离子化方法、质谱分析方法、提取方法和提纯方法

离子化方法、质谱分析方法、提取方法和提纯方法
【专利摘要】本发明的目的在于当在大气压下离子化微小量物质时容易实现软离子化。本发明涉及用于被包含在液体中的物质的离子化方法，该离子化方法的特征在于包括：从探测器将液体提供给基板并且利用其中溶解有所述物质的液体在探测器和基板间形成液桥的步骤；用于振荡所述探测器的步骤；以及用于在所述探测器与液体接触的导电部分和离子提取电极间形成电场的步骤。
【专利说明】离子化方法、质谱分析方法、提取方法和提纯方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及用于物质的离子化方法和使用该离子化方法的质谱分析方法。本发明还涉及用于物质的提取方法和提纯方法。

【背景技术】
[0002]作为一种成分分析方法的质谱分析方法涉及离子化样品中的成分并测量和分析其质荷比(质量数/电荷数)。
[0003]近几年，创建存在于固体样品表面上的成分的分布图像的技术得到开发。特定成分的分布被可视化为质量图像，由此样品的状况可以被确定。作为该技术的示例，基于包括癌症组织的病理标本的质量图像来展示充当病理诊断基础的数据的方法被开发。质量图像通常经过以下方式获取:在多个测量点处离子化样品；为每一个测量点获得所产生的离子的质荷比；并且将样品表面上的位置与离子信息相关联。从而，为了提高所获得的分析结果的空间分辨率，需要离子化样品表面上的微区域的技术。
[0004]NPL I提出如下方法:向固体样品表面上的微区域给予溶剂以使得存在于该微区域中的成分被溶解；并且在大气压下离子化被溶解的成分。该方法使用:第一毛细管，被配置为将用于溶解固体样品中的成分的溶剂提供给样品表面；以及第二毛细管，被配置为将其中成分被溶解在所述溶剂中的混合溶液移动到离子化部位。在两个毛细管靠近固体样品表面的状态中，溶剂由第一毛细管提供到该固体样品表面，从而在两个毛细管的前端和样品表面形成液桥。在该液桥中，只有固体样品的接触部分被溶解，并且被溶解的部分随后被引入到第二毛细管。高电压被施加于所述溶剂，并且离子化在第二毛细管的前端被执行。该方法使得能够进行微区域的离子化。此外，因为离子化在大气压下被执行，所以测量所需的时间可以被缩短，并且设备的尺寸可以被减小。因此，当大量的样品被分析时该方法尤其有利。
[0005]PTL I提出了如下方法:以表面声波辐射含有溶解于其中的样品的混合溶液，并且在大气压下离子化被含有的成分。根据此方法，其中样品被溶解于溶剂中的混合溶液被放置在基板上，并且被表面声波辐射，从而实现液体原子化然后实现样品离子化。此外，根据PTL 1，离子化效率可通过向混合溶液施加电压而被提高。
[0006]在用于比如生物组织的生物源材料的质谱分析中，还需要检测作为多带电离子(multiply charged 1n)的生物成分的技术。在检测目标成分的分子量相对大的情况下，如果通过给予多个电荷而使得质荷比较低，则即使通过可检测质荷比低的检测器仍可容易地检测到该成分。
[0007]引文列表
[0008]专利文件
[0009]PTL 1:国际公开 N0.W02011/060369
[0010]非专利文件
[0011]NPL I:Patrick J.Roach et al.,^Nanospray desorpt1n electrospray1nizat1n:an ambient method for liquid extract1n surface sampling in massspectrometry^Analyst, 135，pp 2233-2236 (2010)


【发明内容】

[0012]技术问题
[0013]在NPL I中公开的方法中，液桥和固体样品之间的接触面积对应于在其上执行质谱分析的区域，因此需要使得液桥更小，以便使得此面积更小。不幸的是，此方法难以形成具有小于两个毛细管的前端的最近距离的尺寸的液桥，从而此方法存在如下问题:通过使得离子化部位较小而实现空间分辨率的提高是困难的。此方法具有另一问题:为了在物理上使得两个毛细管更近，额外需要用于精确对准两个毛细管的机构，形成设备的部件的数量增加，并且该设备自身更加复杂。
[0014]在PTL I中公开的方法中，测量目标是其中测量目标成分被预先溶解在溶剂中的混合溶液，因而，此方法难以离子化固体样品的一部分。此外，此方法具有如下问题:多带电离子的化合价小于常规电喷雾方法的化合价。
[0015]如上文已经描述的，没有文献公开在大气压下从固体物体的特定区域有效检测作为多带电离子的诸如生物分子的有机成分的方法。
[0016]问题的解决方案
[0017]本发明的离子化方法是用于被包含在液体中的物质的离子化方法，包括:(I)从探测器将液体提供到基板上，并且在探测器和基板之间形成由含有所述物质的液体组成的液桥；(2)振荡该基板；并且(3)在探测器的与液体接触的导电部分和离子提取电极间产生电场。
[0018]本发明的有利效果
[0019]根据本发明，在大气压下可容易地离子化液体中含有的微量物质。

