用于评估具有嗜淋巴特性的病毒的存活力的方法
【专利摘要】用途：医药和生物技术。目的：增加确定由具有嗜淋巴性的病毒引起的感染的可靠性，消除EIA和PCR测试过程中测试血液中嗜淋巴病毒的存在的假阴性反应，和检测病毒颗粒浓度低于EIA或PCR方法灵敏度阈值的生物材料中具有嗜淋巴性的病毒。发明本质：用于评估具有嗜淋巴性的病毒的存活力的方法包括收集生物材料和通过进行聚合酶链式反应(PCR反应)确定所述材料是否含有病毒RNA或DNA。此外，从健康人的血液中采集淋巴细胞悬液，向该淋巴细胞中添加等体积的生物材料。然后将这种组合混合，在37℃的温度孵育6-8小时期间，并且将淋巴细胞从血浆洗出并破坏。然后将淋巴细胞细胞质进行PCR测试。淋巴细胞细胞质中检测到病毒RNA或DNA表明病毒已经保留其存活力。淋巴细胞细胞质中不存在病毒RNA或DNA表明病毒的灭活。
【专利说明】用于评估具有嗜淋巴特性的病毒的存活力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测具有低浓度病毒颗粒的生物基质中具有嗜淋巴特性的病毒、评估 它们的存活力和消除EIA和PCR测试的假阴性结果的方法，并且可用于医疗行业和生物技 术中。
【背景技术】
[0002] 通过在细胞培养物中分离而检测生物基质中的病毒是众所周知的方法。通过细胞 培养方法分离的病毒通过血球吸附、血细胞凝集或间接免疫荧光方法来鉴定。适当采样和 在适当介质上短时转运至实验室场地对于培养物中病毒分离的有效分离是必不可少的。它 保留了病毒存活力，并限制细菌和真菌繁殖（病毒感染的实验室诊断，在线=http =//www. center-hc. ru/)。许多病毒，特别是乙肝病毒（HBV)、丙肝病毒（HCV)和人类免疫缺陷病毒 (HIV)是只影响人类细胞、因此只引起人类疾病的人类病毒（anthroponotic viruses)。这 些感染没有实验模型。此外，特别是在乌兹别克斯坦共和国没有可以体外充分研究这些病 毒的细胞病变特性和存活力的培养的细胞培养物。而且，由于其复杂性，在细胞培养物上分 离病毒的方法不用于诊断目的。
[0003] 用于检测生物材料中的病毒的免疫学方法被称为酶联免疫吸附试验（ELISA)，其 基于通过检测几种病毒抗原的抗体并使用从感染细胞提取或通过基因工程产生的特定病 毒蛋白(Ilyina,E. N. et. al. Chronic virus liver diseases "Khronicheskiye virusnye zabolevaniya pecheni，'Methodological manual for physicians "Metodicheskoye posobiye dlya vrachej，'Moscow, 2001, p. 7-11) 〇
[0004] 在一些病毒感染例如HCV中，EIA只检测抗体，因此显著限制了评估感染的进展和 活跃度的能力。此外，EIA具有灵敏度阈值，低于该阈值，病毒的检测是不可能的。
[0005] 与声称的检测生物材料中具有嗜淋巴特性的病毒的方法最接近，病毒存活力评估 以及EIA和PCR的假阴性结果的排除是通过采样生物材料检测病毒RNA或DNA和通过聚合 酶链式反应（PCR)检测病毒 RNA 或 DNA 的存在（Ilyina，E.N.et.al. Chronic virus liver diseases "Khronicheskiye virusnye zabolevaniya pecheni''Methodological manual for physicians "Metodicheskoye posobiye dlya vrachej，'Moscow,2001,p.7-11)〇
