一种同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，旨在提供一种快速简便，灵敏度高，并且可同时检测化妆品中掺杂林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡；其技术要点是：包括PVC板，PVC板的正面依次衔接第一样品垫、第一金标结合垫、第一包被膜和第一吸水垫，第一包被膜上设有林可霉素偶联载体蛋白溶液隐性检测线和羊抗兔IgG溶液隐性质控线，两条线平行排列；反面依次衔接第二样品垫、第二金标结合垫、第二包被膜和第二吸水垫，第二包被膜上设有硝基咪唑类药物偶联载体蛋白溶液隐性检测线和羊抗兔IgG溶液隐性质控线，两条线平行排列；属于生物检测【技术领域】。
【专利说明】
—种同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种胶体金试纸卡，具体的说，是一种同时检测化妆中林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，属于生物检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]林可霉素是一种广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌及某些厌氧的革兰氏阴性菌有效，临床上广泛用于除神经系统之外的敏感菌所致的各种感染，具有很好的抗菌、消炎作用，可外用也可内服，外用如林可霉素维B6乳膏可用来治疗粉刺和脂溢性皮炎，但是，该类药物的不良反应(ADR)也不容忽视。据不完全统计，林可霉素类药物的ADR，占抗生素药物不良反应的22.06%[4]。林可霉素类药物常见的不良反应有:恶心、呕吐、胃部不适、腹泻，甚至可引起伪膜性肠炎等胃肠道反应；可致转氨酶升高、胆红素升高和肝脏病理改变等肝脏损害；可致药疹、皮炎、黏膜溃疡、血管神经性水肿和哮喘等过敏反应以及血压下降、心电图改变、潮红及发热感等，甚至可致心跳骤停等心血管反应[5]。2009年连续发生克林霉素注射剂的不良反应事件，引起国家有关部门的重视，国家药品不良反应监测中心向全国通报了克林霉素注射剂严重不良反应的情况，卫生部还为此特别印发了《关于加强克林霉素注射剂临床使用管理的通知》(卫办医政发
[2009] 107号)。
[0003]因此，此类药品必须在医生指导、病人知情下，按一定的剂量使用，而非在消费者毫不知情、毫无限值的情况下作为化妆品使用。我国《化妆品卫生规范》(2007年版)、欧盟化妆品法规(2009/1223/EC)规定林可霉素禁止在化妆品中使用。
[0004]硝基咪唑类药物(nitroimidazoles)是一类具有5_硝基咪唑环结构的药物,包括甲硝唑(metronidazole, MNZ)、地美硝唑(dimetridazole, DMZ)、洛硝达唑(ronidazole,RNZ)和替硝唑(tinidazole，TNZ)等。该类药物主要用于治疗和预防厌氧菌引起的局部或系统感染，抑制厌氧菌的DNA合成，也用于抗滴虫和阿米巴原虫等。由于硝基咪唑类药物含有的硝基杂环类化合物具有细胞诱变性，从而导致此类药物有致癌作用和潜在的致畸作用，因此硝基咪唑类药物在大多数国家为禁止使用或允许使用但必须严格监控的药物。
[0005]但是近年来，一些不法商家利用林可霉素的抗菌、消炎的良好作用，硝基咪唑类药物预防厌氧菌引起的局部或系统感染，抑制厌氧菌的DNA合成，在声称可祛痘、抑粉刺的化妆品中擅自添加林可霉素和硝基咪唑类药物，使用者在不知情的情况下使用该类产品，易引发皮疹、瘙痒等不良后果。
[0006]目前，在祛痘、抑粉刺的化妆品中是否掺杂林可霉素和硝基咪唑类药物的检测方面主要有以下几种方法:
[0007]1、酶联免疫法
[0008]样品经处理后，取一定量加入到微孔中，同时加入一定量的抗林可霉素或硝基咪唑类药物抗体酶结合物，37°C温育30分钟，甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体，再加显色液，37°C温育10分钟，加终止液终止，混勻，在450nm下检测吸光度,在5min内读取结果。
[0009]该方法的优点在于灵敏度高，特异性强，但操作比较繁琐，耗时较长，同时试剂需在低温下保存；对环境，实验室的配置有一定的要求，同时操作人员也需要一定的专业素养，不适合基层人员现场检测。
[0010]2、薄层色谱法
