一种检测鸡肌肉组织中残留的地美硝唑的高效液相色谱法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测鸡肌肉组织中地美硝唑残留的高效液相色谱方法，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]地美硝唑(dirnctridazolc，DMZ)为硝基咪唑类药物，具有抗原虫和抗菌活性，同时具有很强的抗厌氧菌作用，用于治疗鸡组织滴虫病、猪密螺旋体性痢疾、肠道和全身的厌氧菌感染。但它有致癌、致突变及潜在毒性。地美硝唑的主要代谢物羟基地美硝唑(hv—dfoxy dinetridazole, DMZ0H)同样可能有致突变性,欧盟和英国都把地美硝唑列为禁用的兽药，我国规定地美硝唑的MRL为O。国外建立了多种检测动物组织中地美硝唑及其它硝基咪唑类药物的检测方法，主要有气相色谱法、高效液相色谱(HPLC)-电化学检测法、高效液相色谱-紫外法、质谱法等。国内谢凯舟等用HPLC测定地美硝唑在肉鸡组织中的残留，沈建忠等分别建立了检测鸡肉、家禽肌肉组织中硝基咪唑类药物的液相色谱法。有关同时检测DMZ和DMZDH的报道较少，且检测限高。因此建立了测定鸡肌肉组织中DMZ和DMZDH的高效液相色谱法。
【发明内容】
[0003]为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种检测鸡肌肉组织中地美硝唑残留的高效液相色谱分析方法。
[0004]本发明的目的之一是这样实现的:检测地美硝唑残留的高效液相色谱分析仪，其关键在于色谱条件的设定和使用前柱子的清洗与活化。
[0005]本发明主要采用高效液相色谱分析法检测鸡肌肉组织中的地美硝唑的残留，采用高效液相分析法的技术主要有二个方面，第一，C18固相萃取小柱活化及淋洗、洗脱溶剂的选择，试验用C18固相萃取小柱进行样品处理，小柱的活化及淋洗、洗脱溶剂的选择是保证高回收率的关键，在试验过程中曾选择了甲醇、水依次活化，但回收率较低，而选择乙腈代替甲醇，使药物回收率可达98%以上；淋洗过程应该洗去尽量多的杂质，这样就应该选择较强洗脱能力的淋洗剂，而5%甲醇水溶液就可淋洗掉5%的DMZDH，因此只能选水做淋洗剂；极性较强的甲醇可以把药物从C18固相萃取小柱洗脱下来，且甲醇的沸点较低，氮气容易吹干。第二，流动相的选择对HPLC是很重要要的，DMZ和DMZOH为弱碱性药物，在流动相中加入0.1 %的三乙胺减小硅羟基效应，避免色谱峰拖尾，此试验所选的硅胶基质填料色谱柱，PH值使用范闱为2.0?8.0 ;流动相pH值较大，碱性药物的保留时间将增加，用磷酸调节pH值3.0时，且磷酸三乙胺溶液-乙腈比例为94:6时峰形对称且尖锐，在浚时间段处无干扰杂质峰。
[0006]本发明检测方法具有分辨率高、速度快、重复性高、自动化操作分析精确度高，在室温下就可进行检测等优点。第三，提取溶剂的选择，国内外提取硝基咪唑类药物用的溶剂有二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈等。地美硝唑和羟基地美硝唑极性较低，用极性低的二氯甲烷即可萃取到药物，乙酸乙酯、乙腈萃取时干扰杂质较大，而二氯甲烷沸点为40 °C,旋转蒸发时很容易蒸干。在用水和正己烷溶解残渣时不发生乳化且共萃取的杂质量小。加入无水硫酸钠，利用其盐析作用可提高回收率。
【附图说明】
[0007]图1 DMZ 和 DMZOH 标准溶液(0.04 μ g/mL)。
[0008]图2鸡空白肌肉色谱图。
[0009]图3鸡空白肌肉组织添加DMZ和DMZOH (I μ g/kg)色谱图。
【具体实施方式】
[0010]1.溶液配制:
地美硝唑储备液(lmg/L):称取1mg地美硝唑标准品于1mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-20 °C保存，用棕色容量瓶保存。
[0011 ] 轻基地美硝唑储备液(lmg/L):称取1mg地美硝唑标准品于1mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-20 °C保存，用棕色容量瓶保存。
[0012]磷酸三乙胺溶液:1000mL水中加入三乙胺1.0mL，应用磷酸调节PH为3.0。
[0013]2.色谱条件:色谱柱:Hypersil 0DS2, 5 μ m, 4.6 mmX 250 mm ;流动相:三乙胺溶液(用磷酸调PH值至3.0)-乙腈(94:6);流速:lmL /min ;柱温:室温；紫外检测波长:320nm ;进样量:20 μ L。