[0006] 该方法涉及在生物材料中检测病原体的直接方法，从而允许评估病毒过程的活跃 度。阳性PCR反应高概率地证实了肝和血液中病毒的存在。生物样品（血浆或血液蛋白， 组织或器官的活检材料）的PCR并不总是能够检测由具有嗜淋巴特性的病毒引起的感染， 尽管这种病毒可以在淋巴组织以明显高浓度存在（PCR的假阴性结果），反之亦然，阳性PCR 可以在没有病毒存在的情况下获得。此外，PCR具有灵敏度阈值，低于该阈值，该方法无法 检测病毒存在。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是增加由具有嗜淋巴特性的病毒引起的感染检测的可靠性，消除通 过EIA和PCR测试血液中嗜淋巴病毒的存在的假阴性结果，检测病毒浓度低于IFA或PCR 方法灵敏度阈值的生物材料中具有嗜淋巴特性的病毒。
[0008] 指定的目标通过以下解决：通过采样生物材料评估具有嗜淋巴特性的病毒的存活 力，通过聚合酶链式反应（PCR)检测病毒RNA或DNA的存在；另外从健康人血液获得淋巴细 胞悬液并添加等量的生物材料；将混合物搅拌，并在37°C孵育6-8小时；从血浆洗出淋巴细 胞并破坏淋巴细胞；将淋巴细胞的细胞质进行PCR测试。在淋巴细胞的细胞质中检测到病 毒RNA或DNA表明病毒的保存的存活力；淋巴细胞的细胞质中不存在病毒RNA或DNA表明 病毒的灭活。血浆或血清，组织或器官的活检样品，来自医疗器械的洗出物可以用作生物样 品。这种方法允许评估HBV、HCV或HIV病毒的存活力。
[0009] 指定的目标通过以下解决：通过从怀疑被嗜淋巴病毒感染的患者获得血液消除 EIA和PCR假阴性结果，并将6-8ml血液采样到含有2,0ml生理盐水和2-3滴肝素的试管 中；从血液中分离淋巴细胞，并在37°C孵育6-8小时；从血浆洗出淋巴细胞并破坏，并且将 淋巴细胞的细胞质进行PCR ;在淋巴细胞的细胞质中检测到病毒RNA或DNA表明病毒的存 在；淋巴细胞的细胞质中不存在病毒RNA或DNA表明血液中不存在病毒。将患者的淋巴细 胞的内容物进行PCR测试。
[0010] 已知许多病毒，特别是乙肝病毒（HBV)、丙肝病毒（HCV)和人类免疫缺陷病毒 (HIV)的那些可以在单核血细胞、特别是淋巴细胞和巨噬细胞中复制。已知，HBV-和HCV-感 染同时引起肝脏中的炎性过程，伴随所有后续肝炎，以及继发性免疫缺陷，具有各种程度的 T-淋巴细胞减少和B-淋巴细胞减少，T-淋巴细胞调节亚群（T-辅助细胞和T-抑制细胞） 的失衡，免疫调节指数（IRI)和异常Y球蛋白血症（dysgammaglobulinemia)的降低。免 疫缺陷的程度和等级与肝脏中病理过程的程度无关。具有慢性HBV和HCV感染的患者在一 段时间后在肝脏组织中具有不同强度的病理过程，从弱到表达，但是不管这个，继发性免疫 缺陷稳定且稳态恶化。
