一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的分析方法
【专利摘要】本发明属于一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的分析方法，其特征在于：采用该方法可较为方便和快速地定量检测出活性氧引起的体内代表性氧化应激生物标志物的变化情况，可用于评估体内氧化损伤和修复程度，研究疾病病理过程。本发明采用AgilentBondEluC18固相萃取柱，可同时净化尿液中两类不同质谱检测模式的三种化合物：8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷（正离子模式检测）和8-异构前列腺素F2α（负离子模式检测），并采用相同的液相色谱柱和流动相对三种化合物进行液相色谱串联质谱检测。该方法前处理简单便捷，灵敏度高、重复性和回收率好。
【专利说明】一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构 前列腺素 F2a的分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素 F2 a的前处理和分析新方法，并将其用于人体尿液中氧化应激指标的评估。具体是采用 Agilent Bond EluC18固相萃取柱同时净化尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异 构前列腺素F2 a，然后采用HPLC-MS/MS技术测定尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和 8_异构前列腺素F2 a含量的分析方法。
【背景技术】
[0002] 活性氧（ROS)是细胞有氧代谢过程中产生的化学性质活泼的氧自由基和能转化 为自由基的物质。生物体内的ROS是机体不可或缺的物质，它的产生与消除处于动态平衡 状态。在低浓度和中等浓度时，ROS起重要的生理作用，它参与机体的免疫过程，并能调节信 号传导途径、控制基因表达和蛋白质翻译后的修饰等，进而参与细胞生长、分化、死亡等。但 当ROS的产生和机体的抗氧化能力之间的平衡被打破而导致ROS超过生理限度时，就会损 害生物大分子，如DNA、RNA氧化损伤和脂质体过氧化等，从而引起多种疾病的发生和发展。 8_羟基-脱氧鸟苷，8-羟基鸟苷和-异构前列腺素F2 a分别对应于DNA、RNA氧化损伤产 物和脂质过氧化产物。这三种化合物为代表性的氧化应激生物标志物，分析这三种化合物 的含量对于评估体内氧化损伤程度以及研究疾病病理过程都有重要作用。
[0003] 目前，8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷可采用用酶联免疫法、气相色谱质谱 (GC-MS)、液相色谱-电化学以及HPLC-MS/MS法进行检测，其中HPLC-MS/MS法选择性好，灵 敏度高。在HPLC-MS/MS进行分析时，样品可采取直接稀释或固相萃取进行前处理净化，但 由于这些化合物极性很高，在常用的反相色谱柱上基本不保留，结果导致这些化合物与其 它干扰物不宜分离，造成定量干扰，并且电喷雾离子源（ESI源)对反相柱分离的极性化合物 的检测并不是很灵敏，实际样品化合物灵敏度可能会低于检测限；8-异构前列腺素F2 a可 采用酶联免疫法，GC-MS和HPLC/MS/MS进行分析。HPLC-MS/MS法具有较好的灵敏度和选择 性，适宜于8-异构前列腺素F2 a的分析。但尿样中这种化合物含量较低，又存在有其他结 构类似的化合物，样品通常是需要固相萃取或是液液萃取-固相萃取相结合的方式进行净 化，浓缩后进行定量。
[0004] 文献尽管针对3种化合物都建立了相应的HPLC-MS/MS分析方法，但对于8-羟 基-脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，有必要通过合适的样品前处理方法降低样品检测时的基质效 应，提高检测的灵敏度和选择性；对于8-异构前列腺素F2a的分析，则要注重于发展高效、 稳定、灵敏的前处理方法。并且三种化合物分属于两种质谱检测模式，文献通常采用不同的 前处理方法(不同的SPE方法）和仪器方法(不同的色谱柱和流动相）进行分析，处理通量不 大。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的不足而提供的一种人体尿液中 8_羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2 α的固相萃取前处理和HPLC-MS/MS 分析新方法。采用该方法可便捷地同时净化人体尿液中的8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和 8_异构前列腺素F2 α，并采用HPLC-MS/MS对三种化合物的含量进行定量分析。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、 8_羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2 α的分析方法，包括以下步骤： (1) 8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2 α的净化：将解冻好的尿液 lmL，在37° C下加热5min溶解可能混在沉淀中的目标化合物，加入40 μ L [ffl -8-羟基 鸟苷和D4-8-异构前列腺素F2a混合内标溶液。采用Agilent Bond EluC18固相萃取柱 对尿液样品中的三种化合物进行净化。具体过程为：将尿液上样至已活化的Agilent Bond EluC18固相萃取柱上（5ml甲醇和5ml H20活化)，2ml H2O洗涤，2ml体积比为I : 4的甲 醇/H2O洗脱8-羟基-脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷(第一集分)，2ml体积比为5 : 5的甲醇/ H2O洗杂质，最后再用2ml体积比为3 : 1的甲醇/H2O洗脱8-异构前列腺素F2 a (第二集 分)。由于8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷极性较大，含较少的有机相的洗脱液就可以将这两 种化合物洗脱，而8-异构前列腺素极性较弱，需要较高有机相的洗脱液才能将其洗脱。为 减少每一洗脱集分的杂质，降低基质效应，提高检测的灵敏度，因此采用不同配比的甲醇水 溶液对三种化合物进行逐步洗脱，尽可能去除样品中可能的其它杂质。