【专利附图】

【附图说明】
[0020]图1是用于描述本发明的第一实施例的图示。
[0021]图2是用于描述本发明的第二实施例的图示。
[0022]图3是用于描述本发明的第三实施例的图示。
[0023]图4是用于描述本发明的第四实施例的图示。
[0024]图5是用于描述本发明的第五实施例的图示。
[0025]图6A是示出根据本发明的示例I的液桥附近的观察结果的图。
[0026]图6B是示出根据本发明的示例I的液桥附近的观察结果的图。
[0027]图7A是示出根据本发明的示例2获得的结果的图。
[0028]图7B是示出根据本发明的示例2获得的结果的图。
[0029]图7C是示出根据本发明的示例2获得的结果的图。
[0030]图7D是示出根据本发明的示例2获得的结果的图。
[0031]图8A是示出根据本发明的示例3获得的结果的图。
[0032]图SB是示出根据本发明的示例3获得的结果的图。
[0033]图SC是示出根据本发明的示例3获得的结果的图。
[0034]图8D是示出根据本发明的示例3获得的结果的图。
[0035]图SE是示出根据本发明的示例3获得的结果的图。
[0036]图8F是示出根据本发明的示例3获得的结果的图。
[0037]图SG是示出根据本发明的示例3获得的结果的图。
[0038]图8H是示出根据本发明的示例3获得的结果的图。
[0039]图9A是示出根据本发明的示例4获得的结果的图。
[0040]图9B是示出根据本发明的示例4获得的结果的图。
[0041]图1OA是示出根据本发明的示例5获得的结果的图。
[0042]图1OB是示出根据本发明的示例5获得的结果的图。
[0043]图1OC是示出根据本发明的示例5获得的结果的图。
[0044]图1lA是示出根据本发明的示例6的液桥附近的观察结果的图。
[0045]图1lB是示出根据本发明的示例6的液桥附近的观察结果的图。
[0046]图1lC是示出根据本发明的示例6的液桥附近的观察结果的图。

【具体实施方式】
[0047]下面，参考附图描述本发明的方法。图1中示出用于执行本发明的示例性实施例。图1示出了:基板I ;包括液体通过的流路的探测器2 ;在基板I和探测器2之间形成的液桥3 ;离子摄入部分4，包括用于将离子摄进质谱仪的离子提取电极；被配置为振荡该基板I的振荡提供器5 ;以及被配置为支持振荡提供器5和探测器2的样品台6。图1还示出了:电流/电压放大器7 ;信号发生器8 ;被配置为将液体供应到探测器2的液体供应器9 ；电压施加器10 ;导电流路11 ;样品台控制器12 ;质谱仪13 ;电压施加器14 ;泰勒锥15和带电微小液滴16。
[0048]在本发明中，首先，从液体供应器9供应的液体在基板I和探测器2之间形成液桥3。随后，通过由振荡提供器5造成的基板I的振荡以及由电压施加器10和电压施加器14造成的电场梯度使液桥3变为带电微小液滴6，从而测量目标成分可以作为离子被摄入离子摄入部分4。
[0049]也就是说，在本实施例中，探测器对应于到基板上的液体的给予单元、基板上的物质的获取单元、到用于离子化的适当位置的液体的传输单元，以及用于离子化的泰勒锥的形成单元。
[0050]该液体供应器9供应以下之一:用于溶解被固定到基板I上的样品中包含的分析目标元素的溶剂；以及分析目标元素和用于溶解分析目标元素的溶剂的混合溶液(下文，该溶剂和混合溶液被共同简称为液体)。从液体供应器9供应的液体通过导电流路11被弓丨导到探测器2内部的流路。这时，电压由电压施加器10通过导电流路11被施加到液体。DC电压、AC电压、脉冲电压和零电压中的任一个被施加到液体。
[0051]在导电流路11全部或部分被归入探测器2内部的流路或用于连接的管道的情况下，本实施例中的术语“探测器”指代它们的集合概念。此外，即使在导电流路11未被并入探测器2内部的流路或用于连接的管道情况下，本实施例中的术语“探测器”在广义上也指代的它们的集体概念。即，形成探测器的材料的至少一部分可以是导电的。导电材料的示例包括金属和半导体，以及可以采用任何材料，只要该材料在电压从电压施加器施加到其上时展现出可重现的恒定电压值即可。即，在本实施例中，电压被施加到探测器的导电部分，从而电压被施加到液体。
[0052]本实施例中的短语“将电压施加到探测器”指代:向形成探测器的至少一部分的导电部分给予与之后将要描述的离子提取电极的电势不同的电势；并且在形成探测器的至少一部分的导电部分和之后将要描述的离子提取电极之间产生电场。只要该电场被实现，此处施加的电压可以是零电压。流路11的材料可以是导电物质，为其使用的材料的示例包括不锈钢、金和钼。
[0053]所使用的用于连接探测器2、导电流路11和液体供应器9的管道的示例包括被配置为供应少量液体的毛细管(比如硅石毛细管和金属毛细管)，并且其导电性可以是绝缘、导电和半导电特性中的任一个。注意到，该导电流路11可以构成如下流路中的一部分，在该流路中从液体供应器9供应的液体穿过探测器2的内部以被引至与液体供应器9相反的探测器2的前端，该导电流路11的位置不被特别限定。例如，该导电流路11的全部或部分可以被归入探测器2内部的流路或用于连接的管道。对于该配置，可使用通过将导电材料(例如不锈钢丝、钨丝和钼丝)插入硅石毛细管而形成的探测器。