[0011] 各种疾病分类形式的慢性病毒性肝炎中肝脏组织损伤程度和继发性免疫缺陷程 度的分解支持以下想法：HBV和HCV感染中的肝炎和继发性免疫缺陷相关，相互加重，但并 不互为条件：换言之，一起具有嗜肝特性的HBV和HCV具有表达的嗜淋巴特性-直接引起继 发性免疫缺陷的特性。肝脏组织损伤的临床表现和HBV和HCV感染中免疫缺陷程度的差异 是由于在这些病毒的嗜肝和嗜淋巴特性程度的差异。即，病毒的嗜肝和嗜淋巴特性程度的 差异确定这些疾病的各个阶段中慢性HBV和HCV感染的发病机制、临床表现和抗病毒治疗 效果模式的差异。
[0012] 除了继发性免疫缺陷形成以外，HBV和HCV和HIV的嗜淋巴特性的一致性也通过 其流行病学特点、转移机制、相关机会性感染的进展（频繁的呼吸系统疾病，肠道感染），特 别是生物体的不同组织中淋巴肉芽肿病的发展来证实。在生物体的各种器官和组织中淋巴 滤泡簇（这是淋巴肉芽肿病）的发展被认为对于淋巴样细胞系统的病毒感染是固有的。
[0013] 考虑到无论血清滴度的HBV的嗜淋巴特性，HBV可以基本上以高浓度在淋巴样要 素的细胞质中永久存在。这种现象被用于这种可靠增加和消除EIA和PCR的假阴性结果和 检测病毒颗粒浓度低于EIA或PCR的测试灵敏度阈值的生物材料中的嗜淋巴病毒的方法 中。
[0014] 我们在这种评估病毒存活力的方法中使用HBV、HCV和HIV的嗜淋巴特性，所述存 活力是这些病毒在其体外孵育过程中穿透健康人淋巴细胞并在健康人淋巴细胞中细胞内 存在的能力。
[0015] 具有嗜淋巴特性的病毒、特别是HBV、HCV和HIV的存活力的评估需要，在长期储存 病毒之后，控制各种消毒化学物质和物理因素针对这些病毒的抗病毒功效，以及控制抗病 毒治疗。
[0016] 下面是用于评估具有嗜淋巴特性的病毒的存活力的方法的描述，其如下进行。
[0017] I.产牛具有嗜淋巴特件的病毒悬液
[0018] 为了产生病毒悬液，获得生物材料（血浆或血清，组织或器官的活检样品，来自医 疗器械的洗出物）。然后将生物材料进行定量PCR，以验证具有嗜淋巴特性的病毒的存在和 定量病毒滴度。将包含病毒的生物材料在低于_25°C温度的冰箱中保持冷冻状态。
[0019] II.从健康人夸试者产牛淋巴细朐悬液:
[0020] a)通过EIA测试健康志愿者的嗜淋巴病毒感染。在研究中使用对于研究病毒具有 阴性结果的来自健康人的淋巴细胞；
[0021] b)为了接受足量淋巴细胞，在早上从空腹健康人受试者的肘静脉采集20-30ml的 量的血液。然后将每7-8ml的血液转移到含有2ml生理盐水和3滴肝素（"肝素"浓度为 5000ME/ml ;3滴含有750ME/ml肝素）的离心管中。充分搅拌所得溶液；
[0022] c)根据前面描述的方法将淋巴细胞从整个含有肝素的血液分离到具有密 度 d = 1.077g/ml 的 ficoll-verografin 梯度中（Garib，F.Yu.，Gurary，Ν· I.，Garib, V. F.''Sposob opredeleniya subpopulyatsi j limfotsitov (Determination method of lymphocytes ' subpopulations)〃//Rasmij Akhborotnoma. Tashkent, 1995, #1, p. 90-UZ DP2426)。将2mlfiC〇ll-Ver〇grafin梯度倒入干净的离心管中，然后将肝素化的血液铺在其 表面上，并将该管以1500RPM离心20分钟。在离心过程中，不包括淋巴细胞的所有血液细 胞都穿透ficoll-verografin梯度。血楽维持在梯度之上。在ficoll-verografin梯度和血楽 的边界中，形成由纯淋巴细胞组成的独特混浊环。用移液器小心泵取具有淋巴细胞的环并 转移至干净的离心管中；
