一种弱背景荧光的树脂包埋方法
【专利摘要】本发明公开了一种弱背景荧光的树脂包埋方法，属于生物工程【技术领域】。该方法采用溶解了苏丹黑B的树脂溶液作为染色包埋液来渗透包埋荧光生物样品。该方法所得生物样品在保持荧光信号强度的前提下，背景荧光大大降低。本方法能适用于厘米尺寸的大样本，所得生物样品能用于连续超薄切片。本发明方法成本低廉，操作步骤简单，适合在一般实验室推广使用。
【专利说明】一种弱背景荧光的树脂包埋方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及一种弱背景荧光的树脂包埋方法。
【背景技术】
[0002]现代生物学面临的巨大挑战是理解跨度范围从细胞到组织到器官甚至到完整生物体的结构和功能。传统的落射式荧光显微成像由于景深和背景荧光的影响，只能对几十微米的薄切片进行成像。将这种块面成像方法与连续机械薄切片结合起来，能成功地对厘米级大尺寸生物样品进行快速三维成像。通常，为了保证生物样品能进行连续薄切片，需要采用树脂对其进行包埋。然而，该技术虽然解决了成像景深的问题，但仍然存在背景荧光干扰的问题。大尺寸生物样品存在组织自发荧光和焦面外的信号荧光导致的背景荧光干扰，而在样品包埋的过程中会进一步提高背景荧光。这种强烈的背景荧光干扰往往使得焦面上的细节信息被湮没。因此，发明一种弱背景荧光的树脂包埋方法具有非常重要的意义。
[0003]目前，有研究者通过在树脂中掺入不透明剂的方法减少树脂包埋样本的背景荧光，如文献“Surface Imaging Microscopy, an Automated Method for Visualizing WholeEmbryo Samples in Three Dimensions at High Resolution.(Ewald, A.J., H.McBride, M.Reddington, S.E.Fraser, and R.Kerschmann.Developmental Dynamics225, n0.3(Nov2002):369-75.) ”。但是该方法目前仍未能应用到荧光蛋白(GFP及其衍生物，XFPs)标记的生物样品中。荧光蛋白自被发现以来，由于其稳定的荧光发射、不具有物种专一性、易于在细胞内表达等优点，已作为标记物广泛地应用于生命科学领域。利用XFPs标记技术，能特异性标记各种细胞，对研究生物体的结构和功能具有重大意义。但是一些极端的理化条件，如高温、强氧化还原剂、强酸强碱等，均会导致XFPs的荧光强度降低甚至淬灭。因此该文献也指出，如何将其方法应用到表达荧光蛋白的样本上是未来的技术挑战之一。
[0004]鉴于此，发明一种弱背景荧光的树脂包埋方法，将其应用到厘米尺寸的荧光生物样品上，特别地，可应用到荧光蛋白标记的生物样品上，具有重大意义和巨大的挑战。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种生物样品在保持荧光信号强度的前提下，背景荧光大大降低的方法。
[0006]本发明所采用的技术方案是:
[0007]一种弱背景荧光的树脂包埋方法，包括以下步骤:
[0008](I)将生物样品用冰水预冷却的质量百分比为4%的多聚甲醛溶液固定6?24h ;
[0009](2)将步骤(I)得到的生物样品用冰水预冷却的浓度为0.01mol/L的PBS漂洗液清洗3?24h，其间更换新鲜漂洗液3?5次；
[0010](3)将步骤(2)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的质量百分比为50%、70%和95%的乙醇溶液中进行梯度脱水，每次15min?2h ；
[0011](4)将步骤(3)得到的生物样品依次放入质量百分比为70%、85%和100%的乙二醇甲基丙烯酸酯水溶性包埋液(GMA)中进行梯度渗透，每个梯度I?3h，随后再次放入新鲜的质量百分比为100%的GMA水溶性包埋液中渗透6?12h ;
[0012](5)将步骤(4)得到的生物样品放入苏丹黑B染色包埋液中渗透I?4天；
[0013](6)将步骤(5)得到的生物样品放入包埋模具中，包埋模具中充满苏丹黑B染色包埋液，然后在45?50 °C下隔氧聚合12?60h。