[0007] (2) 8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2 a的HPLC-MS/MS分析： 分析条件如下： 米用 Agilent Poroshell 120 SB-C18 (150 mm X 3· 0 mm i. d.，2· 7 μ m)色谱柱； 柱温：30 °C ;进样量：10 μ? ;流速：300 μ L/min ;流动相：Α· 0. 1%乙酸溶液，B.乙腈；洗 脱梯度：〇 -2min，5%B，6-9 min 100%B，10-15 min，5 %B，；离子源：电喷雾离子源（ESI);扫 描模式：8-轻基脱氧鸟苷、8-轻基鸟苷-----正离子扫描，8-异构前列腺素F2 a-----负离 子扫描；检测方式：多反应监测（MRM);干燥气（N2)温度和流速：290 °C，11 L/min ;雾化器 压力：40 psi ;鞘气（％)温度和流速：400 °C，12 L/min;毛细管电压（Capillary voltage): 3500 V ;碎裂电压（Fragmentor voltage) :380 V ;碰撞气：N2。雾化电压：1500V 分析物及其内标的MRM参数参见表1。
[0008] 表1分析物及其内标的MRM参数
【权利要求】
1. 一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2 a的分析方 法，其特征在于：包括以下步骤：将解冻好的尿液lmL，在37° C下加热5min溶解可能混在沉 淀中的目标化合物，加入[ffl-8-羟基鸟苷和D4-8_异构前列腺素F2a的混合内标溶液； 采用Agilent Bond EluC18固相萃取柱对尿液样品中的8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和 8_异构前列腺素F2 a进行净化，具体过程是：尿液上样至已活化的Agilent Bond EluC18 固相萃取柱上，2ml H20洗涤，2ml体积比为1 : 4的甲醇/H20洗脱属于第一集分的8-羟 基-脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，2ml体积比为5 : 5的甲醇/H20洗杂质，最后再用2ml体积 比为3 : 1的甲醇/H20洗脱属于第二集分的8-异构前列腺素F2a，将净化后的2个洗脱 集分采用液相色谱-串联质谱（HPLC-MS /MS)方法检测8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和 8_异构前列腺素F2 a的浓度。
2. 根据权利要求1所述的人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺 素F2a的分析方法，其特征在于：Agilent Bond EluC18固相萃取柱使用前先通过5ml甲 醇和5ml H20进行活化。
3. 根据权利要求1所述的人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺 素F2 a的分析方法，其特征在于：HPLC-MS/MS分析条件如下： 采用规格为 150 mm X 3.0 mm i.d.，2.7 iim 的 Agilent Poroshell 120 SB-C18 色谱柱；柱温：30 °C;进样量：10 ML;流速：300 iiL/min;流动相：A. 0. 1%乙酸溶液，B. 乙腈；洗脱梯度：〇 _2min，5%B，6_9 min 100%B，10_15 min，5 %B，；离子源：电喷雾离子 源（ESI);扫描模式：8-轻基脱氧鸟苷、8-轻基鸟苷-----正离子扫描，8-异构前列腺素 F2 a-----负离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM);干燥气（N2)温度和流速：290 °C， 11 L/min;雾化器压力：40 psi;鞘气（N2)温度和流速：400 °C，12 L/min;毛细管电压 (Capillary voltage) :3500 V ;碎裂电压（Fragmentor voltage) :380 V ;碰撞气：N2 ;雾化 电压：1500V。
4. 根据权利要求1所述的人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺 素F2a的分析方法，其特征在于：所述混合内标溶液中的[ffl-8-羟基鸟苷和D4-8_异 构前列腺素F2a在待测样品溶液中的最终浓度均为lOng/ml。
【文档编号】G01N30/88GK104391071SQ201410761123
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年12月13日 优先权日:2014年12月13日
【发明者】赵阁, 余晶晶, 王昇, 王冰, 谢复炜 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院