[0023] d)用10ml生理盐水将淋巴细胞洗出2-3次，并以1500RPM进一步离心20分钟。
[0024] e)最后离心之后，去除上清液。将含有淋巴细胞的沉淀物稀释并重悬于600 μ 1生 理盐水中。可以将淋巴细胞悬液在温度+4°C储存不超过1天。
[0025] III.评估具有嗜淋巴特件的病毒在体外穿诱人淋巴细朐并在人淋巴细朐中细朐 内存在
[0026] 1)将含有具有嗜淋巴特性的病毒的生物材料从冰箱中取出并在室温解冻。
[0027] 2)用移液器将等体积（300 μ 1)的含有病毒的生物材料和健康人淋巴细胞悬液转 移至干净的离心管中；将内容物混合，并置于+37°C的恒温器中孵育（病毒与淋巴细胞在体 外孵育）6-8小时。每1. 5-2小时将该测试管通过振摇混合。
[0028] 3)淋巴细胞的洗出。将测试管从恒温器中取出。添加6_8ml生理盐水，混合并以 1500RPM离心20分钟。淋巴细胞沉降在管底部。将上清液（血浆和盐水的混合物）完全去 除。将淋巴细胞在生理盐水中洗涤并沉降2-3次。最后离心之后，去除上清液，并将淋巴细 胞（沉淀物）悬液用500 μ 1生理盐水稀释，并转移至塑料的1. 5锁定管（Eppendorf管）。
[0029] 4)此后将管置于家庭级冰箱的冷冻室中过夜。在缓慢冷冻条件下破坏淋巴细胞。
[0030] 5)被破坏的淋巴细胞的膜的去除。第二天将来自冰箱的管在室温解冻。然后，通 过以3000RPM离心30分钟而去除破坏的淋巴细胞的膜。将膜沉淀在管底部，并且淋巴细胞 的细胞质内容物留在上清液中。
[0031] 6)将上清液从管中转移，并进行之前在受感染患者的血浆中的淋巴细胞的细胞质 中病毒RNA或DNA的定量PCR。
[0032] IV.结果的评估。
[0033] 1.淋巴细胞的细胞质中存在病毒RNA或DNA的阳性PCR表明剩余的病毒存活力， 即在体外穿透人淋巴细胞并在人淋巴细胞中存在的能力。
[0034] 2.淋巴细胞的细胞质中存在病毒RNA或DNA的阴性PCR表明病毒存活力的丧失 (灭活），即其在体外穿透人淋巴细胞并在人淋巴细胞中存在的能力的丧失。
【具体实施方式】
[0035] 通过以下实施例证明要求保护的方法：
[0036] 实施例1
[0037] 用嗜淋巴特性评估病毒的存活力
[0038] 从接受针对丙肝的抗病毒治疗之后的患者的肘静脉获得血液。从全血分离血浆， 并进行定量PCR来验证HCV存在和定量病毒滴度。PCR是阴性的。将测试血浆保持在低 于-25 °C温度的冰箱中。
[0039] 同时，在早上从肘静脉获得来自健康人志愿者的20_30ml血液。将部分血浆进行 PCR分析具有嗜淋巴特性感染的病毒。将来自具有感染测试的阴性结果的健康人的淋巴细 胞用于进一步研究。然后将7-8ml血液等分试样转移至含有2ml生理盐水和3滴肝素的 离心管（"肝素"浓度为5000ME/ml，3滴含有750ME/ml肝素）。将管中的溶液充分混合。 根据Garib，F. Yu.等人的方法在具有d = 1. 077g/ml密度的ficoll-verografin梯度中从 整个肝素化血液分离淋巴细胞。将2mlfiC〇ll- Ver〇grafin梯度倒入干净的离心管中，将肝 素化血液铺在梯度表面上并以1500RPM离心20分钟。不包括淋巴细胞的所有血细胞穿透 ficoll-verografin梯度并在其下沉降。血楽位于梯度上方。在ficoll-verografin梯度和血 浆之间的边界上，形成具有纯淋巴细胞悬液的独特混浊环。用移液器小心吸取具有淋巴细 胞的环并转移至干净的离心管中。将淋巴细胞在生理盐水中洗出并沉降2-3次。最后离心 之后，去除上清液。将含有淋巴细胞的沉淀物用600 μ 1盐水稀释并重悬。可以将淋巴细胞 悬液在+4°C温度储存不超过1天。