[0014]进一步地，所述步骤(4)中质量百分比为100%的GMA水溶性包埋液由质量百分比为67%的GMA单体，3%的水，29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二异丁腈配制而成。
[0015]进一步地，所述步骤(5)和(6)中的苏丹黑B染色液包埋液是由预聚GMA水溶性包埋液溶解的浓度为0.5?5w/w%。(g/kg)的苏丹黑B溶液配制而成。
[0016]进一步地，所述预聚GMA水溶性包埋液是取质量百分比为100%的GMA水溶性包埋液搅拌加热至90?95°C时迅速放入冰水浴中，直至溶液温度降至冰水浴的温度。
[0017]更进一步地，为加强染色效果，可以向所述步骤(3)中的质量百分比为95%的乙醇溶液以及步骤(4)中的梯度GMA水溶性包埋液中加入苏丹黑B，配制成0.5?5w/w%。的染色液。
[0018]优选地，所述步骤(6)中的隔氧聚合是采用的包埋模具具有隔氧功能或采用具有抽真空功能的烘箱。
[0019]进一步地，所述步骤(I)中生物样品的尺寸不超过2厘米见方。
[0020]优选地，所述生物样品可以为任何发射荧光的动物组织。
[0021]本发明具有以下优点:
[0022]本发明是采用一种溶解了光吸收剂的树脂作为染色包埋液渗透、包埋生物样品，所得样品为背景荧光被抑制的能应用于超薄切片的生物样品。该方法所得生物样品在保持荧光信号强度的前提下，背景荧光大大降低。本方法能适用于厘米尺寸的大样本，所得生物样品能用于连续超薄切片。本发明方法成本低廉，操作步骤简单，适合在一般实验室推广使用。同时所得包埋的生物样品能应用于块面成像结合连续薄切片的技术上，可用于快速获取荧光蛋白标记组织的高分辨三维荧光分布，继而进行相关结构和功能研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明实施例1采用传统树脂包埋方法制备的成年Thyl-GFP-M小鼠全脑样本的块面荧光成像结果图；
[0024]图2为本发明实施例1采用弱背景荧光的树脂包埋方法制备的成年Thyl-GFP-M小鼠全脑样本的块面荧光成像结果图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。
[0026]实施例1
[0027]本实施例提供了一种弱背景荧光的树脂包埋方法，包括以下步骤:
[0028](I)成年的Thyl-GFP-M line转基因小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后，通过心脏左心室灌注37°C的0.01mol/L PBS溶液3分钟，待血液冲洗干净后，立即灌注冰水预冷却的4%多聚甲醛固定液，并持续I小时。然后，取出小鼠全脑，再次放入冰水预冷却的4%多聚甲醛固定液中后固定24小时。所述固定液中加入2.5%蔗糖，溶剂为0.0lmol/L PBS。
[0029](2)固定结束后，将全脑样本放入冰水预冷却的0.0lmol/L PBS中漂洗24小时，其间更换新液5次，以彻底清洗掉残余的多聚甲醛固定液。
[0030](3)接着，将全脑样本依次放入冰水预冷却的50%、70%和95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次2小时。
[0031](4)脱水结束后，将全脑样本依次放入质量百分比为70%、85%和100%的GMA水溶性包埋液中进行梯度渗透，每个梯度3小时，其中70%和85%GMA水溶性包埋液的溶剂为95%乙醇。随后再次放入新鲜的100%GMA水溶性包埋液中渗透12小时，最后放入预聚GMA水溶性包埋液配制的3%。苏丹黑B染色包埋液中渗透4天。所有渗透液都先用冰水浴预冷却。100%GMA水溶性包埋液由质量百分比为67%的GMA单体、3%的水、29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二异丁腈配制而成。预聚GMA水溶性包埋液的配制方法为:取100%GMA水溶性包埋液搅拌加热至90°C时迅速放入冰水浴中，并大力摇动，直至溶液温度降至冰水浴的温度。