[0011]采用甲醇提取样品中的待测成分，所得供试品溶液与对照品溶液在硅胶板上经展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯254nm下检视。在展开剂的作用下，由于不同物质的迁移速度不同，不同物质在薄层色谱板上的不同位置以斑点的形式出现，根据待测样品是否在与对照品相应的位置出现斑点这一实验现象来判断待测样品中是否含有目标成分。如果供试品溶液薄层色谱图与林可霉素对照品相应位置出现斑点，则提示样品中可能含有林可霉素或硝基咪唑类药物成分。
[0012]薄层色谱法的优点是不需要昂贵的分析仪器。该法缺点是:色谱分辨率较低，中成药成分复杂，干扰因素多，容易产生误判。
[0013]色谱展开和晾干所需时间较长，不足以满足快速测定的要求。薄层色谱板需要烘干并干燥存放，分离效果受环境因素影响较大，不适合现场检测。需要有固定的场所，不合适作流动性大的现场检测。对检测人员的专业技术要求较高，不适合基层人员现场操作。
[0014]3、高效液相色谱法
[0015]高效液相色谱法是常用的现代分析方法，在相同的色谱条件下，不同的物质有不同的色谱保留时间。在相同的色谱条件下林可霉素或硝基咪唑类药物对照品溶液与样品提取所得供试品溶液分别进样，根据色谱保留时间可判断待测样品是否含有林可霉素或硝基咪唑类成分。
[0016]高效液相色谱法的优点是色谱分离效率高、灵敏度高。但目前也存在以下缺点:仪器价格昂贵，样品前处理时间长，色谱柱易受污染，分析成本高；当共存成分的色谱峰保留时间与林可霉素色谱保留时间接近时容易造成误判；仪器对环境的要求高，需固定放置，不适合现场检测；不同理化性质的组分往往需要建立不同的方法和色谱条件，不一定能实现同时检测。
[0017]4、高效液相色谱-质谱联用法
[0018]以高效液相色谱仪作为分离器，质谱仪作为分析器的高效液相色谱-质谱联用法适合于成分复杂、背景干扰严重的样品分析，这种分析方法可提高检测结果的可靠性。但高效液相色谱-质谱联用法是一种分析成本比高效液相色谱更高，操作更加复杂的分析方法。仪器对环境的要求更高，需要固定放置，不合适现场检测。目前这些检验只能在少数实验室中进行，不易推广使用。
[0019]综上所述，目前在化妆品中是否掺杂林可霉素或/和硝基咪唑类药物的检测方面，尚需一种灵敏度高，操作简单，进行快速筛查的方法，对于基层检验单位，开发化妆品中非法掺杂林可霉素的快速筛查方法，在监管现场对样品进行快速分析，为化妆品监管及时提供证据，打击不法分子的非法添加行为。
[0020]胶体金法试剂盒因其快速、简便，结果直观而得到广泛应用，在现代POCT(Point-Of-care Testing)技术中具有重要地位，虽然，目前市场上有一些林可霉素或硝基咪唑类药物的检测试剂盒，但并不能实现同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物，若要检测一种化妆品中是否同时存在林可霉素和硝基咪唑类药物，就需要两种试剂盒，成本较高，使用也不方便。
实用新型内容
[0021]针对上述不足，本实用新型的目的在于提供一种使用方便，快速简便，灵敏度高，并且可同时检测化妆品中掺杂林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡。
[0022]为解决上述技术问题，本实用新型提供的技术方案如下:该同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，包括PVC板，PVC板的正面依次衔接第一样品垫、第一金标结合垫、第一包被膜和第一吸水垫组成，在第一包被膜上设有林可霉素偶联载体蛋白的溶液隐性检测线和羊抗兔IgG溶液隐性质控线，两条线平行排列；PVC板的反面依次衔接第二样品垫、第二金标结合垫、第二包被膜和第二吸水垫组成，在第二包被膜上设有硝基咪唑类药物偶联载体蛋白隐性检测线和羊抗兔IgG溶液隐性质控线，两条线平行排列。
[0023]所述的第一金标接合垫为吸附林可霉素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物的玻璃纤维，所述的第二金标接合垫为吸附硝基咪唑类药物单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物的玻璃纤维。
[0024]上述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，所述的第一包被膜和第二包被膜均为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0025]上述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，所述的第一样品垫压在第一金标结合垫的1/2?1/3 ;所述的第二样品垫压在第二金标结合垫的1/2?1/3处。
