电泳分离装置及其使用方法与流程

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2013年3月7日提交的美国临时申请No.61/774,519、2013年3月26日提交的美国临时申请No.61/805,414和2013年8月15日提交的美国临时申请No.61/866,396的优先权，各申请的公开内容以引用的方式并入本文。

关于政府支持

本发明在由美国国立卫生研究院颁发的许可号OD007294以及由美国国家科学基金会授权的许可号1056035下借助政府资助进行。政府享有本发明中的某些权利。

引言

可使用多种分析技术来分离和检测在指定样品中的指定分析物。许多相关免疫印迹方法通过结合生物分子分离和测定能够实现例如DNA(DNA印迹)、RNA(RNA印迹)、蛋白质(蛋白质印迹)和蛋白质-蛋白质相互作用(远端蛋白质印迹(far-western blot))的鉴定和半定量表征。例如，可使用蛋白质印迹来通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质，接着用对靶蛋白质具有特异性的抗体探测来检测样品中的蛋白质。在典型的蛋白质印迹中，使用凝胶电泳来根据三维结构分离天然蛋白质或根据多肽的长度分离变性蛋白质。随后将蛋白质转移到膜(典型地，硝酸纤维素或PVDF)，其中将它们使用对靶蛋白质具有特异性的抗体探测(检测)。

稀有细胞类群的蛋白质组学分析由于在分析样品中极低的细胞浓度而可能具有挑战性。例如，循环肿瘤细胞可以1-10个细胞/毫升血液存在，且可能不适合常规测定(例如，蛋白质印迹和流式细胞术)，为了得到准确的结果，这些测定需要约10⁶个细胞。另外，大细胞类群的分析可遮蔽与平均类群行为不同的亚群。细胞间的可变性可产生不同的结果，且因此个别细胞行为的研究可通过单细胞分析进行。

概述

提供电泳分离装置及其使用方法。本公开的实施方案的方面包括包括具有多个微孔的聚合物分离介质的装置。所述聚合物分离介质包括在施加所施加的刺激后共价结合至所述分离介质中的一种或多种目标样品组分的官能团。

在一些实施方案中，所述装置包括接触所述聚合物分离介质表面的固体载体，其中所述装置包括穿过所述聚合物分离介质和所述固体载体的一个或多个的一部分的至少一个通道。

在一些实施方案中，所述微孔在所述聚合物分离介质中排列成微孔阵列。在一些实施方案中，所述微孔包括在所述聚合物分离介质表面上的开口端和在所述聚合物分离介质中的相对封闭端。

在一些实施方案中，所述聚合物分离介质包括中心孔，所述中心孔具有定位于外周上且与所述中心孔流体连通的多个微孔。在一些实施方案中，每个微孔包括与所述中心孔流体连通的开口端和在所述聚合物分离介质中的相对封闭端。在一些实施方案中，所述微孔基本上围绕所述中心孔的整个外周排列。在一些实施方案中，所述装置包括承载所述聚合物分离介质的固体载体，其中所述装置包括穿过所述聚合物分离介质和所述固体载体的一个或多个的一部分的至少一个通道。

在一些实施方案中，所述聚合物分离介质包含100个或更多个微孔。

在一些实施方案中，所述微孔按尺寸制作以容纳单个细胞。

在一些实施方案中，所述微孔的开口端具有大于所述微孔的封闭端的宽度。

在一些实施方案中，所施加的刺激为光。

本公开的方面还包括一种方法，所述方法包括使样品与具有多个微孔的聚合物分离介质接触，和以足以将所述样品的至少一些组分从所述微孔移动到所述聚合物分离介质的方式向所述聚合物分离介质施加电场，以在所述聚合物分离介质中产生分离的样品组分。在一些实施方案中，所述聚合物分离介质包括在施加所施加的刺激后共价结合至所述分离介质中的一种或多种目标样品组分的官能团。

在一些实施方案中，所述样品包括细胞和/或细胞组分。在一些实施方案中，所述方法包括将所述细胞裂解以在所述样品中产生细胞组分。在一些实施方案中，所述方法包括孵育所述细胞以在所述样品中产生细胞组分。

