化学发光增敏液及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及化学发光免疫分析【技术领域】，具体而言，特别涉及一种化学发光增敏液及其制备方法。该化学发光增敏液，包括0.1-100mmol/L的4-咪唑苯酚、0.05-100mmol/L的过氧化氢、0.05-100mmol/L鲁米诺或鲁米诺衍生物、0.01-10mol/L的碱、体积百分数为0.01％-20％有机溶剂、离子强度为0.01-10mol/L、pH值为7-11的缓冲液。通过实验发现，该增敏液可以显著的增强反应体系的发光强度、大大的延长其发光持续时间，其最大发光强度(化学发光值)可以达到7.5×107，发光持续时间可以达到25分钟。
【专利说明】化学发光增敏液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学发光免疫分析【技术领域】，具体而言，特别涉及一种化学发光增敏 液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 化学发光是在常温下，由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的 某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激 发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分 析。1977年，Halman等人通过将高特异性的抗原抗体反应与高灵敏度的化学发光反应结合 起来，创建了化学发光免疫分析方法（Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)。
[0003] 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有 荧光的特异性，同时不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。鲁米诺是 化学发光免疫分析中应用广泛的标记物质，在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发 光，其中H 202最为常用。在化学发光免疫分析的过程中，因发光反应速度较慢，因此，常需添 加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP)，无机类包括0 3、齒素及Fe3+、 Cu2+、Co2+或它们的配合物。
[0004] 化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent enzyme immunoassay，CLELA)是以酶标 记生物活性物质进行免疫反应，反应的过程中，酶作用于发光底物（如鲁米诺），在信号试 剂作用下发光，再利用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物 酶（HRP)和碱性磷酸酶（ALP)，两者有各自的发光底物。
[0005] 相关技术中，辣根过氧化物酶（HRP)最常用发光底物是鲁米诺。在化学发光酶免 疫分析（CLEIA)中，使用辣根过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光 底物，在辣根过氧化物酶（HRP)和起动发光试剂（NaOH和H 202)作用下，发光底物（鲁米诺） 发光。在反应的过程中，该化学发光反应体系（HRP-H 202-luminol)通常为几秒内瞬时闪光， 存在发光强度低、持续时间短的缺陷。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种化学发光增敏液，以克服现有技术中的化学发光反应 体系（HRP-H 202_luminol)由于存在的发光强度低、持续时间短的技术问题。本发明的另一 个目的在于提供一种上述化学发光增敏液的制备方法。
[0007] 本发明实施例提供的这种化学发光增敏液，包括：0. l-100mm〇l/L的4-咪唑苯酚、 0. 05-100mmol/L的过氧化氢、0. 05-100mmol/L鲁米诺或鲁米诺衍生物、0. 01-10mol/L的 碱、体积百分数为〇. 01% -20%有机溶剂、离子强度为0. 01-10m〇l/L、pH值为7-11的缓冲 液。