[0026]上述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，所述的第一金标结合垫压在第一包被膜的0.1?0.2cm处；所述的第二金标结合垫压在第二包被膜的0.1?0.2cm 处。
[0027]上述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，所述的羊抗兔IgG溶液隐性质控线(Cl)距离第一包被膜(4a)上端5-7mm，羊抗兔IgG溶液隐性质控线(Cl)和林可霉素偶联载体蛋白溶液隐性检测线(Tl)间距为4-5mm。所述的羊抗兔IgG溶液隐性质控线(C2)距离第二包被膜(4b)上端5?7mm，羊抗兔IgG溶液隐性质控线(C2)和硝基咪唑类药物偶联载体蛋白溶液隐性检测线(T2)间距为4?5mm。
[0028]上述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，所述的第一吸水垫压在第一包被膜的0.1?0.2cm处；所述的第二吸水垫压在第二包被膜的0.1?0.2cm处。
[0029]与现有技术相比，本实用新型提供的技术方案，可同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物，操作步骤简单，检测速度快，结果容易观察，可实现对大批量样品的快速筛查，大大降低检测成本，减少工作量，在食品药品监管中具有实际意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1是本实用新型提供的检测试卡结构示意图；
[0031]图2是本实用新型提供的检测试卡正面结构示意图；
[0032]图3是本实用新型提供的检测试卡反面结构示意图；
[0033]图4是本实用新型提供的检测卡判定结果为阴性时示意图；
[0034]图5是本实用新型提供的检测卡判定结果为阳性时示意图；
[0035]图6是本实用新型提供的检测卡判定结果为无效时示意图。
[0036]其中:PVC板I,正面Ia,第一样品垫2a,第一金标结合垫3a,第一包被膜4a,第一吸水垫5a，直线式隐性检测线Tl，直线式隐性质控线Cl，反面lb，第二样品垫2b、第二金标结合垫3b、第二包被膜4b，第二吸水垫5b，直线式隐性检测线T2，直线式隐性质控线C2。
【具体实施方式】
[0037]下面结合【具体实施方式】，对实用新型的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本实用新型的任何限制，任何人在本实用新型权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本实用新型的权利要求保护范围内。
[0038]实施例1
[0039]本实用新型提供的一种同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，参见图1至图3，包括PVC板1，PVC板I的正面Ia依次衔接第一样品垫2a、第一金标结合垫3a、醋酸纤维素膜的第一包被膜4a和第一吸水垫5a。为了更方便的操作，并且外形美观，所述的第一样品垫2a压在第一金标结合垫3a的1/2?1/3处，更优选的是在1/3处；第一金标结合垫3a压在第一包被膜4a的0.1?0.2cm处,更优选的是在0.15cm处；第一吸水垫5a压在第一包被膜4a的0.1?0.2cm处，更优选的是在0.15cm处；直线式隐性质控线Cl距离第一包被膜4a上端5-7mm，更优选的是在6mm处，直线式隐性质控线Cl和直线式隐性检测线Tl间距为4?5mm，更优选的间距是4.5mm。
[0040]为了检测速度快，所得结果容易观察，所述的第一金标接合垫3a为吸附林可霉素单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物的玻璃纤维，在第一包被膜4a用林可霉素偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐性检测线Tl，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐性质控线Cl，两条线平行排列。