[0054]在当整个探测器2导电的情况下，施加到导电流路11的电压被传播到探测器2，电压被施加到流过探测器2内部的流路的液体。该实施例的细节在之后本发明的第二实施例中被描述。同时，在当探测器2绝缘的情况下，施加到导电流路11的电压不可以被传播到探测器2，但是电压被施加到流过流路11的液体，且该液体被引至探测器2。因此，即使在电压未被传播到探测器2的情况下，电压仍被施加到液体，从而使得液体被带电。
[0055]从液体供应器9供应的液体从探测器2的前端被提供到基板I上。这时，该样品可以被预先固定于基板上，包含于基板I上的样品中的作为分析目标元素的特定成分可以溶解在由探测器2提供的溶剂内。作为替代，其中分析目标元素预先与溶剂混合的混合溶液可以被提供到基板I上。此外，可使用多种类型的液体。
[0056]根据本实施例,在液体居间(intermediat1n)的情况下探测器2和基板I相互连接的状态中，振荡被赋予基板1，并且在探测器2和离子提取电极之间产生电场，由此基板被离子化。在液体居间的情况下两个物体被相互连接的状态通常被称为液桥。在本实施例中，该液桥3指的是从探测器2供应的液体与至少探测器2和基板I两者物理接触的状态。应注意，在本发明中的液桥并不局限于液桥仅与基板I和探测器2接触的状态，并且液桥可与除基板I和探测器2之外的另一物体接触。液体被探测器2连续或者间歇地提供到基板I上。探测器2不必须与基板I接触，但是出于稳定形成液桥3的目的而可与基板I接触。
[0057]也就是说，本发明的方法包括:(I)从探测器将液体提供到基板上，并且在该探测器和基板之间形成由含有该物质的液体组成的液桥；(2)振荡该基板；以及(3)在探测器的与液体接触的导电部分和离子提取电极间产生电场。然后，(I)提供和形成、(2)振荡以及
(3)产生可通过简单的配置被同时执行。
[0058]在图1中，基板I被振荡提供器5支持，并且通过振荡提供器5向基板I提供振荡。图1示出了基板I被固定到振荡提供器5的状态，但是基板I和振荡提供器5可相互分离，只要基板I可振荡以将其振荡提供给液桥4即可。
[0059]基板I的振荡可以是连续振荡或间歇振荡中的任一个。希望调整向液体施加电压的定时以及振荡基板I的定时以使得在通过流路11被施加电压的液体形成液桥3时基板I振荡。振荡提供器与电流/电压放大器7和信号发生器8电连接，并且通过信号发生器8产生的并具有希望波形的信号被输入电流/电压放大器7，由此可产生高电压信号。在此情况下，通过改变从电流/电压放大器7输出的电压值，振荡的振幅可被设定为希望值。
[0060]此外，可以总是提供振荡，以及可交替造成振荡状态和非振荡状态。在交替造成振荡状态和非振荡状态的情况中，每一状态的周期可根据需要被改变。在通过探测器2将液体间歇地提供到基板I上的情况中，希望的是改变振荡状态和非振荡状态中的每一个的周期以使得振荡被传递到形成液桥的液体。
[0061]通过在被施加电压的电极和被电压施加器14施加电压的离子提取电极之间的电势梯度，形成液桥3的液体振荡以朝基板2的在离子摄入部分4侧的侧面移动，从而形成泰勒锥15。由于电势梯度在泰勒锥15的前端处变得更大，因此从混合溶液产生带电微小液滴16。如果电势梯度的大小被设定为适当值，发生瑞利裂变，从带电液滴16产生特定成分，并且该离子被气流和电场梯度朝向离子摄入部分4引导。离子摄入部分4被加热到室温和数百度之间的特定温度。电压被施加到离子摄入部分4。离子摄入部分4连接到排气管。此时，需要调整由电压施加器10施加到探测器的电压和由电压施加器14施加到离子提取电极的电压以使得产生适当的电场梯度以便导致瑞利裂变并且产生离子。通过电压施加器14施加的电压的示例包括DC电压、AC电压、脉冲电压、零电压和它们的组合。应注意，用于导致瑞利裂变的电势梯度由施加到探测器的电势、离子摄入部分4的电势以及液体与离子摄入部分4之间的距离限定。因此，依赖于待被离子化的物质和溶剂的类型，这些电势和距离需要被设置为使得产生合适的电势梯度。此处的瑞利裂变指的是如下现象:带电液滴6达到瑞利限度且带电液滴中过多的电荷作为二次液滴被发射。已知带电液滴6中含有的成分在发生诸如瑞利裂变期间作为气相离子被产生。(J.Mass Spectrom.Soc.Jpn.Vol.58，139-154，2010)