[0008] 本发明提供的这种化学增敏液，其由4-咪唑苯酚、过氧化氢，鲁米诺或鲁米诺衍 生物、碱、有机溶剂及缓冲液组成。在化学发光酶免疫分析（CLEIA)中，将该增敏液加入到 含有辣根过氧化物酶（HRP)的化学发光体系中后，该增敏液以4-咪唑苯酚为增强剂，其优 先与辣根过氧化物酶作用形成自由基，并且作为电子转移中间体提高了鲁米诺或鲁米诺衍 生物自由基的产率，进而实现增敏化学发光反应的效果，通过实验发现，该增敏液可以显著 的增强反应体系的发光强度、大大的延长其发光持续时间，其最大发光强度（化学发光值） 可以达到7. 5X 107,发光持续时间可以达到25分钟。因此，可广泛用于以化学发光为检测 手段的化学、生物、免疫等检测分析产品中，在检测的过程中，由于发光增强效果显著，其发 光持续时间长，从而便于重复测量，进而可提高检测分析的灵敏度和准确性。
[0009] 可选的，所述化学发光增敏液包括：0. l_50mmol/L的4-咪唑苯酚、0. 05_50mmol/ L的过氧化氢、0. 05-50mmol/L鲁米诺或鲁米诺衍生物、0. 01-5mol/L的碱、体积百分数为 0. 01% -10%有机溶剂、离子强度为0. 01-5mol/L的缓冲液。
[0010] 可选的，所述鲁米诺衍生物为鲁米诺钠盐、异鲁米诺或7-氨基-6-巯基邻苯二甲 酰肼。
[0011] 可选的，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙。
[0012] 可选的，所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或；所述缓冲液为 磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
[0013] 本发明提供的这种化学增敏液的制备方法，包括以下步骤：
[0014] (1)、在碱溶液中加入鲁米诺或鲁米诺衍生物，得到既定浓度的鲁米诺或鲁米诺衍 生物的母液；
[0015] (2)、将4-咪唑苯酚加入到有机溶剂中，得到既定浓度的4-咪唑苯酚母液；
[0016] (3)、按照既定体积比将所述鲁米诺或鲁米诺衍生物的母液与所述4-咪唑苯酚母 液混合后，在其中依次加入缓冲液和过氧化氢溶液，混匀，得到化学发光增敏液。
[0017] 可选的，在步骤⑴中，具体包括：称取lllmg鲁米诺，加入到0· Imol/LNaOH水溶 液中，并定容至lOOmL，获得浓度为6. 25mmol/L的鲁米诺母液。
[0018] 可选的，在步骤⑵中，具体包括：称取160mg4-咪唑苯酚，加入到2 % DMF水溶液 中，并定容至100mL，获得浓度为10mm〇l/L的4-咪唑苯酚母液。
[0019] 可选的，在所述步骤（3)中，所述鲁米诺母液和所述4-咪唑苯酚母液的体积比为 1:1。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 为了更清楚地说明本发明【具体实施方式】或现有技术中的技术方案，下面将对具体 实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前 提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0021] 图1为本实施例五提供的化学发光增敏液的制备方法；
[0022] 图2为本发明实施例提供的化学发光增敏液加入到含有辣根过氧化物酶的免疫 反应体系中后，体系的发光值和发光时间关系图。
[0023] 图3为本发明实施例的增敏液中，不同的增强剂在不同辣根过氧化物酶浓度下的 化学发光值稳定的时间图。
【具体实施方式】
[0024] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行 清楚、完整的描述，基于本发明中的【具体实施方式】，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0025] 本发明提供的这种化学发光增敏液，其中包括0. l-100mmol/L的4-咪唑苯酚、 0. 05-100mmol/L的过氧化氢、0. 05-100mmol/L鲁米诺或鲁米诺衍生物、0. 01-10mol/L的 碱、体积百分数为0.01% -20%有机溶剂、离子强度为0.01-10m〇l/L、pH值为7-11的缓 冲液。另外，为了实现更好的增强效果，优选的，在增敏液中，各组份的含量范围可适当锁 销，如：其可包括〇. l_50mmol/L的4-咪唑苯酌·、0. 05_50mmol/L的过氧化氢、0. 05_50mmol/ 1^鲁米诺或鲁米诺衍生物、0.01-5111〇1/1的碱、体积百分数为0.01 (%-10(%有机溶剂、离子 强度为〇. 