线来确定。
[0034]实施例1
[0035]本发明具体实施例中的具体实验步骤如下:
[0036]首先，要获得待测样品，即血清，按照常规应用技术采集全血标本，放置半小时以上使凝集，在3000rpm的转速下离心10分钟以上，使血清分离完全，血清中不含细胞成分；血浆用肝素钠、EDTA-K3、枸橼酸钠或氟化钠/草酸钾抗凝。
[0037]然后，对该待测样品使用乙型肝炎表面抗原测定试剂盒进行检测:
[0038](I)在将待测样品和含有生物素化Ant1-HBs的试剂Rl进行反应，形成含有抗原-抗体复合体的反应液I ;
[0039](2)在反应液I中加入含有亲和素包被磁微粒的试剂M,反应液I中的复合体在生物素和亲和素的相互作用下形成固相，得到了反应液2 ；
[0040](3)反应液2置于一个磁场内，检测其中的磁微粒将被吸附，通过洗涤液洗涤，将未结合物冲洗除去，得到反应液3 ；
[0041](4)在反应液3中加入含有吖啶酯标记的Ant1-HBs的试剂R2，吖啶酯标记的Ant1-HBs与磁微粒上的HBsAg复合物反应，得到反应液4 ；
[0042](5)将反应液4置于化学发光测定仪上进行检测，在磁场中磁微粒将被吸附，通过洗涤液洗涤，将未结合物冲洗除去；然后，注入化学发光激发液I及化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；产生的光强度与样本内乙型肝炎表面抗原浓度成正比。
[0043]其中，所述化学发光激发液I中含有过氧化氢，所述化学发光激发液2中含有氢氧化钠，所述洗涤液含有磷酸盐缓冲液。
[0044]在本发明的实施例中如果待测样品是在24小时之内使用，可于2_8°C下保存，如果需要超过24小时的长期存放应该保存在_20°C以下，并且避免样品反复冻融。
[0045]本发明实施例中的化学发光测定仪是EVERESYSA1800 I类，在检测时，将试剂装载到化学发光测定仪试剂仓上，并在软件操作系统上确定装载就试剂的名称；试剂在装载前，应轻轻混匀，但禁止上下颠倒已打开的试剂；将检测样本装载在样本仓中，并在软件操作系统上确定样本检测项目；将反应杯装载满，也可以根据实验情况装载相应数量反应杯；每次检测样本量需要50ul，考虑检测系统死体积因素，应确保样本量在200ul以上，同时应考虑样本容器的死腔因素。
[0046]结果计算
[0047]测定仪自动计算得出每份标本的测定浓度(单位为IU/mL)。标本的HBsAg含量< 0.lIU/mL判断为HBsAg无反应性；标本的HBsAg含量≤0.lIU/mL判断为HBsAg反应性。
[0048]最低检测限
[0049]使用上述方法检测，测得试剂的灵敏度< 0.03IU/mL ;检测3种亚型国家系列灵敏度参考品，符合标准；检测3份国家阳性参考品，符合标准。
[0050]检测范围
[0051]本检测方法的检测范围为0.1~150IU/mL。
[0052]精密度
[0053]精密度依照美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS) EP5-A方案制定，对5份HBsAg质控品(其中三份血清，二份为校准品)，采用同一批次试剂，每天不同时间各检测一次，每次双孔，共进行20天，实验结果如下表1所示。
[0054]表1实验结果
【权利要求】
1.一种乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，其特征在于，包括试剂Μ、试剂R1、试剂R2以及校准品，所述试剂M中组分包括亲和素包被磁微粒，所述亲和素包被磁微粒经诊断试剂防腐剂处理；所述试剂Rl中的组分包括生物素化Ant1-HBs、磷酸盐缓冲液以及诊断试剂防腐剂；所述试剂R2中的组分包括吖啶酯标记的Ant1-HBs、磷酸盐缓冲液以及诊断试剂防腐齐IJ;所述对照组包括人源性乙肝表面抗原、新生牛血清以及诊断试剂防腐剂。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，其特征在于，所述亲和素包被磁微粒的亲和素为链霉亲和素、中性亲和素或类亲和素，所述亲和素包被磁微粒中的磁微粒是以四氧化三铁为内核表面包裹活性基团的聚合物，所述磁微粒的直径为1.5um。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，其特征在于，试剂Rl和试剂R2中所述磷酸缓冲液的浓度均为0.0lM, pH值为7.4。
4.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂防腐剂为0.1%的Proclin300防腐剂。
5.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，其特征在于，所述试剂Rl的量为6ml,所述试剂R2的量为12ml,所述试剂M的量为3ml。
6.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒，其特征在于，所述校准品包括校准品I和校准品2两组，所述校准品I的量为0.5ml，HBsAg浓度为0.1 IU/ml，所述校准品2的量为0.5ml, HBsAg浓度为30 IU/ml。
7.一种使用权利要求1-6所述的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下几步: (1)在将待测样品和含有生物素化Ant1-HBs的试剂Rl进行反应，形成含有抗原-抗体复合体的反应液I ; (2)在反应液I中加入含有亲和素包被磁微粒的试剂M，反应液I中的复合体在生物素和亲和素的相互作用下形成固相，得到了反应液2 ； (3)反应液2置于一个磁场内，检测其中的磁微粒将被吸附，通过洗涤液洗涤，将未结合物冲洗除去，得到反应液3; (4)在反应液3中加入含有吖啶酯标记的Ant1-HBs的试剂R2，吖啶酯标记的Ant1-HBs与磁微粒上的HBsAg复合物反应，得到反应液4 ； (5)将反应液4置于化学发光测定仪上进行检测，在磁场中磁微粒将被吸附，通过洗涤液洗涤，将未结合物冲洗除去；然后，注入化学发光激发液I及化学发光激发液2，检测其化学发光光子强度；产生的光强度与样本内乙型肝炎表面抗原浓度成正比。
8.根据权利要求7所述的乙型肝炎表面抗原测定试剂盒的检测方法，其特征在于，所述化学发光激发液I中含有过氧化氢，所述化学发光激发液2中含有氢氧化钠，所述洗涤液含有磷酸盐缓冲液。
【文档编号】G01N21/76GK103630531SQ201310652173
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】陈秀发, 胡庆锋, 常立峻, 徐海伟, 李勇 申请人:苏州长光华医生物医学工程有限公司