[0062]离子摄入部分4和探测器2之间的距离以及离子摄入部分4和基板I之间的距离可根据希望改变，并且可被设定为满足用于稳定形成泰勒锥的条件。此外，探测器2与基板I的角度可等于或者大于O且等于或者小于90，并且离子摄入部分4与基板I的角度可等于或者O且等于或者小于90。假定包括探测器2的线段的平面与基板I相交，则探测器2与基板I的角度在这里指的是由此平面与基板I的交线和探测器2的线段定义的角度。假定包括离子摄入部分4的线段的平面与基板I相交，则离子摄入部分4与基板I的角度在这里指的是由此平面与基板I的交线和离子摄入部分4的线段定义的角度。毛细管的线段指的是平行于毛细管的较长轴的线段。离子摄入部分4的线段指的是平行于其的在离子摄入部分4摄入离子的方向上的轴的线段。探测器2和离子摄入部分4不必须是直线型的，而可以是弯曲形状。在此情况中，在接近基板的探测器2的前端(接近基板的离子摄入部分4的前端)处的可被近似为直线的部分被假定为探测器2 (离子摄入部分4)的线段。根据本发明的发明人的研究，探测器2的适当角度为20到40度，并且离子摄入部分4的适当角度为30到150度，但是本发明并不局限于此。认为在毛细管的前端处可稳定地形成泰勒锥的条件下，离子可被稳定地产生。
[0063]之后，离子通过差分泵系统被引入到连接到离子摄入部分4的质谱仪，且离子的质荷比被测量。所使用的质谱仪包括四极质谱仪、飞行时间质谱仪、磁场偏转质谱仪、离子阱质谱仪和离子回旋质谱仪。此外，如果离子的质荷比(质量数/电荷数；之后用m/z指代)和所产生的离子的数量之间的关系被测量，也可以获得质谱。
[0064]泰勒锥15的尺寸根据液体的流速、液体的组成、探测器2的形状、基板I的振荡和电势梯度的大小而改变。在泰勒锥15特别小的情况下，其形式可能是显微镜不可观察的，但是只要离子被稳定地产生就没有问题。
[0065]根据本实施例，液桥3的形成时间通过控制液体流速以及基板I的振荡而被调整，从而形成液桥4的液体的体积可以被容易地控制。因此，当从探测器提供其中分析目标元素预先与溶剂混合的混合溶液时，待被离子化的分析目标元素的量可以被精细调整。类似地，当样品被固定于基板I上以溶解于从探测器供应的溶剂中时，可以通过调整液桥3的形成时间来将液桥3所接触的区域变小，且只有微区域中的成分可以被离子化，从而实现诸如细胞的生物物质的高分辨率质谱成像。
[0066]在样品在被离子化时被固定在基板上的情况下，基板台6的位置被样品台控制器12改变，从而样品的离子化目标位置处的坐标可以被控制。离子化目标位置的坐标和所获得的质谱相互关联，从而可获得质谱的二维分布。根据本方法获得的数据是含有离子化目标位置的坐标(X坐标和Y坐标)和质谱的三维数据。在离子化和质谱获取在不同位置被执行之后，具有所希望的质荷比的离子的数量被选择，且其分布被显示。因此，可以获得每一成分的质量图像，且可以捕获在样品表面上的特定成分的分布。该样品可以被移动以使得由探测器2形成的液桥3扫描待测量的所希望平面。
[0067]在本发明的第二实施例中，如图2所示，电压可在探测器居间的情况下被施加到液桥，该探测器包括液体经过的流路。此时，探测器21被电连接到电压施加器10，且在探测器21居间的情况下电压被施加到从液体供应器9供应的液体。注意到，类似于上述实施例，短语“将电压施加到探测器”指代:将与离子提取电极的电势不同的电势给予形成探测器的至少一部分的导电部分；并且在离子提取电极和探测器之间产生使能够由于瑞利裂变而产生离子的电场。只要该电场被实现，此处被施加到形成探测器的至少一部分的导电部分的电压可以是零电压。探测器21的材料可以是导电物质，为其使用的材料的示例包括诸如不锈钢、金和钼的金属；以及诸如部分覆盖有金属的玻璃的衍生物。
[0068]在本发明的第三实施例中，如图3所示，探测器不必须包括液体经过其中的流路。即，从液体供应器9供应的液体可被提供给探测器表面，并且离子可在探测器表面的一部分上产生。在本实施例中，可根据喷墨方法、电喷雾方法、空气喷射喷雾方法和落滴法由液体供应器9将液体提供给探测器31的一部分，从而可形成液桥3和泰勒锥5。如图3所示，可向来自用作电极的探测器的液体施加电压。作为替代，如图1所示，可在液体被提供给探测器之前向液体施加电压。
[0069]在本发明的第四实施例中，如图4所示，可以使用可提供多种类型液体的探测器。在图4中，探测器41包括被配置为提供液体的第一流路42以及被配置为提供液体的第二流路43。液桥3在第一流路42与基板I之间形成。相比之下，探测器的角度和振荡的振幅被调整为使得第二流路43的前端不与样品接触，由此从第二流路43出来的液体可以避免形成液桥。注意到，在此刻，通过彼此不同的导电流路，不同电势可以被独立地给予流过流路42的第一液体和流过流路43的第二液体。
[0070]可使得不同类型的液体流过被配置为提供液体的第一流路32和被配置为提供液体的第二流路33，或者可使得相同类型的液体从中流过。例如，在使用不同类型的液体的情况中，用于溶解样品表面上成分的溶剂被引入到第一流路42，以及包含与特定成分起反应的分子种类的溶剂被引入到第二流路43，由此所述特定成分可以被选择性离子化。
[0071]同时，在使用相同液体的情况中，例如，与样品表面接触以形成液桥的液体被引入到第一流路42和第二流路43。在此刻，因为探测器41的侧面总是由来自于第二流路43的液体清洗，可以防止探测器的前端的侧面被污染，并且可以防止质量图像的空间分辨率减小。