[0040] 将来自冰箱的测试血浆在室温解冻。用移液器将等体积（300 μ 1)血浆和淋巴细 胞悬液转移至干净的离心管中，混合，并置于+37°c温度的恒温器中孵育6-8小时。每1. 5-2 小时将该管通过振摇混合。
[0041] 孵育之后，将该管从恒温器中取出。添加6-8ml盐水，混合并以1500RPM离心20 分钟。淋巴细胞沉降在管底部。将上清液（血浆和生理盐水的混合物）去除。然后在生理 盐水中洗出2-3次，并同上进行淋巴细胞沉降。最后离心之后，去除上清液，并将淋巴细胞 (沉淀物）悬液通过添加300 μ 1生理盐水来稀释，并转移至1. 5ml锁定管（Eppendorf管）。 [0042] 此后，通过过夜置于家庭级冰箱中而破坏淋巴细胞膜。第二天将该管在室温下解 冻。然后，通过将管以3000RPM离心30分钟而从悬液中去除破坏的淋巴细胞的膜。将膜沉 淀在管底部，并且淋巴细胞细胞质内容物留在上清液中。将上清液从管中转移，并进行定量 PCR分析淋巴细胞的细胞质中HCV病毒的存在。HCV阳性的PCR测试表明保存HCM存活力 并需要进一步抗病毒治疗。
[0043] 实施例2
[0044] 通过从针对乙肝给予抗病毒治疗的患者的肝穿刺采样肝脏组织。将活检样品在 1. 5ml生理盐水中匀浆；转移至离心管中，以1500RPM离心20分钟；并将上清液转移至管。 将一部分上清液进行定量PCR测试HCV病毒的存在并定量病毒滴度。HCV的PCR检测是阳 性的。将活检样品保存在低于_25°C温度的冰箱的冷冻室中。
[0045] 如实施例1中所述制备来自健康人的淋巴细胞悬液。将来自肝活检样品匀浆的上 清液在室温解冻。通过自动移液器将等体积（300 μ 1)上清液和淋巴细胞悬液添加至管中； 将所得溶液混合，并置于+37°c温度的恒温器中孵育6-8小时。每1. 5-2小时将测试管通过 振摇混合。
[0046] 将该管从恒温器中取出。添加6-8ml生理盐水，混合并以1500RPM离心20分钟。 淋巴细胞沉降在管底部。将上清液（血浆和生理盐水的混合物）完全去除。将上清液（血 浆和生理盐水的混合物）去除。然后在生理盐水中洗出2-3次，并同上进行淋巴细胞沉降。 最后离心之后，去除上清液,并将淋巴细胞（沉淀物）悬液通过添加300 μ 1生理盐水来稀 释。此后，通过将测试管置于家庭级冰箱中过夜进行淋巴细胞膜的破坏。
[0047] 此后，通过置于家庭级冰箱中过夜破坏淋巴细胞膜。第二天将该管在室温下解冻。 然后，通过将管以3000RPM离心30分钟而从悬液中去除破坏的淋巴细胞的膜。将膜沉淀在 管底部，并且淋巴细胞细胞质内容物留在上清液中。将上清液从管中转移，并进行定量PCR 分析淋巴细胞的细胞质中HBV病毒的存在。HBV阴性的PCR表明丧失病毒存活力（灭活）。
[0048] 实施例3
[0049] 病毒浓度低于ΕΙΑ和PCR灵敏度阈值的生物材料中具有嗜淋巴特性的病毒的检 测。