[0032](5)将小鼠全脑放入凝胶将囊中，加入预聚GMA水溶性包埋液配制的3%。苏丹黑B染色包埋液至顶部，静置约10分钟直至胶囊中的气泡完全消失，然后盖上胶囊盖子。将胶囊包埋的小鼠全脑垂直放置在胶囊支架上，然后一起放入50°C烘箱中聚合60小时，得到所需的背景荧光显著降低的全脑包埋样本。
[0033]对所得全脑样本进行GFP荧光块面成像，所得荧光图像参照图2，通过图1与图2的比较可以明显的看出通过本发明制备得到的全脑包埋样本在保持荧光信号强度的前提下，背景荧光大大降低。
[0034]实施例2
[0035]本实施例提供了一种弱背景荧光的树脂包埋方法，包括以下步骤:
[0036](I)成年的Thyl-GFP-M line转基因小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后，通过心脏左心室灌注37°C的0.0lmol/L PBS溶液3分钟，待血液冲洗干净后，立即灌注冰水预冷却的4%多聚甲醛固定液，并持续I小时。然后，取出小鼠全脑，切成I毫米厚的脑块，再次放入冰水预冷却的4%多聚甲醛固定液中后固定6小时。所述固定液中加入2.5%蔗糖，溶剂为
0.01mol/L PBS0
[0037](2)固定结束后，将脑块样本放入冰水预冷却的0.01mol/L PBS中漂洗3小时，其间更换新液3次，以彻底清洗掉残余的多聚甲醛固定液。
[0038](3)接着，将脑块样本依次放入冰水预冷却的50%、70%和95%乙醇溶液中进行梯度脱水，每次15min。
[0039](4)脱水结束后，将全脑样本依次放入质量百分比为70%、85%和100%的GMA水溶性包埋液中进行梯度渗透，每个梯度I小时，其中70%和85%GMA水溶性包埋液的溶剂为95%乙醇。随后再次放入新鲜的100%GMA水溶性包埋液中渗透6小时，最后放入预聚GMA水溶性包埋液配制的0.5%。苏丹黑B染色包埋液中渗透I天。所有渗透液都先用冰水浴预冷却。100%GMA由质量百分比为67%的GMA单体、3%的水、29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二异丁腈配制而成。预聚GMA水溶性包埋液的配制方法为:取100%GMA水溶性包埋液搅拌加热至95°C时迅速放入冰水浴中，并大力摇动，直至溶液温度降至冰水浴的温度。
[0040](5)将小鼠全脑放入凝胶将囊中，加入预聚GMA水溶性包埋液配制的0.5%。苏丹黑B染色包埋液至顶部，静置约10分钟直至胶囊中的气泡完全消失，然后盖上胶囊盖子。将胶囊包埋的小鼠全脑垂直放置在胶囊支架上，然后一起放入45°C烘箱中聚合12小时，得到所需的背景荧光显著降低的I毫米脑块包埋样本。
[0041]实施例3
[0042]本实施例提供了一种弱背景荧光的树脂包埋方法，包括以下步骤:
[0043](I)成年的Thyl-YFP-H line转基因小鼠用1%戊巴比妥钠麻醉后，通过心脏左心室灌注37°C的0.0lmol/L PBS溶液3分钟，待血液冲洗干净后，立即灌注冰水预冷却的4%多聚甲醛固定液，并持续I小时。然后，取出小鼠全脑，切成5毫米脑块，再次放入冰水预冷却的4%多聚甲醛固定液中后固定12小时。所述固定液中加入2.5%蔗糖，溶剂为0.0lmol/LPBS。
[0044](2)固定结束后，将脑块样本放入冰水预冷却的0.0lmol/L PBS中漂洗12小时，其间更换新液4次，以彻底清洗掉残余的多聚甲醛固定液。
[0045](3)接着，将全脑样本依次放入冰水预冷却的50%和70%乙醇溶液中梯度脱水，每次I小时，然后放入95%乙醇溶液配制的5%。苏丹黑B染色液中脱水I小时。
[0046](4)脱水结束后，将全脑样本依次放入质量百分比为70%、85%和100%的GMA水溶性包埋液配制的5%。苏丹黑B染色液中进行梯度渗透，每个梯度2小时，其中70%和85%GMA包埋液的溶剂为95%乙醇。随后再次放入新鲜的GMA水溶性包埋液配制的5%。苏丹黑B染色液中渗透8小时，最后放入GMA水溶性包埋液配制的5%。苏丹黑B染色包埋液中渗透2天。所有渗透液都先用冰水浴预冷却。100%GMA水溶性包埋液由质量百分比为67%的GMA单体、3%的水、29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二异丁腈配制而成。预聚GMA水溶性包埋液的配制方法为:取100%GMA水溶性包埋液搅拌加热至90°C时迅速放入冰水浴中，并大力摇动，直至溶液温度降至冰水浴的温度。