在一些实施方案中，所述方法包括将所述分离的样品组分固定在所述聚合物分离介质中。

在一些实施方案中，所述方法包括检测所述分离的样品组分。在一些实施方案中，所述检测包括使所述分离的样品组分与分析物检测试剂接触。在一些实施方案中，所述方法包括使所述分离的样品组分与第二分析物检测试剂接触。

在一些实施方案中，所述方法包括使所述聚合物分离介质成像以产生所述分离的细胞组分的图像。

本公开的方面还包括试剂盒。在一些实施方案中，所述方法包括如本文公开的装置和含有所述装置的包装。

附图简述

图1a显示根据本公开的实施方案的单细胞蛋白质(scWestern)印迹测定的图像和图。

图1b显示根据本公开的实施方案的工艺流程示意图，其中开放式凝胶scWestern印迹以4小时多阶段测定进行，该测定包括：细胞沉降、用改良的RIPA缓冲液化学裂解、PAGE(E：电场)、UV蛋白质固定(hv：光子能量)到具有可调谐孔隙度的感光捕获凝胶(PACTgel)上和扩散驱动的抗体探测(例如，一级抗体探针和荧光标记的二级抗体探针，1°Ab和2°Ab*)。

图1c显示根据本公开的实施方案的15μm荧光珠粒的广视野显微照片和在罗丹明-PA凝胶(GEL)中沉降的活的表达EGFP的大鼠神经干细胞(NSC)的共焦显微照片。

图1d显示根据本公开的实施方案的在550μm分离距离下的PAGE解析的5种荧光标记的蛋白质(DRO，dronpa 27kDa；OVA，卵清蛋白45kDa；BSA，牛血清白蛋白66kDa；OVA’，OVA二聚体90kDa；BSA’，BSA二聚体132kDa)的图像。

图1e显示根据本公开的实施方案的来自单个大鼠NSC的EGFP和β-微管蛋白(βTUB)的scWestern分析(RFU：相对荧光单位)。

图2a显示根据本公开的实施方案的神经干细胞(NSC)类群的scWestern印迹的图像。

图2b(顶部右侧)显示根据本公开的实施方案的通过根据每孔细胞数(0’s、1’s、2’s等)分组的4,128个针对βTUB的印迹上由线性荧光强度的轮廓指示的在scWestern阵列上分离性能的均匀性的曲线图。图2b(底部左侧)显示以任意荧光单位(AFU)的在βTUB的轮廓图下的总荧光以及每个孔中细胞数的连续观测值平均值(图2b(左上图)的曲线图；追踪微孔占位率的空间变化和在scWestern阵列上的荧光读数。连续观测值平均值窗口尺寸为30个印迹。孔编号根据微孔区块排序，从阵列的左手侧移动到右手侧。图2b(底部右侧)显示根据细胞数/孔分组且拟合成γ分布的直方图，其说明在细胞分裂存在下mRNA和蛋白质生产的动力学(a1’s＝14.8,a2’s＝23.0,a3’s＝28.6,b1’s＝1.6×105,b2’s＝b3’s＝1.8×105)。

图2c显示根据本公开的实施方案的每孔单个和零细胞的校准的荧光分布曲线图，EGFP印迹在抗体探测在固定NSC中的EGFP(EGFP转染的、+ve和未转染的、-ve、NSC)之后在表达门控和动态范围方面与常规流式细胞术相类似，注：arcsinh-转换标度。

图2d显示根据本公开的实施方案的跨越ERK和βTUB的近似生理学浓度范围(对于细胞内浓度，自文献值校正到在印迹条带中的预期浓度)ERK1、pERK1(Thr202/Tyr204)、βTUB和EGFP纯化标准物的线性直接校准曲线(±SD，n＝3个目标区域/点印迹)。图2d(下图)显示曲线，其中27,000个分子的检测限值通过对于使用直接方法和间接方法得到的EGFP校准曲线的信噪比(SNR)分析指示(n＝3个目标区域/点印迹)。在剥离和使残留荧光信号再成像之后指示间接校准载玻片的有效剥离性能。

