一种硒的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种硒形态及单质硒、总硒的检测方法，选用了不同仪器生产厂家的色谱分离系统和原子荧光分光光度计组合成HPLC-HG-AFS联用系统，可进行形态硒分析、单质硒及样品中无机硒、总硒的测定方法：测定结果准确；通过总硒、无机硒的测定，采用总硒减去无机硒的方法可间接得到有机硒含量，可形成形态分析法测定总硒、无机硒、有机硒的新技术。该方法可移植性强，使用方便灵活，具有推广应用价值。
【专利说明】—种砸的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种硒的检测方法。
【背景技术】
[0002]目前，硒的形态分析方法是硒检测技术发展的必然趋势，国内外研究者以HPLC-1CP-MS、HPLC-MS-MS、GC-MS等联用技术为基础，对硒代氨基酸和无机硒的形态分析方法做了大量的研究工作，但没有形成标准。近些年来，在我国发展起来的HPLC-HG-AFS联用技术，采用高效液相色谱分离-在线氢化物发生-原子荧光检测法进行形态分析，结合了HPLC高效分离和AFS高灵敏度的优势，对能够形成氢化物的元素形态进行分析，是现阶段元素形态发展的主要方向。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种使用方便的硒的检测方法。
[0004]本发明的技术方案是:一种硒的检测方法，其特征在于包含以下步骤:a.分析仪器系统配置:将色谱分离系统、原子荧光分光光度计及硒形态预处理装置组合成HPLC-HG-AFS联用系统；色谱柱要能够对Se034+、Se046+、硒代氨基酸及衍生物、二甲基硒、硒脲小分子物质有保留的C18柱或阴离子交换柱；所述的硒形态预处理装置为能够与色谱分离系统连接，将色谱系统分离的待测样品中含硒成分转化为氢化物的硒形态预处理装置；
[0005]b.仪器分析方法:流动相为不同浓度的(NH4) 2ΗΡ04缓冲液或添加有机试剂的溶液；洗脱方式采用30mM-150mM的pH3-9磷酸氢二铵缓冲液配制成一种流动相等度洗脱或改变流速进行梯度洗脱，也可配制成2种以上不同浓度的流动相，通过改变流动相的比例进行梯度洗脱；进样可采用手动或自动2种方式，进样体积在0.1 μ L-100 μ L之间；其它参数按照仪器设备使用说明书推荐设定；所述的添加有机试剂的溶液为添加甲醇或其它有机试剂的溶液；
[0006]c.硒形态的检测方法:提取溶剂为0.1-1N的HCl、HC104、Na0H、胃蛋白酶K水溶液和50%-100%的CH3OH溶液，用HCl和HClO4提取的溶液，用NaOH溶液调节pH值到5_6 ;用NaOH提取的溶液用盐酸调节pH值到8-9 ;胃蛋白酶K水提取液和50%_100%的CH3OH提取液不调节PH值；提取液均经0.45 μ m滤膜过滤后上机硒的形态，对有标准物质的成分可以定性定量测定，没有标准物质的成分可为进一步研究提供依据；根据色谱图中峰的分离状况和峰闻可确定最佳的提取方法；
[0007]d.单质硒的测定:采用少量HNO3、王水或HN03+HC104溶解后，用NaOH溶液调节pH值到5-6，经0.45 μ m滤膜过滤后上机测定，用外标法计算SeO34+的含量，计算硒的回收率，以确定方法的可行性；
[0008]e.无机硒的测定:定性定量测定样品浸提液中的SeO34+和SeO46+的含量，和为无机硒总量，采用总硒减无机硒的方法可得有机硒含量；
[0009]f.总硒含量的测定:按照GB方法进行样品消化，消化时可不加盐酸还原，再用NaOH溶液调节pH值至5-6，定容后上机测定，用外标法计算SeO34+和SeO46+的含量，和为总硒含量。
[0010]本发明采用不同厂家的高效液相色谱和原子荧光形态分析仪组成HPLC-HG-AFS联用仪，系统地进行了 SeCys2、SeMet、Se (IV)、MeSeCys和Se (VI)等5种硒形态的仪器分析条件、检测限、线性范围及样品中硒形态的提取方法等方面的研究，建立了富硒产品中硒的形态分析方法。