〇l-5mol/L的缓冲液；另外，优选的，对于各组份，所述鲁米诺衍生物为鲁米诺钠 盐、异鲁米诺或7-氨基-6-巯基邻苯二甲酰肼；所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙； 所述有机溶剂为二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇或乙腈；和/或所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或 Tris-HCl缓冲液。具体在制备的过程中，本发明的增敏液可以同时具备上述条件，或者只满 足上述限定条件中的一项或多项。
[0026] 接下来，通过结合上述的内容，本发明对基于以4-咪唑苯酚作为增强剂的化学发 光增敏液提供了以下具体的实施例，请参考以下内容：
[0027] 实施例一
[0028] 本实施例提供的这种化学发光增敏液，其包括：0. lmmol/L的4-咪唑苯酚、 0. 05mmol/L的过氧化氢、0. 05mmol/L鲁米诺、0. 01mol/L的氢氧化钠、体积百分数为0. 01% 二甲基甲酰胺、离子强度为〇. 01m〇l/L、pH值为7-11的磷酸盐缓冲液。
[0029] 实施例二
[0030] 本实施例提供的这种化学发光增敏液，其包括：10mmol/L的4-咪唑苯酚、lOmmol/ L的过氧化氢、8mmol/L的7-氨基-6-巯基邻苯二甲酰肼、5mol/L的氢氧化钾、体积百分数 为10%二甲基甲酰胺、离子强度为5mol/L、pH值为7-11的Tris-HCl缓冲液。
[0031] 实施例三
[0032] 本实施例提供的这种化学发光增敏液，其包括：50mmol/L的4-咪唑苯酚、50_〇1/ L的过氧化氢、50mmol/L的异鲁米诺或鲁米诺钠盐、5mol/L的氢氧化钙、体积百分数为10% 丙酮、甲醇或乙腈、离子强度为5mol/L、pH值为7-11的Tris-HCl缓冲液。
[0033] 实施例四
[0034] 本实施例提供的这种化学发光增敏液，其包括：100mm〇l/L的4-咪唑苯酚、 1001111]1〇1/1的过氧化氢、1001111]1〇1/1的鲁米诺、101]1〇1/1的氢氧化钠、体积百分数为20 (%丙 酮、甲醇或乙腈、离子强度为10m〇l/L、pH值为7-11的Tris-HCl缓冲液。
[0035] 为了使得本发明上述实施例的化学发光增敏液得到更好的应用，更加有效应用到 化学发光免疫分析的领域中，本发明还在上述实施例的基础之上提供了实施例五，实施例 五给出了上述实施例的化学发光增敏液的制备方法，现做详细的阐述和解释。
[0036] 实施例五
[0037] 本发明实施例提供的化学发光增敏液的制备方法具体包括以下步骤，请参考图 1 :
[0038] 步骤101 :在碱溶液中加入鲁米诺或鲁米诺衍生物，得到既定浓度的鲁米诺或鲁 米诺衍生物的母液；
[0039] 具体的，在该步骤中，称取lllmg鲁米诺，加入到0. Imol/LNaOH水溶液中，并定容 至100mL，获得浓度为6. 25mmol/L的鲁米诺母液，备用。
[0040] 步骤102 :将4-咪唑苯酚加入到有机溶剂中，得到既定浓度的4-咪唑苯酚母液；
[0041] 具体的，称取160mg4-咪唑苯酚，加入到2% DMF水溶液中，并定容至100mL，获得 浓度为10mm〇l/L的4-咪唑苯酚母液，备用。
[0042] 步骤103 :按照既定体积比将所述鲁米诺或鲁米诺衍生物的母液与所述4-咪唑苯 酚母液混合后，在其中依次加入缓冲液和过氧化氢溶液，混匀，得到化学发光增敏液。
[0043] 在该步骤中，所述鲁米诺或鲁米诺衍生物的母液与所述4-咪唑苯酚母液的 体积比为1:1。在操作的过程中，分别吸取2mL鲁米诺母液和2mL4-咪唑苯酚母液，用 16mL0. 05M，pH值为9的Tris-HCl缓冲液稀释，并加入10μ L30%的过氧化氢溶液，混匀即 得。
[0044] 其中，缓冲液的配置方法包括：用1Μ盐酸溶液调整pH值至9.0,后用去离子水定 容至1000mL，获得浓度为0. 05mol/L、pH值为7. 2的Tris-HCl缓冲液，在具体使用的时候 根据特定的需求调至既定的pH和离子浓度。