[0014]3.样品处理:
提取与净化:取绞碎混匀的鸡肉1g置于50mL塑料离心管中，加入无水硫酸钠12 g、二氯甲烧20mL,旋润混合4min,4 000 r / min离心10 min,取有机层置100 mL旋转蒸发瓶中。样品加二氯甲烷15mL，重复上述操作。2次合并提取液置于40°C水浴中旋转真空蒸干，用正己烷和水各2mL溶解残渣，转移至50mL离心管中。蒸发瓶用正己烷和水各2mL再洗2次,合并3次溶解溶液,2 000 r / min离心5min。取水层,再向剩余正己烧的离心管中加水6 mL，旋涡混合离心，取出水层合并成备用液。
[0015]净化:C 18固相萃取小柱预先用乙腈1mL,水1mL活化，备用液过柱，自然流出，3mL水淋洗，淋洗后萃取小柱8 000 r / min离心8 min，甲醇3mL洗脱药物，洗脱液氮气吹干,加流动相0.5mL溶解残余物，过0.45 μ m微孔滤膜，收集滤液作为试样溶液，进样分析。
[0016]标准曲线制作:取浓度为0.01,0.05,0.25,0.50, 2.50, 5.00 μ g/mL的标准工作液，供高效液相色谱分析。分别计算DMZ、DMZOH的峰面积。每个浓度测3次，取其平均值，以横坐标为药物工作液浓度(μ g/mL),纵坐标为峰面积，将各质量浓度与相应的峰面积作为回归分析，得线性方程及相关系数。
[0017]检测限和定量限:DMZ和DMZOH标准溶液最低检测限(LOD)和最低定量限(LOQ)均为 0.01yg/Kg (图 3)
回收率与变异系数:取空白肌肉添加标准工作液，配成药物质量浓度为I μ g/kg、2 μ g/kg的组织样品，每个浓度3个样品，在不同时间重复3次。按1.2.1制样方法处理后进样分析，计算药物回收率和变异系数。
【主权项】
1.一种检测鸡肌肉组织中地美硝唑的高效液相色谱法其特征由下列部分组成: Waters高效液相色谱系统(Waters515泵，Waters2487检测器)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；色谱柱(大连伊利特分析仪器有限公司)；天平(感量0.0OOOlg SHMADZU)；C18固相萃取柱(500 mg, Varian公司)；药物与试剂:地美硝唑(Sig-ma)，羟基地美硝唑(Sig-ma)，甲醇(色谱级)，二氯甲烷、正己烷、乙腈、另算、三乙胺等均为分析纯。2.根据权利要求1所述一种检测鸡肌肉组织中地美硝唑的高效液相色谱法其特征在于C18固相萃取柱(500 mg, Varian公司)，使用前用1mL乙腈和10 mL水淋洗活化。3.根据权利要求2所述一种检测鸡肌肉组织中地美硝唑的高效液相色谱法其特征在于甲醇为色谱级，其它试剂都为分析纯。4.根据权利要求1所述种检测鸡肌肉组织中地美硝唑的高效液相色谱法其特征在于按如下步骤 (1)溶液配制:分别准确称取2种药物标准品各10mg，用甲醇溶解并定容至1mLdS制浓度均为lmg/mL的DMZ和DMZOH储备液，用甲醇稀释储备液得10 μ g/mL的工作液，置于棕色容量瓶中，于20°C避光保存，磷酸三乙胺溶液:1000mL水中加入三乙胺1.0mL，应用磷酸调节PH为3.0 ; (2)设定色谱条件:色谱柱:Hypersil0DS2,5ym,4.6 mmX250 mm ;柱温为室温；流动相为三乙胺溶液(用磷酸调pH值至3.0) -乙腈(94:6);流速lmL/min ;进样量20 μ L ;检测波长320 nm ； (3)样品处理: 提取、净化、标准品处理。
【专利摘要】本发明公开了一种检测鸡肌肉组织中残留的地美硝唑的高效液相色谱分析方法(HPLC)。采用高效液相色谱法测定鸡肌肉中地美硝唑相关残留量。样品经二氯甲烷提取，浓缩，加水和正己烷萃取，固相萃取柱(C18)净化，以三乙胺溶液（用磷酸调PH值至3.0）-乙腈（94:6）作流动相等梯度洗脱，检测波长320mm。本方法的检出限0.01μg/kg，定量限为1μg/kg。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/12
【公开号】CN105572235
【申请号】CN201410533862
【发明人】洪霞, 江振飞, 杜霞
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月12日