聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白生物传感器的制备方法，利用标准的微电子机械系统工艺加工而成的圆线型叉指金电极，使用修饰的聚乙二醇处理圆线型叉指金电极表面，用于固定桔小实蝇气味结合蛋白，获得所述聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器。本发明将桔小实蝇气味结合蛋白固定在圆线型叉指金电极上，用于水果挥发性气味物质的检测。该方法构建的聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器可将桔小实蝇气味结合蛋白稳定、简便的固定在圆线型叉指金电极表面，进而检测水果挥发性气味物质，本发明制备的聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白生物传感器灵敏度高，检测下限低，特异性强。
【专利说明】聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种传感器件的制备技术，尤其涉及一种利用聚乙二醇固定桔小实蝇气味结合蛋白的方法，以及利用桔小实蝇气味结合蛋白传感器检测水果挥发性气味物质(β -紫罗兰酮及乙酸异戊酯)的方法。
【背景技术】
[0002]桔小实蝇是一种对多种果蔬具有很大威胁的害虫，它的寄主范围极广，涉及到250多种果蔬。所以对于桔小实蝇的防治是农业、林业检疫部门一项重要任务。针对桔小实蝇对水果气味灵敏的感知特性，可以建立特殊水果气味的传感器用于桔小实蝇的防治。气味结合蛋白是一种存在于桔小实蝇触角嗅觉细胞外的低分子量疏水性蛋白。它能够与目标气味分子可逆地结合，起到运输疏水性小分子的作用。桔小实蝇气味结合蛋白容易获取、结构稳定，可以作为生物敏感元件构建生物传感器。利用桔小实蝇气味结合蛋白和阻抗传感器结合的优势，发展一种基于电化学阻抗分析的桔小实蝇气味结合蛋白生物传感器，可以特异性的检测水果挥发性气味物质(β_紫罗兰酮及乙酸异戊酯)，可以用于食品成分快速检测、昆虫养殖及桔小实蝇等昆虫防治等领域。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种基于聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白电化学阻抗传感器的制备及应用。
[0004]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:其特征在于，包括以下步骤:
(1)加工圆线型叉指金电极阻抗传感器:以玻璃为基底，在玻璃基底上磁控溅射钛化钨薄膜作为粘附层，接着磁控溅射金薄膜作为电极层；用AZ光刻胶光刻出圆线型叉指图形，再采用干法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，得到圆线型叉指金电极以及外接引脚，最后将芯片腔用环氧树脂胶封在玻璃基底上，制得圆线型叉指金电极阻抗传感器；
(2)固定桔小实蝇气味结合蛋白，该步骤通过以下子步骤来实现:
(2.1)首先，将圆线型叉指金电极在由质量浓度为98%以上的浓硫酸和体积浓度为30%的双氧水溶液按体积比为7:3混合成的混合溶液中浸泡3-5min，然后用超纯水冲洗3次以上，最后依次用无水乙醇和超纯水清洗上述的圆线型叉指金电极，用氮气吹干；
(2.2)配制浓度为1.5mg/ml的聚乙二醇溶液，溶剂由无水乙醇和超纯水按体积比3:7混合组成；将聚乙二醇溶液滴加在圆线型叉指金电极上至完全覆盖圆线型叉指金电极，在室温下静置24h，聚乙二醇中的巯基与圆线型叉指金电极反应生成金硫键，进而将聚乙二醇固定于圆线型叉指金电极上，之后再吸出芯片腔的残留的聚乙二醇溶液；
(2.3)分别加入体积均为聚乙二醇溶液一半的浓度为8mg/ml的EDC (1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和浓度为12mg/ml的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，EDC溶液和NHS溶液的溶剂均为0.1M MES缓冲液，15min后，再加入NaHCO3溶液调节pH至
7.2-7.4 ； (2.4)然后加入与聚乙二醇溶液等体积的浓度为67 μ g/ml的桔小实蝇气味结合蛋白溶液，桔小实蝇气味结合蛋白溶液的溶剂为0.1M PBS缓冲液，室温下静止2h，使得桔小实蝇气味结合蛋白与聚乙二醇溶液中的聚乙二醇的羧基作用形成稳定的酰胺键，进而形成酰胺键结构，然后吸出芯片腔中残留的液体，再向芯片腔中加满0.1M PBS缓冲液，静置5min后吸出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的桔小实蝇气味结合蛋白，重复3次后即可获得聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器，置于4°C条件下备用。