[0072]以上描述的配置仅作为示例给出。因此，流路的空间位置关系可以不同，并且可以使用包括三个或更多类型的流路的探测器。
[0073]在上文提及的实施例中，离子化成分所必需的电势梯度通过被施加到探测器的电势、离子摄入部分4的电势以及液体与离子摄入部分4之间的距离被调整，但是本发明并不限于此。在本发明的第五实施例中，如图5所示，可提供用于在液体周围产生电势梯度的机构51。在本实施例中，由被施加到液桥3的电压、施加到电极51的电压以及液桥3与电极51之间的距离限定的电势梯度被用于离子化液体中含有的成分。电极51可具有环状形状、网状形状、点状形状和杆状形状。
[0074]在本实施例中，离子化目标样品未被特别限制。如果离子化目标是由脂类、糖、和蛋白质的大分子组成的有机化合物，根据当前实施例的方法这些物质可以被容易地软离子化。
[0075]根据本发明，特别地，含有有机物质的样品中的成分可被改变为多带电离子。如果可从具有大的分子量的生物成分形成具有大的化合价的多带电离子，则即使其可测量质荷比低的质谱仪仍可检测生物成分，因此，测量相关的成本可降低。
[0076]由于每个离子具有固有质荷比，因此如果外部电势梯度的强度被调整，则仅特定离子可被分离。即，混合物中的特定成分可被提取和提纯。例如，只有对生物体特定部位具有亲和性的蛋白质成分可以从被包含在培养细胞的破碎提取物中的多个成分中分离。随后，如果被分离的特定成分被给予到给定物质的表面，所述特定成分的功能可以添加给所述给定物质。进一步，如果具体地与特定疾病部位反应的成分被给予到药物制剂的表面，可以预期提升药物疗效的效果。进一步，如果根据本发明的方法被分离和提纯的诸如蛋白质的物质被给予到诸如在生物体中使用的人造器官的物体的表面，可以预期抑制生物体中的排异反应的效果。
[0077]仅分离特定成分的示例方法包括:将多个离子种类引入进真空室；使用电势梯度分离离子；然后在真空室中基板上只收集特定离子成分。通过使用该方法，已在其上收集离子成分的基板可被从真空室中拿出，并且所述离子成分可以使用合适溶剂与基板分离。其另一示例方法包括:在真空室中安装诸如人造器官的物体；并且将分离的离子直接给予该物体。
[0078]如果向探测器(液体供应器)的一部分设置突起部，则沿该突起部形成泰勒锥，从而离子可被更稳定地形成。
[0079]如果振荡频率被设定为等于或者大于10Hz且等于或者小于1MHz，则为了离子化可向成分给予更大数量的电荷。然后，如果更大数量的电荷被给予具有大分子量的诸如蛋白质的成分，则即使在低质荷比该成分仍可被检测到。此外，如果向液桥赋予振荡，则液桥的体积可被改变为希望的状态，从而液桥的尺寸可被控制。
[0080]示例
[0081]在下文中，根据本发明的评价方法的示例被参照附图详细描述。
[0082](示例I)离子化设备的使用高速照相机的观察。
[0083]描述的是使用高速照相机观察使用本发明的方法形成液桥的状态以及产生离子的状态的结果。图6A和6B每个都图示了参照图1的图示被描述的探测器、基板和离子摄入部分(MS管)。
[0084]图6A和6B分别示出了在低倍率和高倍率下的液桥附近的观察结果。在本示例中，外径为150微米而内径为50微米的硅石毛细管被用作对应于被配置为提供混合溶液的单元的探测器，硅石毛细管连接到注射器的金属针，并且电压通过连接到金属针的电压施加器被施加到硅石毛细管。注射器被固定到注射泵，并且液体可被以恒定流速从注射器送出到探测器的前端。谐振频率为28kHz的压电元件(PZT)被用作振荡提供器，聚四氟乙烯膜被用作基板，并且水、甲醇、和甲酸(水:甲醇:甲酸=498:498:2)的混合物被用作混合溶液。作为四极质谱仪的TSQ7000 (Thermo Fisher Scientific K.K.)被用作质谱仪。如图6A所示，探测器的前端与MS管之间的距离为约0.5毫米，而MS管与基板之间的距离为约0.5毫米。图6A中由探测器和基板定义的角度大约为50度，以及图6B中由探测器和基板定义的角度大约为25度。混合溶液的流速为0.2微升/分钟。MS管连接到TSQ7000，37.5V的电势被施加给连接部分，并且温度被设定为250°C。
[0085]在图6B中，在毛细管下部的区域与基板之间形成的液桥被清楚地观察到。此外，混合溶液在毛细管的前端上部的区域中形成三角形形状，并且在该三角形形状的延伸部中观察到作为对比更明亮的区域的存在。这些分别对应于泰勒锥和微小液滴的出现区域。认为，由于提供给混合溶液的电势与MS管的电势之间的电势梯度，混合溶液接收到静电力并由此变形。已知电势梯度集中于泰勒锥的前端并且带电微小液滴被从该处发射(电喷雾方法)。在本示例中，在3kV或更大的电压被施加给探测器的情况中，观察到泰勒锥的形成。还在图6A中，类似地证实泰勒锥和微小液滴的出现。
[0086]在此条件下，作为使用质谱仪进行测量的结果检测到溶剂得出的离子。作为比较，在毛细管的前端没有形成泰勒锥的情况下，几乎没有检测到离子。即使检测到一些离子，离子生成也是不稳定的。因此，认为带电微小液滴被从泰勒锥的前端发射，并且液滴内的成分被离子化。如这样证明的，如果形成泰勒锥，则实现稳定的离子化。