[0041 ] 其中，所述的包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述的单克隆-兔IgG的用量为0.15?0.5 μ g/cm2,优选0.25?0.40 μ g/cm2’更优的选择为0.3 μ g/cm2,所述的林可霉素单克隆抗体_胶体金复合物的用量为0.15?0.5 μ g/ cm2,优选0.20 μ g/mm,所述的羊抗兔IgG的浓度为4mg/ml,所述羊抗兔IgG的用量为0.03?0.05 μ g/mm,优选0.04 μ g/mm，所述的林可霉素单克隆抗原的用量为0.05?0.1 μ g/mm,优选0.05 μ g/mm。
[0042]PVC板I的反面Ib依次衔接第二样品垫2b、第二金标结合垫3b、硝酸纤维素膜的第二包被膜4b和第二吸水垫5b组成，所述的第二样品垫2b压在第二金标结合垫3b的1/2?1/3处，更优选的是在1/3处。所述的第二金标结合垫3b压在第二包被膜4b的0.1?0.2cm处，更优选的是在0.15cm处。所述的直线式隐性检测线C2距离第二包被膜4b上端5?7mm，更优选的是在6mm处，所述的第二吸水垫5b压在第二包被膜4b的0.1?0.2cm处，更优选的是在0.15cm处；直线式隐性质控线C2和直线式隐性检测线T2间距为4?5mm,更优选的间距是4.5mm。
[0043]为了检测速度快，所得结果容易观察，所述的第二金标接合垫3b为吸附硝基咪唑类药物单克隆抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物的玻璃纤维，在第一包被膜4b用硝基咪唑类药物偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐性检测线T2，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐性质控线C2，两条线平行排列。
[0044]其中，所述的包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述的单克隆-兔IgG的用量为0.15?0.5 μ g/cm2,优选0.25?0.40 μ g/cm2’更优的选择为0.3 μ g/cm2,所述的硝基咪唑类药物单克隆抗体-胶体金复合物的用量为0.15?0.5 μ g/ cm2,优选0.20 μ g/mm,所述的羊抗兔IgG的浓度为4mg/ml,所述羊抗兔IgG的用量为0.03?0.05 μ g/mm,优选
0.04 μ g/mm,所述的硝基咪唑类药单克隆抗原的用量为0.05?0.1 μ g/mm,优选0.05 μ g/mm η
[0045]该掺杂林可霉素或/和硝基咪唑类药物的快速检测方法，依次包括下述步骤:
[0046]I)对需检测的产品加醇类和正己烷:75%乙醇0.2ml，正己烷0.8ml。
[0047]其中:不同剂型样品溶解方法如下:
[0048]水剂等液体剂型:用刻度吸管吸取0.1ml0
[0049]膏剂、乳剂、霜剂、凝胶剂等固体剂型:用取样勺取约0.lg。
[0050]向上述任意一种样品加入有机溶剂乙醇和正己烷，有机溶剂的使用量以浸没待测样品为宜，本实用新型选用I?2mL的使用量，基本上可覆盖不同剂型样品的需要。
[0051]为保证提取完全，振摇时间应不少于30秒，部分样品较难溶，可适当加热助溶。
[0052]2)将步骤I)的底层溶液加PBS缓释剂Iml稀释，混匀，得待检样品液。
[0053]3)将步骤2)样品液滴加于掺杂林可霉素或/和硝基咪唑类药物胶体金层析检测卡上，开始计时，3?5min后，根据胶体金试纸条的检测线Tl或者T2和控制C线的显色，判断待测样品为阳性或阴性；
[0054]4)步骤3)所述的胶体金检测试纸上的控制线Cl或者C2和检测线Tl或者T2线均显紫红色，则判断为阴性，即待测样品中未掺杂林可霉素或/和硝基咪唑类药物化学成分或低于检测下限；胶体金检测试纸上的控制线Cl或者C2显紫红色，检测线Tl或者T2不显色，则判断为阳性，即待测样品中含有林可霉素或/和硝基咪唑类药物化学成分；胶体金检测试纸上的控制线Cl或者C2和检测线均不显色，或只出现检测线Tl或者T2显色，则说明实验无效，参阅图4至图6应用新的胶体金检测试纸重新检测。
[0055]检测例I
[0056]用实例I的方法检测三种浓度的样品:1)阴性样本:无林可霉素的化妆品；2)林可霉素的标准品:浓度为100ng/ml ;3)林可霉素的标准品:浓度为50ng/ml ;检测结果I)全部显示阴性，2)全部显示阳性，3)全部显示阴性。可见本检测方法的检测下限为100ng/ml。