[0005]应用上述聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器检测水果挥发性气味物质的方法，包括以下步骤:
(O配制待测水果挥发性气味物质标准样品溶液:采用物质的量浓度为0.0lM待测的水果挥发性气味物质的标准贮备溶液稀释配制5种相应浓度梯度的标准样品溶液；稀释液为0.1M PBS缓冲液；
(2)检测水果挥发性气味物质标准样品溶液，建立水果挥发性气味物质标准浓度-归一化阻抗曲线:空白对照溶液电化学阻抗图谱的测量:先将圆线型叉指金电极的两个外接引脚分别通过导线连接电化学工作站的两个输入端，然后向芯片腔内加入与聚乙二醇溶液等体积的氧化还原对溶液，氧化还原对溶液中含有IOmM铁氰化钾、IOmM亚铁氰化钾和0.1M的KC1，溶剂为超纯水，再向芯片腔中加入与氧化还原对溶液等体积的PBS缓冲液，以电化学工作站作为仪器平台对的聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器进行电化学阻抗图谱扫描，得到电化学阻抗图谱和电子传递电阻，测量结束后吸出芯片腔中上次测量残留的全部溶液，然后加满0.1M PBS缓冲液，静置5min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗圆线型叉指金电极，再进行水果挥发性气味物质标准样品溶液电化学阻抗图谱的测量，向芯片腔中加入等量的与聚乙二醇溶液等体积的氧化还原对溶液和某一物质的量浓度的水果挥发性气味物质溶液，进行电化学阻抗图谱的测量，得到该物质的量浓度下的水果挥发性气味物质标准样品溶液对应的电化学阻抗图谱和电子传递电阻，测量结束后吸出芯片腔中上次测量残留的全部溶液，然后加满0.1M PBS缓冲液，静置15min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗圆线型叉指金电极；
(3)建立水果挥发性气味物质溶液标准浓度-归一化阻抗曲线:重复上述步骤2中空白对照溶液和水果挥发性气味物质标准样品溶液的电化学阻抗图谱的测量过程，直至完成5种相应浓度梯度的水果挥发性气味物质标准样品溶液的测量，得到不同浓度下的电化学阻抗谱图和电子传递电阻，计算归一化阻抗(标准样品溶液与空白对照溶液差值相对于空白对照溶液的变化值)，得到水果挥发性气味物质标准样品溶液浓度与归一化阻抗之间的关系曲线y=a_bx，其中，X为水果挥发性气味物质标准样品溶液浓度，y为归一化阻抗，a和b为常数，实现对水果挥发性气味物质的检测。
[0006]本发明的有益效果是，本发明利用聚乙二醇将桔小实蝇气味结合蛋白固定在圆线型叉指金电极上，构建了聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器，可以用于水果挥发性气味物质(乙酸异戊酯和β_紫罗兰酮)的检测。实验表明该方法构建的桔小实蝇气味结合蛋白传感器可将桔小实蝇气味结合蛋白简便并稳定地固定在圆线型叉指金电极表面，聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器检测灵敏度高、检测下限低。
【专利附图】
【附图说明】[0007]图1为本发明圆线型叉指金电极排布图；
图2为本发明桔小实蝇气味结合蛋白传感器测试图；
图3为本发明桔小实蝇气味结合蛋白传感器制备图；
图4为本发明桔小实蝇气味结合蛋白传感器制备过程中，圆线型叉指金电极、圆线型叉指金电极固定聚乙二醇(SH-PEG-C00H)及圆线型叉指金电极固定聚乙二醇(SH-PEG-C00H)和桔小实蝇气味结合蛋白的电化学阻抗图谱；
图5为本发明桔小实蝇气味结合蛋白传感器检测乙酸异戊酯气味分子溶液的电化学阻抗图谱；
图6为本发明桔小实蝇气味结合蛋白传感器检测β-紫罗兰酮气味分子溶液的电化学阻抗图谱；
图7为本发明气味结合蛋白生物传感器分别与不同浓度的水果挥发性气味物质(乙酸异戊酯和β_紫罗兰酮)发生反应后电子传递电阻与水果挥发性气味物质(乙酸异戊酯和β -紫罗兰酮)浓度对数之间的关系图；
图中:玻璃基底1，圆线型叉指金电极2，外接引脚3，外圆4内圆5，叉指小圆6，芯片腔7，导线8，电化学工作站9。
【具体实施方式】
[0008]以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。
[0009]本发明聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器的制备方法，包括以下步骤:
1、圆线型叉指金电极阻抗传感器的加工。