[0087](示例2)用于胰岛素混合溶液的稳定离子化方法的研究
[0088]描述了根据本发明的方法离子化生物成分的结果。人胰岛素混合溶液(50nM;溶剂的体积比为水:甲醇:甲酸=498:498:2)被通过与示例I中的探测器相同的探测器提供给基板。混合溶液的流速被设定为0.2微升/分钟，并且测量时间被设定为5分钟。在3kV或更大的电压被施加给探测器的情况中，检测到人胰岛素离子。其它试验条件与示例I中参照图6B描述的内容相同。
[0089]图7A示出了当向基板提供振荡时的离子质谱，并且图7B示出了当没有向基板提供振荡时的离子质谱。每个谱是累积5分钟的数据。在图7A和7B中的每一个中，横轴代表质荷比(质量数量/电荷数量)，并且竖轴代表离子数。在每个质谱中，在1937、1453和1163m/z处检测到峰值。这些峰值分别对应于三价、四价和五价离子，并且认为三个、四个和五个氢离子被给予人胰岛素。在向基板提供振荡的情况下，五价离子的峰值强度最高，随后依次是四价离子的峰值强度和三价离子的峰值强度。作为对比，在没有向基板提供振荡的情况下，四价离子的峰值强度最高，随后依次是五价离子的峰值强度和三价离子的峰值强度。这证明可通过提供振荡而增加人胰岛素离子中包含的氢离子的量。
[0090]接下来，描述根据本发明的方法生成人胰岛素离子时的离子强度的时间变化的研究结果。图7C示出了当向基板提供振荡时的离子强度的时间变化，并且图7D示出了当停止振荡时的离子强度的时间变化。在图7C和7D的每一个中，横轴代表时间而纵轴代表质荷比，并且离子量由亮度对比表示。即，在图7C和7D中的每一个中，更白的部分意味着更大的离子量。在提供振荡的情况中，在对应于质荷比1937、1453和1163的部分中离子量更大。此外，即使在同一质荷比，横轴方向上的亮度对比的差仍小，因此可理解为恒定数量的离子被检测到，而不管时间是否过去。作为对比，在没有提供振荡的情况下，对应于质荷比1937、1453和1163的部分中离子量小。此外，在同一质荷比，横轴方向上的亮度对比的差大，因此可认为所检测的离子量的时间变化大。这证明通过赋予振荡可稳定地产生人胰岛素离子。此外，所获得的离子总量被计算。因而，在赋予振荡的情况下，与没有振荡的情况相比离子量增加约15%。这被认为是由于通过向液桥赋予振荡而产生促进从泰勒锥的前端生成离子的效果导致的。对于此的可想到的机理包括振荡物理切断带电液桥的作用；以及在形成液桥的溶液与基板之间的界面处发生摩擦，从而增加带电量的作用。
[0091](示例3)与ESI比较
[0092]接下来，描述比较本发明的方法与用于生物成分的已知为软离子化方法的电喷雾离子化(ESI)方法的结果。对于样品，使用人胰岛素混合溶液(50nM ;溶剂的体积比为水:甲醇:甲酸=498:498:2)和牛血清白蛋白混合溶液(500nM ;溶剂的体积比为水:甲醇:甲酸=498:498:2)。每一混合溶液的流速被设定为0.2微升/分钟，并且根据本发明的方法和ESI方法中的每一个执行测量。测量时间均被设定为3分钟，并且累积谱被相互比较。对于根据ESI方法的测量，附属于质谱仪(TSQ7000, Thermo Fisher Scientific K.K.制造)的离子源以及氮气(压力为0.8Mpa)被使用。用于本发明的方法的试验条件与示例I中参照图6B描述的内容相同。
[0093]图8A和SB均示出了人胰岛素混合溶液的质谱。图8A对应于根据本发明的方法所获得的结果，并且图8B对应于根据ESI方法所获得的结果。在每个谱中，1163m/z处的峰值强度最高，因此可以理解为五价离子被最多地生成。图8A和SB之间的此峰值强度的比较示出根据本发明的离子化方法检测到的离子量为根据ESI方法的离子量的至少48倍。这被认为是由以下两个作用的协同效果带来的。对于第一作用，离子生成部位到离子摄入端口的距离短，因此更大量的离子被引导至质谱仪。对于第二作用，从液桥分离的离子量由于振荡而增加。认为在ESI方法中，所有生成的离子中的相当多的离子没有被引导至质谱仪。即，认为根据本发明的离子化方法，没有被引导至质谱仪的离子的量可以减少，导致离子检测灵敏度提高。此外，从图7A、7B、7C和7D的结果来看，认为通过赋予振荡使得生成的尚子量增多。
[0094]接下来，图8C、8D、8E、8F、8G和8H均示出了 BSA混合溶液的谱。图8C对应于根据本发明的方法获得的结果，并且图8D对应于根据ESI方法获得的结果。在每个谱中，BSA多带电离子被检测到。多带电离子的峰值强度的分布在这两个方法之间是不同的。具体而言，在本发明的方法中40价离子的强度最高，而在ESI方法中48价离子的强度最高。这两个方法之间的离子强度的比较示出本发明的方法中的40价离子的强度为ESI方法中的48价离子的强度的约1.6倍。类似于人胰岛素的测量结果，这被认为是由以下作用导致的。即，离子生成部位到离子摄入端口的距离短，因此更大量的离子被引导至质谱仪。此外，在ESI方法中,在1000到1300m/z的区域中检测到清楚的峰值。作为比较,在本发明的方法中,在800到lOOOm/ζ的区域中检测到一些峰值，并且这些峰值之一对应于76价离子。因此，认为本发明的方法可比ESI方法向BSA分子给予更大数量的氢离子。