图3a显示根据本公开的实施方案的单细胞蛋白质印迹，其捕获成纤维细胞生长因子(FGF)信号途径动力学并通过对分子量门控(gating)使脱靶抗体探测的贡献最小化。图3a(上图)显示，相对于βTUB和EGFP梯(RFU：相对荧光单位)，对于ERK1/2(ERK)和磷酸-ERK1/2(Thr202/Tyr204,pERK)探测的单个大鼠NSC的scWestern印迹的荧光显微照片和线轮廓。图3a(下图)显示MEK1/2和磷酸-MEK1/2(Ser217/Ser221)的类似显微照片。一级抗体印迹使用Alexa Fluor 555-标记的二级抗体(除了EGFP；Alexa Fluor 488-外)按以下顺序探测：pERK、ERK/EGFP辅探针、βTUB、pMEK、MEK；在各次探测之间剥离。

图3b显示根据本公开的实施方案的在pERK的103kDa脱靶条带处的探测对其总荧光信号的贡献的曲线。

图3c显示根据本公开的实施方案的在16小时饥饿之后对于大鼠NSC的20ng/ml FGF刺激而言约30,000个细胞/泳道的常规蛋白质印迹。

图3d显示在用20ng/ml FGF刺激微孔接种的大鼠NSC后特异性pERK和pMEK条带荧光分别作为与总ERK和MEK的比率的倍数改变小提琴图表。根据本公开的实施方案，标注arcsinh-转换标度。曲线与在图3d中自常规蛋白质印迹通过密度测定法确定的相应数据重叠：指示其比度量低于在pERK/pMEK中的技术噪音(technical noise)阈值的来自印迹的数据。***指示P<0.001。

图3e显示根据本公开的实施方案的经由高通量免疫细胞化学得到的互补ERK和MEK磷酸化数据。共同探测细胞的pERK/ERK和pMEK/MEK对；磷酸化靶使用Alexa Fluor 555-标记的二级抗体探测且总靶用Alexa Fluor 647-探测。将pERK、ERK和MEK定位到细胞质，pMEK抗体显示不当的核定位。

图4a显示根据本公开的实施方案的用于在强形态学梯度存在下追踪NSC分化动力学的单细胞蛋白质印迹的图像。图4a(上图)显示在第0天和第6天通过常规免疫细胞化学对于干细胞标志物(巢蛋白，NEST；SOX2)和分化标志物(βIII-微管蛋白，βIIITUB；神经胶质纤丝酸性蛋白，GFAP)探测的在大鼠神经干细胞的混合分化培养物中存在的细胞类型的广视野荧光显微照片。

图4b显示根据本公开的实施方案的接种到scWestern微孔中，如在图4a中固定并染色的NSC的荧光显微照片。重叠亮视野图像以突出显示微孔边缘。

图4c显示根据本公开的实施方案的沉降在罗丹明标记的凝胶(GEL)内的固定并染色的干细胞类型(NEST+、SOX2+)、神经元细胞类型(βIIITUB+)和星形细胞类型(GFAP+)的共焦图像。

图4d显示根据本公开的实施方案的神经干细胞和分化标志物的scWestern印迹的荧光显微照片和线轮廓(RFU：相对荧光单位)。SOX2(Alexa Fluor 555-标记的二级抗体)和巢蛋白(Alexa Fluor 488-)在单独的区块中作为GFAP(Alexa Fluor 555-)和βIIITUB(Alexa Fluor 488-)共同探测；随后将两组区块剥离并针对βTUB(Alexa Fluor 555-)和EGFP(Alexa Fluor 488-)共同探测。来自各天的成组印迹来自相同的分离，除了EGFP印迹来自在阵列的与对应组同一排中的分离。

图4e显示根据本公开的实施方案在第0天分化和第6天分化对于标志物约30,000个细胞/泳道的常规蛋白质印迹。

图4f显示在6天分化实验中由βTUB印迹荧光标准化的干细胞和分化标志物总scWestern印迹荧光的图表。根据本公开的实施方案，标注arcsinh-转换标度。

图5(上图)显示根据本公开的实施方案的光活化的二苯甲酮官能化的聚丙烯酰胺凝胶，其中在二苯甲酮甲基丙烯酰胺(BPMA)单体的羰基官能团和靶多肽之间的共价结合反应可在施加刺激后发生。图5(下图)显示根据本公开的实施方案的在二苯甲酮甲基丙烯酰胺(BPMA)单体的羰基官能团和靶多肽之间的光活化共价结合反应的反应方案的分子模型。