[0010]圆线型叉指金电极2的加工采用标准的加工工艺。以厚度为0.5 mm、直径为1.6cm的玻璃为基底，在玻璃上磁控溅射20nm厚的钛化钨(TiW)薄膜作为粘附层，接着磁控溅射300nm厚的金(Au)薄膜作为电极层；用AZ光刻胶光刻出圆线型叉指图形，其中圆线型叉指金电极2中外圆4的直径为6000 μ m,内圆5的直径为5400 μ m,圆线型叉指金电极2每个叉指小圆6的直径为50 μ m。最后采用干法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，得到圆线型叉指金电极2以及外接引脚3，如图1所示。最后将有机玻璃材料制作而成的芯片腔7用环氧树脂胶封在玻璃基底I上，如图2所示，制得圆线型叉指金电极阻抗传感器。
[0011]2、桔小实蝇气味结合蛋白的固定。
[0012]首先，向芯片腔7中加入100 μ I的质量浓度为98%以上的浓硫酸和体积百分比浓度为30%的双氧水溶液按体积比为7:3混合成的混合溶液3-5min，用于浸泡圆线型叉指金电极2，然后用超纯水冲洗3次以上圆线型叉指金电极2。最后用无水乙醇和超纯水再次清洗上述的圆线型叉指金电极2，用氮气吹干。配制浓度为1.5mg/ml的聚乙二醇(SH-PEG-C00H)溶液(本申请中使用的聚乙二醇(SH-PEG-C00H)均是指平均分子量为2100，两端分别修饰巯基和羧基的聚乙二醇)，溶剂由无水乙醇和超纯水按体积比3:7混合组成。将100 μ I聚乙二醇(SH-PEG-C00H)溶液滴加在芯片腔7中的圆线型叉指金电极2上至完全覆盖圆线型叉指金电极2。在室温下静置24h，聚乙二醇(SH-PEG-C00H)中的巯基(-SH)与圆线型叉指金电极2反应生成金硫键，进而将聚乙二醇(SH-PEG-C00H)固定于圆线型叉指金电极2上。之后缓慢吸出芯片腔7的残留的聚乙二醇(SH-PEG-C00H)溶液，再分别加入浓度为8mg/ml的EDC (1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和浓度为12mg/ml的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)溶液各40 μ I (溶剂为0.1M MES缓冲液，含0.1M KCl, ρΗ=6，
0.1M MES指的是MES缓冲液中2-吗啉乙磺酸的摩尔浓度，0.1M KCl是指MES缓冲溶液氯化钾的摩尔浓度。本申请中使用的MES缓冲液均是指0.1 Μ，ρΗ=6的MES缓冲液)。15分钟后，再加入NaHCO3溶液调节pH至7.2-7.4。然后加入100 μ 1、浓度为67 μ g/ml的桔小实蝇气味结合蛋白溶液(溶剂为0.1M PBS缓冲液，pH=7.2,0.1M指的是PBS缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度，本申请中使用的PBS缓冲液均是指0.1 M，pH=7.2的PBS缓冲液)，室温下静止2h，使得桔小实蝇气味结合蛋白与聚乙二醇(SH-PEG-C00H)溶液中的聚乙二醇(SH-PEG-C00H)的羧基作用形成稳定的酰胺键，进而形成如图3所示酰胺键结构。缓慢吸出芯片腔7中残留的液体后，再向芯片腔7中加入400 μ I的0.1M PBS缓冲液，静置5min后吸出芯片腔7中的PBS缓冲液，用于清洗未被固定的桔小实蝇气味结合蛋白，重复3次后即可获得聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器，置于4°C条件下备用。桔小实蝇气味结合蛋白具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
[0013]本发明基于聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器可用于检测水果挥发性气味物质(乙酸异戊酯和β-紫罗兰酮)。该应用具体如下:
(O配制待测水果挥发性气味物质(乙酸异戊酯和β -紫罗兰酮)的标准样品溶液:采用物质的量浓度为0.0lM待测的水果挥发性气味物质(乙酸异戊酯和β -紫罗兰酮)的标准贮备溶液稀释配制5种相应浓度梯度的标准样品溶液；稀释底液为0.1M PBS缓冲液；