[0047](5)将小鼠脑块放入凝胶将囊中，加入预聚GMA水溶性包埋液配制的5%。苏丹黑B染色包埋液至顶部，静置约10分钟直至胶囊中的气泡完全消失，然后盖上胶囊盖子。将胶囊包埋的小鼠全脑垂直放置在胶囊支架上，然后一起放入50°C烘箱中聚合48小时，得到所需的背景荧光显著降低的脑块包埋样本。
[0048]本发明是采用一种溶解了光吸收剂的树脂作为染色包埋液渗透、包埋生物样品，所得样品为背景荧光被抑制的能应用于超薄切片的生物样品。该方法所得生物样品在保持荧光信号强度的前提下，背景荧光大大降低。本方法能适用于厘米尺寸的大样本，所得生物样品能用于连续超薄切片。本发明方法成本低廉，操作步骤简单，适合在一般实验室推广使用。同时所得包埋的生物样品能应用于块面成像结合连续薄切片的技术上，可用于快速获取荧光蛋白标记组织的高分辨三维荧光分布，继而进行相关结构和功能研究。
[0049]最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【权利要求】
1.一种弱背景荧光的树脂包埋方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将生物样品用冰水预冷却的质量百分比为4%的多聚甲醛溶液固定6?24h; (2)将步骤(I)得到的生物样品用冰水预冷却的浓度为0.0lmol/L的PBS漂洗液清洗3?24h，其间更换新鲜漂洗液3?5次； (3)将步骤(2)得到的生物样品依次放入冰水预冷却的质量百分比为50%、70%和95%的乙醇溶液中进行梯度脱水,每次15min?2h ； (4)将步骤(3)得到的生物样品依次放入质量百分比为70%、85%和100%的乙二醇甲基丙烯酸酯水溶性包埋液(GMA)中进行梯度渗透，每个梯度I?3h，随后再次放入新鲜的质量百分比为100%的GMA水溶性包埋液中渗透6?12h ; (5)将步骤(4)得到的生物样品放入苏丹黑B染色包埋液中渗透I?4天； (6)将步骤(5)得到的生物样品放入包埋模具中，包埋模具中充满苏丹黑B染色包埋液，然后在45?5(TC下隔氧聚合12?60h。
2.根据权利要求1所述的弱背景荧光的树脂包埋方法，其特征在于，所述步骤(4)中质量百分比为100%的GMA水溶性包埋液由质量百分比为67%的GMA单体，3%的水，29.4%的甲基丙烯酸丁酯和0.6%的偶氮二异丁腈配制而成。
3.根据权利要求1所述的弱背景荧光的树脂包埋方法，其特征在于，所述步骤(5)和(6)中的苏丹黑B染色液包埋液是由预聚GMA水溶性包埋液溶解的浓度为0.5?5w/w%。(g/kg)的苏丹黑B溶液配制而成。
4.根据权利要求3所述的弱背景荧光的树脂包埋方法，其特征在于，所述预聚GMA水溶性包埋液是取质量百分比为100%的GMA水溶性包埋液搅拌加热至90?95°C时迅速放入冰水浴中，直至溶液温度降至冰水浴的温度。
5.根据权利要求1所述的弱背景荧光的树脂包埋方法，其特征在于，为加强染色效果，可以向所述步骤(3)中的质量百分比为95%的乙醇溶液以及步骤(4)中的梯度GMA水溶性包埋液中加入苏丹黑B，配制成0.5?5w/w%。的染色液。
6.根据权利要求1所述的弱背景荧光的树脂包埋方法，其特征在于，所述步骤(6)中的隔氧聚合是采用的包埋模具具有隔氧功能或采用具有抽真空功能的烘箱。
7.根据权利要求1所述的弱背景荧光的树脂包埋方法，其特征在于，所述步骤(I)中生物样品的尺寸不超过2厘米见方。
8.根据权利要求1所述的弱背景荧光的树脂包埋方法，其特征在于，所述生物样品可以为任何发射荧光的动物组织。
【文档编号】G01N1/30GK103808553SQ201410039740
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】龚辉, 骆清铭, 胡碧荷 申请人:华中科技大学