[0011]本发明的有益效果是:该技术采用高效液相色谱分离-在线氢化物发生-原子荧光检测法进行形态分析，结合了 HPLC高效分离和AFS高灵敏度的优势，使多种含硒成分可以通过HPLC快速分离后，被原子荧光检测器检测，其检测灵敏度是紫外检测器的1000倍以上，检测限可达0.82?7.47ng，曲线范围达两个数量级，可以满足样品中微量硒形态分析的需求。该技术可作为SeCYs2、SeMet, Se (IV)、MeSeCys和Se(VI)等5种硒形态的检测方法，也可进行单质硒及样品中无机硒、总硒的测定方法；作为无机硒的检测方法时，Se(IV)和Se(VI)可完全分开，避免了样品中其它成分的干扰，测定结果准确；进行总硒测定时，消化时不需要盐酸还原，不需要加掩蔽剂，可形成标准方法。通过以上总硒、无机硒的测定，采用总硒减去无机硒的方法可间接得到有机硒含量，可形成形态分析法测定总硒、无机硒、有机硒的新技术。该方法可移植性强，可以选用不同仪器生产厂家的色谱分离系统和原子荧光分光光度计进行组合，具有推广应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]附图1 是 SeCys2, SeMet, Se(IV)、MeSeCys (1000 μ g/L)、Se(VI) (751 μ g/L)标准样品形态分析图，进样量:20μ L ;(百分比法单谱图)；
[0013]附图2 是 SeCys2 工作曲线 s = 12983.0c+1544.8 ；R = 0.9996 ；
[0014]附图3 是 SeMet 工作曲线 s = 110725.6c_18528.6 ；R = 0.9992 ；
[0015]附图4 是 Se(IV)工作曲线 s = 37088.8c_4825.8 ；R = 0.9997 ；
[0016]附图5 是 MeSeCys 工作曲线 s = 9641.4c_15961.2 ；R = 0.9988 ；
[0017]附图6 是 Se(IV)工作曲线 s = 4292.4c_3407.4 ；R = 0.9987 ；
[0018]附图7是0.5N NaOH溶液提取碎米荠样品的色谱图(稀释40倍，进样量20 μ L，从左到右3个主要峰分别为SeCys2、t2.99min和Se(IV))；(外标校正单谱图)。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0020]实施例1:本发明一种硒的检测方法，包含以下步骤:a.分析仪器系统配置:将色谱分离系统、原子荧光分光光度计及硒形态预处理装置组合成hplc-hg-afs联用系统；色谱柱要能够对Se034+、Se046+、硒代氨基酸及衍生物、二甲基硒、硒脲小分子物质有保留的C18柱或阴离子交换柱；所述的硒形态预处理装置为能够与色谱分离系统连接，将色谱系统分离的待测样品中含硒成分转化为氢化物的硒形态预处理装置；
[0021]b.仪器分析方法:流动相为不同浓度的(NH4) 2ΗΡ04缓冲液或添加有机试剂的溶液；洗脱方式采用30mM-150mM的pH3-9磷酸氢二铵缓冲液配制成一种流动相等度洗脱或改变流速进行梯度洗脱，也可配制成2种以上不同浓度的流动相，通过改变流动相的比例进行梯度洗脱；进样可采用手动或自动2种方式，进样体积在0.1 μ L-1OO μ L之间；其它参数按照仪器设备使用说明书推荐设定；所述的添加有机试剂的溶液为添加甲醇或其它有机试剂的溶液；
[0022]c.硒形态的检测方法:提取溶剂为0.1-1N的HCl、HC104、Na0H、胃蛋白酶K水溶液和50%-100%的CH3OH溶液，用HCl和HClO4提取的溶液，用NaOH溶液调节pH值到5_6 ;用NaOH提取的溶液用盐酸调节pH值到8-9 ;胃蛋白酶K水提取液和50%_100%的CH3OH提取液不调节PH值；提取液均经0.45 μ m滤膜过滤后上机硒的形态，对有标准物质的成分可以定性定量测定，没有标准物质的成分可为进一步研究提供依据；根据色谱图中峰的分离状况和峰闻可确定最佳的提取方法；
[0023]d.单质硒的测定:采用少量HNO3、王水或HN03+HC104溶解后，用NaOH溶液调节pH值到5-6，经0.45 μ m滤膜过滤后上机测定，用外标法计算SeO34+的含量，计算硒的回收率，以确定方法的可行性；
[0024]e.无机硒的测定:定性定量测定样品浸提液中的SeO34+和SeO46+的含量，和为无机硒总量，采用总硒减无机硒的方法可得有机硒含量；
[0025]f.总硒含量的测定:按照GB方法进行样品消化，消化时可不加盐酸还原，再用NaOH溶液调节pH值至5-6，定容后上机测定，用外标法计算SeO34+和SeO46+的含量，和为总硒含量。
[0026]实施例2:本发明一种硒的检测方法，
[0027]1、仪器与试剂