(2)检测乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液，建立乙酸异戊酯气味分子溶液标准浓度-归一化阻抗曲线:首先进行空白对照电化学阻抗图谱的测量，先将图1中的圆线型叉指金电极2的两个外接引脚3分别通过导线8连接电化学工作站9的两个输入端，电化学工作站9可以采用上海辰华仪器有限公司CHI660型号的产品。然后向芯片腔7内加入200 μ I氧化还原对溶液，氧化还原对溶液中含有IOmM铁氰化钾、IOmM亚铁氰化钾和0.1M的KC1，溶剂为超纯水。再向芯片腔7中加入200 μ I的PBS缓冲液作为空白对照，以电化学工作站9作为仪器平台对本发明基于电化学阻抗分析的聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器进行电化学阻抗图谱扫描。具体测试参数为初始电压为0.2V，交流电压幅度为5mV，扫频范围为0.1Hf ΙΟΟΚΗζ，最后得到电化学阻抗图谱，利用典型的阻抗等效电路拟合得到空白对照的电子传递电阻(Rrt)。测量结束后，先缓慢吸出向芯片腔7中的上次测量残留的溶液，然后加入400 μ I的PBS缓冲液，静置5min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗上次测量残留的铁氰化钾/亚铁氰化钾及PBS缓冲液的混合溶液影响。之后再进行乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液，分别加入200 μ I氧化还原对溶液和200 μ I的10_7 M的乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液至芯片腔7中，进行电化学阻抗图谱的测量，得到10_7Μ乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液对应的电化学阻抗图谱。一次测量结束后，先吸出芯片腔7中上次测量残留的溶液，然后向芯片腔7中加入400 μ I的PBS缓冲液，静置15 min后缓慢吸出PBS缓冲液，以消除上次测量残留的铁氰化钾/亚铁氰化钾及10_7M乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液的影响。重复上述空白测量和乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液的测量，直至完成10_6M、10_5 M、10_4 M和10_3 M乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液的测量。最终得到聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器与5个不同浓度(10_7M、10_6 M、10_5 M、10_4 M和10_3M)下的乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液相互作用的电化学阻抗图谱，如图5所示。利用5个不同浓度(10_7M、10_6 M、10_5 M、10_4 M和10_3M)乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液的电子传递电阻，计算归一化阻抗(标准样品溶液与空白对照溶液差值相对于空白对照溶液的变化值，即(Rc^pbs - Rct-odor)/ Rrt-PBS，其中Rc^pbs为空白对照电化学阻抗图谱的电子传递电阻，Rrt-。-相应浓度下乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液电化学阻抗图谱的电子传递电阻)，得到乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液浓度与归一化阻抗之间的关系曲线y=a_bx，其中，X为乙酸异戊酯气味分子标准样品溶液浓度，Y为归一化阻抗，a和b为常数；如图7所示；
(3)检测β-紫罗兰酮气味分子标准样品溶液，建立β-紫罗兰酮气味分子溶液标准浓度-归一化阻抗曲线:方法同上述步骤2，最终得到聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器与5个不同浓度(10_7Μ、10_6 Μ、ΙΟ—5 Μ、Kr4 M和I(T3M)下的β _紫罗兰酮气味分子标准样品溶液相互作用的电化学阻抗图谱，如图6所示，以及得到β-紫罗兰酮气味分子标准样品溶液与归一化阻抗之间的关系曲线，如图7所示。
【权利要求】