[0095]接下来，将描述研究根据本发明的方法的向探测器施加的电压对于离子化效率的结果。图8E、8F和8G分别示出当使用BSA混合溶液并且向探测器施加3kV、4kV和5kV的电压时的质谱。其它试验条件与示例I中参照图6B描述的内容相同。在500到800m/z的区域中检测到一些峰值，并且峰值强度随着施加的电压增大而变得更高。图8H示出了对于在施加5kV时获得的谱数据执行平滑处理(相邻十个点的移动平均值)的结果。与图SG的谱中相比，峰值被清楚地观察到。这些峰值被认为对应于BSA多带电离子。可想到的将比如上所述的ESI方法中赋予更大数量的电荷的机理如下:通过振荡在液桥中造成空穴现象，因此更大数量的氢离子被给予BSA。已知如果在液体中造成空穴现象，则形成高温高压气泡。还已知如果向含有溶解于其中的蛋白质的混合溶液施加振荡，则蛋白质的较高阶结构变松。从这些已知的事实，认为根据本发明的方法，液桥中存在的BSA的更高阶结构变松，并且大量的氢离子被给予BSA。如上所述，本发明的方法可以能够检测到常规ESI方法难以检测到的多带电离子，例如100价或更高价的离子。
[0096](示例4)对于用于固体胰岛素的离子化方法的研究
[0097]描述了研究用于测量基板上的固体样品的成分的分布的方法的结果。通过将人胰岛素水溶液(?μΜ)滴落在聚四氟乙烯基板上并且风干该水溶液来制备样品。覆盖基板的固体白色微晶体被观察到。其它试验条件与示例I中参照图6Β描述的内容相同。在使用显微镜观察毛细管的前端与基板之间的溶剂的液桥的形成以及泰勒锥的形成的同时，基板在单轴方向上被移动，并且生成的离子的质谱的时间变化被测量。固定到基板的侧面的振荡器的频率被设定为约28kHz。生成14000次振荡的操作以及将振荡停止相同时间长度的操作被交替执行。从使用高速相机的观察以及质谱的测量，可确认在振荡的停止期间稳定地形成液桥，并且在振荡的生成期间稳定地生成离子。
[0098]图9A示出了质谱。在图9A中，在1937、1453和1163m/z处检测到峰值。这些峰值分别对应于三价、四价和五价离子，并且认为三个、四个和五个氢离子被给予人胰岛素。由此结果，认为基板上的固体样品被溶解在从毛细管引入的溶剂中，然后通过泰勒锥被离子化。谱中的每个离子强度的分布与示例3和4中的每一个的中的峰值强度的分布不同。即，峰值强度按照四价、三价和五价离子的顺序变得更低。这被认为是由以下原因导致的，即与使用其中样品被预先溶解在溶剂中的混合溶液的情况相比，在本示例中，固体样品溶解到溶剂中和离子化所需的时间更短，并且被给予人胰岛素的氢离子的量更小。
[0099]图9B示出了本示例中检测到的多带电离子的强度的时间变化。五价、四价和三价离子的强度的时间变化被按上述次序示出。尽管使用了人胰岛素固体微晶体存在于基板的整个表面上的示例，但是仅在从0.5分钟到2.6分钟的时段中检测到离子。此时段对应于生成振荡器的振荡的区域，并且证明通过向基板提供振荡而使固体样品稳定地离子化。
[0100](示例5)对用于固体BSA的离子化方法的研究
[0101]描述了研究用于测量基板上的固体样品的成分的分布的方法的结果。通过将BSA水溶液(?μΜ)滴落在聚四氟乙烯基板上的四个点处、在一分钟之后吸收各点处的剩余水溶液并且风干该水溶液来制备样品。在基板上观察到形成非常薄的圆膜。随后，通过毛细管将溶剂(该溶剂的体积比为水:甲醇:甲酸= 498:498:2)引至样品表面。溶剂的流速被设定为0.3微升/分钟，并且向探测器施加3到5kV的电压。在使用显微镜观察毛细管的前端与基板之间的溶剂的液桥的形成以及泰勒锥的形成的同时，基板在单轴方向上被移动。此时，液桥被调整为通过基板上的四个非常薄的膜。其它试验条件与示例I中参照图6B描述的内容相同。
[0102]图1OA是不出试验中使用的样品以及基板的移动方向的图不。图10A75出了基板101 ;由BSA构成的非常薄的膜102 ;毛细管103 ;液桥104 ;指示基板的移动方向的箭头105 ;以及用于将离子引入质谱仪的管106。生成14000次基板振荡的操作以及将振荡停止相同时间长度的操作被交替执行。生成的离子的质谱与其时间变化被一起测量。质谱的测量范围被设定在1650和1680之间。这对应于存在40价离子的谱的区域。图1OB示出了质谱。最高峰值被发现位于1164处。图1OC示出了在1660和1680之间的区域中获得的离子的时间变化。可确认每当液桥通过四个BSA薄膜时生成40价离子。这证明了本发明的方法可将固体样品的成分的分布可视化。在本示例中，描述了当振荡频率为28kHz时的结果，但是频率并不局限于此。如果频率等于或者大于10Hz且等于或小于1MHz，则离子效率被更好地改进。
[0103](示例6)通过振荡振幅控制液桥尺寸