[0045] 另外，具体的，在本实施例中，整个配置过程可以按照以下操作进行：称取lllmg 鲁米诺，用〇. Imol/LNaOH水溶液定容至100mL，获得浓度为6. 25mmol/L的鲁米诺母液；称 取160mg4-咪唑苯酚，用2% DMF水溶液定容至100mL，获得浓度为10mmol/L的4-咪唑苯 酚母液；称取三羟甲基氨基甲烷6. 05g，先用900mL去离子水溶解后，用1M盐酸溶液调整pH 值至9. 0,后用去离子水定容至1000mL，获得浓度为0. 05mol/L、pH值为7. 2的Tris-HCl 缓冲液；分别吸取2mL鲁米诺母液和2mL4-咪唑苯酚母液，用16mL0. 05M，pH值为9. 0的 Tris-HCl缓冲液稀释，并加入10 μ L30%的过氧化氢溶液，混匀后得到化学发光增敏液。
[0046] 请参考图2,通过上述方法制成的化学发光增敏液，其将其加入含有辣根过氧化物 酶的免疫反应体系中，可出现化学发光反应，通过化学发光检测仪检测发光值与发光时间。
[0047] 检测结果如图2所示，从图2可知，基于增强剂4-咪唑苯酚的化学发光增敏液有 效增强了鲁米诺-辣根过氧化物酶-过氧化氢化学发光体系的发光强度（最大发光强度可 以达到7. 5Χ107)，延长了其发光持续时间（可以达到25分钟）；其具有明显的发光增强效 果和提高发光时间以及其发光稳定性的效果。
[0048] 另外，本发明还基于对增敏液中的增强剂进行替换，通过考察了在不同浓度的辣 根过氧化物酶（HRP)的条件下，测定其在20分钟内的发光动力。具体结果请参考表1 : [0049] 表1辣根过氧化物酶浓度和不同增强剂对发光的影响 [0050]
【权利要求】
1. 化学发光增敏液，其特征在于，所述化学发光增敏液包括： 0. l-100mmol/L 的 4_ 咪唑苯酌·、0. 05-1 OOmmol/T,的过氧化氧、0. 05-1 OOmmol/T,鲁米 诺或鲁米诺衍生物、〇. 01-10m〇l/L的碱、体积百分数为0. 01% -20%有机溶剂、离子强度为 0.01-10mol/L、pH 值为 7-11 的缓冲液。
2. 根据权利要求1所述的化学发光增敏液，其特征在于，所述化学发光增敏液包括： 0. l-50mmol/L 的 4-咪唑苯酌·、0. 05-50mmol/L 的过氧化氧、0. 05-50mmol/L 鲁米诺 或鲁米诺衍生物、0.01-5111〇1/1的碱、体积百分数为0.01(%-10(%有机溶剂、离子强度为 0· 01-5mol/L的缓冲液。
3. 根据权利要求1所述的化学发光增敏液，其特征在于：所述鲁米诺衍生物为鲁米诺 钠盐、异鲁米诺或7-氨基-6-巯基邻苯二甲酰肼。
4. 根据权利要求3所述的化学发光增敏液，其特征在于，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾 或氢氧化钙。
5. 根据权利要求1所述的化学发光增敏液，其特征在于，所述有机溶剂为二甲基甲酰 胺、丙酮、甲醇或乙腈； 和/或； 所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
6. -种根据权利要求1所述的化学发光增敏液的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 、在碱溶液中加入鲁米诺或鲁米诺衍生物，得到既定浓度的鲁米诺或鲁米诺衍生物 的母液； (2) 、将4-咪唑苯酚加入到有机溶剂中，得到既定浓度的4-咪唑苯酚母液； (3) 、按照既定体积比将所述鲁米诺或鲁米诺衍生物的母液与所述4-咪唑苯酚母液混 合后，在其中依次加入缓冲液和过氧化氢溶液，混匀，得到化学发光增敏液。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在步骤⑴中，具体包括： 称取lllmg鲁米诺，加入到0. Imol/LNaOH水溶液中，并定容至100mL，获得浓度为 6. 25mmol/L的鲁米诺母液。
8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤⑵中，具体包括： 称取160mg4-咪唑苯酚，加入到2% DMF水溶液中，并定容至100mL，获得浓度为 10mmol/L的4-咪唑苯酌·母液。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤（3)中，所述鲁米诺母液 和所述4-咪唑苯酚母液的体积比为1: 1。
【文档编号】G01N33/532GK104049080SQ201410302775
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】金茂俊, 王静, 杨丽华, 杜鹏飞, 金芬, 邵华, 佘永新, 王珊珊 申请人:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所