[0057]检测例2
[0058]用实例I的方法检测三种浓度的样品:1)阴性样本:无硝基咪唑类药物的化妆品；2)阳性样本品:在I)阴性样本中添加硝基咪唑类药物至5ug/g或者5ug/ml ；3)阳性样本品:在I)阴性样本中添加硝基咪唑类药物至2.5ug/g或者2.5ug/ml ;I)全部显示阴性，2)全部显示阳性，3)全部显示阴性。可见本检测方法的检测下限为5ug/ml。
[0059]检测例3
[0060]用实例I的方法分别检测浓度为100ug/ml的氯霉素类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类、内酰胺类、甲硝唑类标准品，结果均显阴性，可见，该试纸与上述药物无交叉反应。
[0061]需要说明的是，上述实施例只是以检测化妆品的林可霉素的为特殊例进行具体说明，但并不限于此，经过适当的前处理，同样可以检测食品、药品等物质中的林可霉素。
【权利要求】
1.一种同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡，其特征在于，包括PVC板(1)，其特征在于，PVC板(I)的正面(Ia)依次衔接第一样品垫(2a)、第一金标结合垫(3a)、第一包被膜(4a)和第一吸水垫(5a),在第一包被膜(4a)上设有林可霉素偶联载体蛋白溶液隐性检测线(Tl)和羊抗兔IgG溶液隐性质控线(Cl )，两条线平行排列；PVC板(I)的反面(Ib)依次衔接第二样品垫(2b)、第二金标结合垫(3b)、第二包被膜(4b)和第二吸水垫(5b)，在第二包被膜(4b)上设有硝基咪唑类药物偶联载体蛋白溶液隐性检测线(T2)和羊抗兔IgG溶液隐性质控线(C2)，两条线平行排列。
2.根据权利要求1所述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡,其特征在于，所述的第一金标结合垫(3a)和第二金标接合垫(3b)为玻璃纤维。
3.根据权利要求1所述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡,其特征在于，所述的第一包被膜(4a)和第二包被膜(4b)均为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡,其特征在于，所述的第一样品垫(2a)压在第一金标结合垫(3a)的1/2?1/3处；所述的第二样品垫(2b)压在第二金标结合垫(3b)的1/2?1/3处。
5.根据权利要求1所述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡,其特征在于，所述的第一金标结合垫(3a)压在第一包被膜(4a)的0.1?0.2cm处。
6.根据权利要求1所述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡,其特征在于，所述的第二金标结合垫(3b)压在第二包被膜(4b)的0.1?0.2cm处。
7.根据权利要求1所述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡,其特征在于，所述的羊抗兔IgG溶液隐性质控线(Cl)距离第一包被膜(4a)上端5-7mm，羊抗兔IgG溶液隐性质控线(Cl)和林可霉素偶联载体蛋白溶液隐性检测线(Tl)间距为4-5mm。
8.根据权利要求1所述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡,其特征在于，所述的羊抗兔IgG溶液隐性质控线(C2)距离第二包被膜(4b)上端5?7mm，羊抗兔IgG溶液隐性质控线(C2)和硝基咪唑类药物偶联载体蛋白溶液隐性检测线(T2)间距为4 ?5mm。
9.根据权利要求1所述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡,其特征在于，所述的第一吸水垫(5a)压在第一包被膜(4a)的0.1?0.2cm处。
10.根据权利要求1所述的同时检测林可霉素和硝基咪唑类药物的胶体金试纸卡,其特征在于,所述的第二吸水垫(5b)压在第二包被膜(4b)的0.1?0.2cm处。
【文档编号】G01N33/577GK204101565SQ201420393667
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】陈张好, 黄文静, 刘小娟, 王炳志, 张炎钦, 王懿 申请人:广东省食品药品检验所