图6显示根据本公开的实施方案的免疫印迹工艺流程。

图7显示根据本公开的实施方案的凝胶捕获的纯化蛋白质分离的凝胶内探测的图像。

图8a和图8b显示根据本公开的实施方案在实施例2的单细胞免疫印迹校准中对于纯化EGFP的直接和间接校准程序。图8a和图8b显示在单细胞免疫印迹测定中用于确定动态范围和检测限值的两种校准方法的草图。在图8a中，直接校准通过在分离和捕获之前计数在微孔中的EGFP分子来进行。在图8b中，间接校准通过自在单独的实验中构建的分配曲线(参见图9a-c)推断EGFP分子的数目来进行，在所述单独实验中，微孔和凝胶EGFP浓度从在平衡状态下取得的荧光值推断。

图9a显示经由K＝([EGFP]凝胶-[EGFP]凝胶,bg)/([EGFP]孔-[EGFP]孔,bg)对于在用在改性的RIPA缓冲液中的稀释系列的EGFP孵育的8％T凝胶片材中的微孔区块确定的EGFP的分配曲线，其中[EGFP]凝胶和[EGFP]孔为根据本公开的实施方案的通过在30μm深的单独微通道中的荧光校准确定的处于平衡状态的EGFP的凝胶内和孔内浓度。在用EGFP溶液孵育之前，[EGFP]凝胶,bg和[EGFP]孔,bg针对scWestern载玻片的本底荧光校正。

图9b显示除了“IgG”外如在(图9a)中确定的几种Alexa Fluor 568-标记的蛋白质的分配系数，IgG用于Alexa Fluor 647-标记的驴抗兔IgG；n用于在对于各靶的单次实验中的单独微孔。

图9c显示在来自用在改良的RIPA缓冲液中的1μM dronpa孵育30分钟的8％T scWestern凝胶片材中的盖片封闭的50μm直径的微孔的荧光蛋白质dronpa的重复注入。dronpa分配到微孔中允许相对于本底凝胶浓度的dronpa重复注入。

图10a和图10b显示用于在图2d中的校准曲线的直接和间接校准载玻片。图10a(左上图)显示来自用一定范围的纯化EGFP浓度孵育、用盖玻片封闭且使用广视野荧光显微术对于固有EGFP荧光成像的区块的微孔亚组的对数转换的画面组合(montage)。图10a(右上图)显示对于EGFP(Alexa Fluor 555-标记的二级抗体)在分离、捕获并探测同一载玻片之后的对数转换的探针荧光。图10a(右下图)显示用以确定在微孔中EGFP的分子数目的单独微流体通道中的EGFP的校准曲线(AFU：任意荧光单位；ROI：目标区域)。图10a(左下图)显示在EGFP浓度范围的例示性微孔和免疫印迹。图10b显示在调整分布(图9b)、斑点暴露于UV并探测EGFP(Alexa Fluor 555-标记的二级抗体)之后实现所指示的凝胶内浓度的用纯化EGFP浓度孵育的scWestern载玻片。随后将载玻片剥离并在相同扫描器设置下再成像。图10c和图10d显示用于纯化的β-微管蛋白(Alexa Fluor 647-标记的二级抗体)和ERK1/pERK1(两者Alexa Fluor555-标记的二级抗体；在pERK和ERK探测之间剥离的载玻片)的类似的间接校准载玻片。

图11a显示在倾注到scWestern电泳槽中期间通过颗粒成像速度测量法测量的本体缓冲液速度的图。对于上下文还显示裂解时间(±SD，n＝6个细胞)。在平均裂解时间附近的最大本体速度为0.013ms^-1并将其用于在图11b-11e中的流体流动模拟。图11b-11d显示在以0.013ms^-1的本体流体速度倾注水在30μm厚scWestern凝胶膜中的20μm直径的微孔上期间的单向稳态层流的COMSOL模型。注意在与通过流线跟踪的本体流动方向平行的孔中存在涡流表示无质量移动，不能漂浮的颗粒从在5μm、10μm、15μm、20μm和25μm处的起始位置进入孔中。在孔表面上的流动边界条件为“无滑移”。图11e显示模型速度分布的垂直于流动方向的中线部分；u＝4.4μm s^-1等速曲线限定其中在细胞裂解作用期间质量输送以扩散(Pe<1)或平流占主导(Pe>1)的孔的区域。