[0104]描述了研究被给予基板上的液桥的振荡振幅与液桥尺寸之间的关系的结果。制备包括聚四氟乙烯基板的样品，并且通过毛细管将溶剂(该溶剂的体积比为水:甲醇:甲酸=498:498:2)引至样品表面。溶剂的流速被设定为0.3微升/分钟，并且向探测器施加5kV的电压。固定到基板的背面的振荡器的频率被设定为约28kHz，并且输入振荡器的电压被设定为0V、20V和30V(有效值)。其它试验条件与示例I中参照图6B描述的内容相同。通过使用激光位移计确认振荡的振幅相对于输入电压增加，并且实际振幅分别为约0.7微米和1.5微米。图1lAUlB和IlC均示出了使用高速相机观察液桥附近的结果。在图1lAUlB和IlC中的每一个中，在探测器的前端和基板之间形成液桥。图1lAUlB和IlC分别对应于0V、20V和30V的输入电压。每个图中的刻度条为100微米。在每个图中由箭头指示的部分中观察到液桥的形成。此外，还在毛细管之上的区域中观察到对比明亮的喷雾，并且认为从其生成离子。在此喷雾的开始点附近观察到泰勒锥的形成。这些观察结果与图6中所示的示例I中的结果不同，并且泰勒锥的尺寸较小。这被认为是由于毛细管的前端的形状在本示例与示例I中不同而导致的。此毛细管可通过使用其中结合有金刚钻刀的毛细管切割器切割，或者可使用划线器切割。图1lAUlB和IlC均示出了使用划线器切割毛细管时的结果，而图6均示出了使用毛细管切割器切割毛细管时的示例。在这两种情况中，液桥和泰勒锥的形成被确认。
[0105]图1lAUlB和IlC的比较示出液桥的尺寸随着振幅增加而变得更小。由于振荡的振幅对应于振荡能量，因此这被认为是由于以下原因导致的:通过向液桥给予振荡能量而使离子生成量增加，并且形成液桥的溶液的体积相应地减小。如这样证明的，如果给予液桥的振荡能量被控制，则除了促进离子化的效果之外，液桥的尺寸可被控制，并且要被离子化的区域可被调整。
[0106]该申请要求2012年3月I日提交的日本专利申请第2012-045922号的权益，该日本专利申请通过引用被全文并入此。
[0107]附图标记列表
[0108]I 基板
[0109]2探测器
[0110]3 液桥
[0111]4离子摄入部分
[0112]5振荡提供器
[0113]6样品台
[0114]7电流/电压放大器
[0115]8信号发生器
[0116]9液体供应器
[0117]10电压施加器
[0118]11导电流路
[0119]12样品台控制器
[0120]13质谱仪
[0121]14电压施加器
【权利要求】
1.一种用于被包含在液体中的物质的离子化方法，包括: (1)从探测器将液体提供到基板上，并且在所述探测器和所述基板之间形成由含有所述物质的液体组成的液桥； (2)使所述基板振荡；并且 (3)在所述探测器的与液体接触的导电部分和离子提取电极间产生电场。
2.根据权利要求1所述的离子化方法，其中(I)提供和形成、(2)振荡以及(3)产生被同时执行。
3.根据权利要求1或2所述的离子化方法，其中，液体在所述探测器的端部处形成泰勒锥，在所述端部形成液桥。
4.根据权利要求1到3中任一个所述的离子化方法，其中，在(3)产生中，液体的一部分从所述端部作为带电液滴解吸。
5.根据权利要求4所述的离子化方法，其中带电液滴从所述泰勒锥解吸。
6.根据权利要求4或5所述的离子化方法，其中带电液滴引起瑞利裂变。
7.根据权利要求1到6中任一个所述的离子化方法，其中探测器包括液体从中流过的流路。
8.根据权利要求7所述的离子化方法，其中探测器包括多个所述流路。
9.根据权利要求1到6中任一个所述的离子化方法，其中通过所述探测器的表面将液体提供给所述基板。
10.根据权利要求1到9中任一个所述的离子化方法，其中所述物质被固定在所述基板上，并且液体在所述液桥与所述基板相互接触的区域中溶解所述物质。
11.根据权利要求1到10中任一个所述的离子化方法，其中所述探测器扫描所述基板。
12.根据权利要求1到11中任一个所述的离子化方法，其中振荡具有等于或大于10Hz且等于或小于IMHz的频率。
13.—种质谱分析方法，包括:将使用根据权利要求1到12中任一个所述的离子化方法被离子化的物质供给质谱仪以由此执行质谱分析。
14.一种用于物质的提取或提纯法，包括利用电势梯度从液体分离使用根据权利要求1到12中任一个所述的离子化方法被离子化的物质，以由此提取或提纯所述物质。
15.一种用于物质的离子化设备，包括: 振荡器，被配置为使基板振荡； 探测器，被配置为将液体供应到基板上并且在探测器和基板间形成由所述液体组成的液桥； 离子提取电极；以及 电压施加器，被配置为在探测器的与液体接触的导电部分和离子提取电极间产生电场。
【文档编号】G01N27/62GK104254902SQ201380022088
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2012年3月1日
【发明者】大塚洋一, 荒川隆一 申请人:学校法人关西大学, 佳能株式会社