[0028]硒形态分离系统采用高效液相色谱仪(美国Waters2695分离单元)，氢化物发生采用SAP-10形态分析预处理系统、检测系统和数据采集、处理系统采用AFS-913d原子荧光分光光度计及相关软件(北京吉天仪器有限公司)、样品消解采用海能SH230石墨消解仪、硒形态提取采用TMS-200超级恒温混匀仪(杭州奥盛仪器有限公司)。
[0029]盐酸(GR)、硝酸(GR)为优级纯，高氯酸(AR)、氢氧化钠和甲醇为分析纯。
[0030]胃蛋白酶K (Merck公司)、硒代蛋氨酸(SeMet, Sigma公司)、硒代胱氨酸(SeCys,Sigma公司)，硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys, Sigma公司)配制成100 μ g.mL—1的忙备液；硒酸根标准溶液(GBW10033:国家标准物质中心，75.1 μ g.mL—1)、亚硒酸根标准溶液(GBW10032,国家标准物质中心，68.9 μ g.mL—1)为原液。
[0031]混合标准溶液配制:取硒代蛋氨酸(贮备液)、硒代胱氨酸(贮备液)、亚硒酸根(原液)、硒甲基硒代半胱氨酸(贮备液)、硒酸根(原液)100 μ L、100 μ L、50 μ L、200 μ L、200 μ L于IOmL容量瓶中，用水定容，各组分浓度分别为I μ g.mL'l μ g.mL'0.3445 μ g.mL—1和2 μ g.mL 1 和 1.52 μ g.mL 沁既 lng.μ L \ lng.μ L \θ.3445ng.μ L 1 和 2ng.yL^P1.52ng.μ L^10此混标溶液作为标准待测液。
[0032]2、材料与方法
[0033]2.1 材料`
[0034]微生物硒肥(恩施州硒资源开发与应用技术研究院课题组研制)，硒虫草胶囊(湖北圣峰药业有限公司)，碎米荠(恩施莲花池大棚)。
[0035]2.2 方法
[0036]2.2.1 SeCYs2、SeMet、Se (IV)、MeSeCys 和 Se(VI)分离的仪器方法见表 I。[0037]表1硒形态分析仪器条件
[0038]
【权利要求】
1.一种硒的检测方法，其特征在于包含以下步骤:a.分析仪器系统配置:将色谱分离系统、原子荧光分光光度计及硒形态预处理装置组合成hplc-hg-afs联用系统；色谱柱要能够对SeO3' Se046+、硒代氨基酸及衍生物、二甲基硒、硒脲小分子物质有保留的C18柱或阴离子交换柱；所述的硒形态预处理装置为能够与色谱分离系统连接，将色谱系统分离的待测样品中含硒成分转化为氢化物的硒形态预处理装置； b.仪器分析方法:流动相为不同浓度的(NH4)2ΗΡ04缓冲液或添加有机试剂的溶液；洗脱方式采用30mM-150mM的pH3_9磷酸氢二铵缓冲液配制成一种流动相等度洗脱或改变流速进行梯度洗脱，也可配制成2种以上不同浓度的流动相，通过改变流动相的比例进行梯度洗脱；进样可采用手动或自动2种方式，进样体积在0.1yL-1OOyL之间；其它参数按照仪器设备使用说明书推荐设定；所述的添加有机试剂的溶液为添加甲醇或其它有机试剂的溶液； c.硒形态的检测方法:提取溶剂为0.1-1N的HC1、HClO4, NaOH、胃蛋白酶K水溶液和50%-100%的CH3OH溶液，用HCl和HClO4提取的溶液，用NaOH溶液调节pH值到5_6 ;用NaOH提取的溶液用盐酸调节PH值到8-9 ;胃蛋白酶K水提取液和50%-100%的CH3OH提取液不调节PH值；提取液均经0.45 μ m滤膜过滤后上机硒的形态，对有标准物质的成分可以定性定量测定，没有标准物质的成分可为进一步研究提供依据；根据色谱图中峰的分离状况和峰闻可确定最佳的提取方法； d.单质硒的测定:采用少量HNO3、王水或HN03+HC104溶解后，用NaOH溶液调节pH值到5-6，经0.45 μ m滤膜过滤后上机测定，用外标法计算SeO34+的含量，计算硒的回收率，以确定方法的可行性； e.无机硒的测定:定性定量测定样品浸提液中的SeO34+和SeO46+的含量，和为无机硒总量，采用总硒减无机硒的方法可得有机硒含量； f.总硒含量的测定:按照GB方法进行样品消化，消化时可不加盐酸还原，再用NaOH溶液调节PH值至5-6，定容后上机测定，用外标法计算SeO34+和SeO46+的含量，和为总硒含量。
【文档编号】G01N21/64GK103884785SQ201310658482
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2013年12月9日
【发明者】陈永波, 李红英, 胡百顺, 孙杨柳, 朱云芬, 郭光耀 申请人:恩施土家族苗族自治州农业科学院