图12显示根据本公开的实施方案对于大鼠神经干细胞的每孔细胞计数的图。将大鼠神经干细胞沉降到2,240个标称尺寸为20μm直径和30μm深度的scWestern微孔中持续5分钟并从亮视野显微照片中手动计数在原始悬浮液中的三种细胞密度。每孔单个细胞占位率在40-50％范围内，fano因子(σ²/μ)为0.55-0.75，指示偏离泊松(Poissonian)接种分布，这可能归因于超过每孔4个细胞的约束性接种。

图13显示根据本公开的实施方案的在scWestern凝胶膜上抗体输送动力学的图。残留的载玻片荧光通过荧光显微术在用在游离溶液中的100nM Alexa Fluor 568-标记的抗卵清蛋白孵育30分钟之后对于80μm厚凝胶层的TBST洗涤液确定。与scWestern凝胶层的抗体平衡的时间常数T＝4.8分钟为拟合指数的倒数。

图14a和图14b显示根据本公开的实施方案的荧光标记的蛋白质在scWestern凝胶片材中的分离性质的图。图14a显示对于在图1d中的荧光标记的物质而言物质分子量相对于在8％T scWestern凝胶中的迁移距离的对数线性图表(x轴误差条在点尺寸内(±SD，n＝3次分离)；Dronpa,27kDa；OVA,45kDa；BSA,66kDa；OVA’,90kDa；BSA’,132kDa)。图14b显示假设一致蛋白质条带宽度(SDσi)的图，分离解析度Rs＝|x1–x2|/(2σ1+2σ2)的图表，其中xi为迁移距离，在条带对之间，预期与其分子量的对数比为线性的。显示这些数据的线性拟合，从而在替换Rs＝1时对于从scWestern微孔中分离的纯化蛋白质产生51±1.6％(±SD，n＝3次分离)的可分离分子量差。

图15显示根据本公开的实施方案的单细胞蛋白质印迹载玻片的剥离和再探测的图像。将来自图2d的“直接”EGFP校准载玻片成像、剥离并仅用Alexa Fluor 555-标记的二级抗体(阴性对照)再探测或用EGFP的一级抗体和Alexa Fluor 555-标记的二级抗体再探测。例示性再探测印迹的信噪比(SNR)大致匹配原始探测的信噪比，虽然例示性阴性对照印迹显示可忽略的特异性信号。

图16显示根据本公开的实施方案的根据细胞数/孔排列的在图2中提供的印迹的随机样本的图像。所有印迹都通过了对于粉尘和其它荧光伪假象的半自动化筛选。

图17显示根据本公开的实施方案的抗体倍数稀释对大鼠NSC的β-微管蛋白荧光读出信号的影响的图。图17显示在60×和10×之间的抗β-微管蛋白一级抗体和Alexa Fluor 555-标记的二级抗体稀释下大鼠NSC的单细胞蛋白质印迹。在稀释范围上对于每孔1和2个细胞印迹观察到高于每孔零细胞对照的绝对荧光信号增益。

图18显示根据本公开的实施方案的在图2d中的间接校准曲线的SNR的图表。在图2d中的间接校准曲线的信噪比设定在SNR＝3下对于各种纯化靶的检测浓度限值。

图19显示根据本公开的实施方案的在图3d中提供的印迹的随机样品。所有显微照片都属于同一组分离。所有印迹都属于每孔单个细胞装置，通过对于粉尘及其它荧光伪假象和对于来自用ERK共同探测EGFP的光谱渗透的半自动化筛选。独特条带在如下推断分子量下观察到：38.8±1.0kDa(pERK)、39.1±0.6kDa(ERK)、47.4±1.1kDa(pMEK)和48.1±1.8kDa(MEK；±SD,n＝3次分离)；标称质量pERK/ERK：43kDa，pMEK/MEK：46kDa。

图20显示根据本公开的实施方案的在图3中的FGF刺激实验的所有时间点上在103kDa下的假定脱靶pERK条带的总单细胞印迹荧光相对于在39kDa pERK条带处的特异性荧光的图表。