[0050] 在血液中心，测试来自6_8ml血液的血浆中具有嗜淋巴特性的病毒。将一部分血 浆进行定量PCR测试H3V、HCV或HIV病毒的存在并定量病毒滴度。针对病毒存在的PCR是 阴性的。将测试血浆储存在低于_25°C的冰箱中。
[0051] 如实施例1中所述制备来自健康人受试者的淋巴细胞悬液。
[0052] 将来自冰箱的测试血浆在室温解冻。用自动移液器将等体积（300 μ 1)血浆和淋 巴细胞悬液转移至干净的离心管中，混合，并置于+37°C的恒温器中孵育6-8小时。每1. 5-2 小时将该管通过振摇混合。
[0053] 将该管从恒温器中取出。添加6_8ml生理盐水，混合并以1500RPM离心20分钟。 淋巴细胞沉降在管底部。将上清液（血浆和生理盐水的混合物）完全去除。将上清液（血 浆和生理盐水的混合物）去除。然后在生理盐水中洗出2-3次，并同上进行淋巴细胞沉降。 最后离心之后，去除上清液,并将淋巴细胞（沉淀物）悬液通过添加300 μ 1生理盐水来稀 释。
[0054] 此后，通过置于家庭级冰箱中过夜破坏淋巴细胞膜。第二天将该管在室温下解冻。 然后，通过将管以3000RPM离心30分钟而从悬液中去除破坏的淋巴细胞的膜。将膜沉淀在 管底部，并且淋巴细胞细胞质内容物留在上清液中。将上清液从管中转移，并进行定量PCR
【权利要求】
1. 评估具有嗜淋巴特性的病毒的存活力的方法，包括采样生物材料，通过聚合酶链式 反应（PCR)检测病毒RNA或DNA的存在，其特征在于另外从健康人受试者获得淋巴细胞悬 液，与等量的生物材料混合并在37°C孵育6-8小时，将淋巴细胞从血浆洗出并破坏，使淋巴 细胞的细胞质进行PCR，在淋巴细胞的细胞质中检测到病毒RNA或DNA表明病毒的存活力， 而不存在病毒RNA或DNA表明病毒的灭活。
2. 权利要求1的方法，其特征在于血浆或血液蛋白、活检组织或器官、和医疗器械的洗 出物充当生物材料。
3. 权利要求1的方法，其特征在于评估HBV、HCV或HIV存活力。
4. 检测病毒浓度低于EIA和PCR灵敏度阈值的生物材料中具有嗜淋巴特性的病毒的方 法，由采样生物材料组成，其特征在于从健康人血液获得淋巴细胞悬液，添加等量的生物材 料，混合并在37°C孵育6-8小时，从血浆洗出淋巴细胞并破坏淋巴细胞，并使淋巴细胞的细 胞质进行PCR，其中在细胞质中检测到病毒RNA或DNA表明测试的生物样品中存在病毒，而 不存在病毒RNA或DNA表明测试的生物样品中不存在病毒。
5. 权利要求4的方法，其特征在于血浆或血液蛋白充当生物材料。
6. 权利要求4的方法，其特征在于检测HBV、HCV或HIV的存在。
7. 消除假阴性EIA和PCR结果的方法，包括从怀疑被嗜淋巴病毒感染的患者采样血液， 其特征在于将2. Oml血液样品采集到含有2. Oml生理盐水和2-3滴肝素的管中，从6-8ml 血液中分离淋巴细胞，在37°C孵育6-8小时，从血浆洗出淋巴细胞，破坏淋巴细胞，并且使 淋巴细胞的细胞质进行PCR，检测到病毒RNA或DNA表明患者血液中存在病毒，而不存在病 毒RNA或DNA表明患者血液中不存在病毒。
8. 权利要求7的方法，其特征在于通过PCR测试患者的淋巴细胞的内容物。
【文档编号】G01N33/569GK104066848SQ201380006383
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2012年6月18日
【发明者】纳里曼·古尔亚莫夫 申请人:新医疗技术有限责任公司