1.一种聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)加工圆线型叉指金电极阻抗传感器:以玻璃为基底，在玻璃基底(I)上磁控溅射钛化钨薄膜作为粘附层，接着磁控溅射金薄膜作为电极层；用AZ光刻胶光刻出圆线型叉指图形，再采用干法刻蚀将非电极区域刻蚀掉，得到圆线型叉指金电极(2)以及外接引脚(3)，最后将芯片腔(7)用环氧树脂胶封在玻璃基底(I)上，制得圆线型叉指金电极阻抗传感器； (2)固定桔小实蝇气味结合蛋白，该步骤通过以下子步骤来实现: (2.1)首先，将圆线型叉指金电极(2)在由质量浓度为98%以上的浓硫酸和体积浓度为30%的双氧水溶液按体积比为7:3混合成的混合溶液中浸泡3-5min，然后用超纯水冲洗3次以上，最后依次用无水乙醇和超纯水清洗上述的圆线型叉指金电极(2)，用氮气吹干； (2.2)配制浓度为1.5mg/ml的聚乙二醇溶液，溶剂由无水乙醇和超纯水按体积比3:7混合组成；将聚乙二醇溶液滴加在圆线型叉指金电极(2)上至完全覆盖圆线型叉指金电极(2)，在室温下静置24h，聚乙二醇中的巯基与圆线型叉指金电极(2)反应生成金硫键，进而将聚乙二醇固定于圆线型叉指金电极(2)上，之后再吸出芯片腔(7)的残留的聚乙二醇溶液； (2.3)分别加入体积均为聚乙二醇溶液一半的浓度为8mg/ml的EDC (1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和浓度为12mg/ml的NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，EDC溶液和NHS溶液的溶剂均为0.1M MES缓冲液，15min后，再加入NaHCO3溶液调节pH至7.2-7.4 ； (2.4)然后加入与聚乙二醇溶液等体积的浓度为67 μ g/ml的桔小实蝇气味结合蛋白溶液，桔小实蝇气味结合蛋白溶液的溶剂为0.1M PBS缓冲液，室温下静止2h，使得桔小实蝇气味结合蛋白与聚乙二醇溶液中的聚乙二醇的羧基作用形成稳定的酰胺键，进而形成酰胺键结构，然后吸出芯片腔(7)中残留的液体，再向芯片腔(7)中加满0.1M PBS缓冲液，静置5min后吸出PBS缓冲液，用于清洗未被固定的桔小实蝇气味结合蛋白，重复3次后即可获得聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器，置于4°C条件下备用。
2.—种聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白生物传感器检测水果挥发性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤: (O配制待测水果挥发性气味物质标准样品溶液:采用物质的量浓度为0.01M待测的水果挥发性气味物质的标准贮备溶液稀释配制5种相应浓度梯度的标准样品溶液，稀释液为0.1M PBS缓冲液； (2)检测水果挥发性气味物质标准样品溶液，建立水果挥发性气味物质标准浓度-归一化阻抗曲线:空白对照溶液电化学阻抗图谱的测量:先将圆线型叉指金电极(2)的两个外接引脚(3)分别通过导线(8)连接电化学工作站(9)的两个输入端，然后向芯片腔(7)内加入与聚乙二醇溶液等体积的氧化还原对溶液，氧化还原对溶液中含有IOmM铁氰化钾、IOmM亚铁氰化钾和0.1M的KC1，溶剂为超纯水，再向芯片腔(7)中加入与氧化还原对溶液等体积的PBS缓冲液，以电化学工作站(9)作为仪器平台对的聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器进行电化学阻抗图谱扫描，得到电化学阻抗图谱和电子传递电阻，测量结束后吸出芯片腔(7)中上次测量残留的全部溶液，然后加满0.1M PBS缓冲液，静置5min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗圆线型叉指金电极(2)，再进行水果挥发性气味物质标准样品溶液电化学阻抗图谱的测量，向芯片腔(7)中加入等量的与聚乙二醇溶液等体积的氧化还原对溶液和某一物质的量浓度的水果挥发性气味物质溶液，进行电化学阻抗图谱的测量，得到该物质的量浓度下的水果挥发性气味物质标准样品溶液对应的电化学阻抗图谱和电子传递电阻，测量结束后吸出芯片腔(7)中上次测量残留的全部溶液，然后加满0.1M PBS缓冲液，静置15min后缓慢吸出PBS缓冲液，用于清洗圆线型叉指金电极(2)； (3)建立水果挥发性气味物质溶液标准浓度-归一化阻抗曲线:重复上述步骤2中空白对照溶液和水果挥发性气味物质标准样品溶液的电化学阻抗图谱的测量过程，直至完成5种相应浓度梯度的水果挥发性气味物质标准样品溶液的测量，得到不同浓度下的电化学阻抗谱图和电 子传递电阻，计算归一化阻抗(标准样品溶液与空白对照溶液差值相对于空白对照溶液的变化值)，得到水果挥发性气味物质标准样品溶液浓度与归一化阻抗之间的关系曲线y=a_bx，其中，X为水果挥发性气味物质标准样品溶液浓度，y为归一化阻抗，a和b为常数，实现对水果挥发性气味物质的检测。
【文档编号】G01N27/26GK103808773SQ201410028821
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月21日 优先权日:2014年1月21日
【发明者】刘清君, 卢妍利, 姚瑶, 王平, 张迪鸣, 张倩 申请人:浙江大学