图21显示根据本公开的实施方案的显示在约58kDa和约71kDa下的假定非特异性pERK条带的pERK和ERK的过暴露蛋白质印迹的图像。

图22显示根据本公开的实施方案的对于在图3c中的刺激实验的完整蛋白质印迹的图像。

图23a和图23b显示pERK:ERK和pMEK:MEK的分布统计的图和对于在图3d中的scWestern印迹数据在FGF刺激时程上β-微管蛋白、ERK和MEK的倍数改变点图表。图23a显示在刺激时程上pERK:ERK和pMEK:MEK分布的偏斜值和平均值之间的关系的图。注意CV和偏斜值分别为百分比和无量纲单位，为了方便起见作为倍数荧光比率数据以相同标度绘制。图23b显示在各刺激时间下在细胞类群中显示出很少变化的β-微管蛋白、ERK和MEK的任意荧光(线性单位)的倍数改变的图。

图24显示补充对于在图3e中在培养板中FGF刺激NSC的scWestern印迹数据的ICC研究的完整数据的图。对于pERK/ERK和pMEK/MEK对共同探测细胞；磷酸化靶使用Alexa Fluor 555-标记的二级抗体探测且总靶用Alexa Fluor 647-探测。探测的pMEK/MEK的数据单独地提供在图25中。在图3e中提供的特异性拷贝示于方框中。平均pMEK:MEK比率在3次重复实验中不超过2；平均ERK和MEK值在刺激时程中显示很少的变化。

图25显示在图3e中ICC研究的单探针pMEK/MEK分布的图。pMEK和MEK靶在单独的细胞中探测以检验在共同探测实验中抗体(Cy3-标记的二级抗体)之间表位竞争的可能性。没有发现竞争的证据，因为平均pMEK倍数改变值与在图24中的平均pMEK:MEK值在类似范围内。

图26显示如通过对于在图3e中的FGF刺激实验pERK和ERK靶的培养板ICC荧光显微照片的自动分析确定的随机选择的单细胞ROI的实施例。实验细节，参见图24。

图27显示如通过对于在图3e中的FGF刺激实验pMEK和MEK靶的培养板ICC荧光显微照片的自动分析确定的随机选择的单细胞ROI的实施例。实验细节，参见图24。注意一级抗体不当核定位到pMEK；二级抗体对照没有引起该明显定位。

图28显示在图4f中提供的单细胞印迹的随机样本。β-微管蛋白显微照片匹配在管柱内双色显微照片的分离。所有印迹都属于每孔单个细胞装置，通过了对于粉尘及其它荧光伪假象的半自动化筛选且筛选来自用β-微管蛋白共同探测EGFP的光谱渗透。

图29显示在图4e中的分化实验的完整蛋白质印迹的图像。

图30显示图4f的完整干细胞和分化标志物表达数据的图。

图31显示来自图4f中的scWestern印迹数据的平均β-微管蛋白标准化标志物表达水平的图。

图32显示根据本公开的实施方案的分离装置。

图33显示捕获在根据本公开的实施方案的装置的微孔中的细胞的图像。

图34，画面A-D，显示使用根据本公开的实施方案的装置进行细胞测定的工艺流程的示意图。图34，画面A，显示将细胞注入中心腔室中。图34，画面B，显示装置在竖式旋转器中旋转以将细胞定位到捕获器中。图34，画面C，显示将组合裂解-电泳缓冲液注入腔室中。在电泳期间的静电流动将缓冲液移动到细胞以便裂解。图34，画面D，显示将蛋白质分离并在UV暴露下固定，并使用标记的抗体来确定目标蛋白质。

图35显示根据本公开的实施方案的在各种RPM下珠粒捕获率的图。在1000、2000、3000和4000RPM下旋转的珠粒的平均捕获率分别为13％、57％、89％和90％。在4000RPM下的相对离心力为约112g。(n＝2)

图36A和图36B显示根据本公开的实施方案的蛋白质移动穿过聚丙烯酰胺凝胶(PAG)的图像。图36A显示当暴露于低电场(50V)时最初聚积在孔中的绿色荧光蛋白质(GFP)的图像。图36B显示GFP的图像，其已经在较高电压(200V)下移动穿过PAG以有助于蛋白质分离。

详述

提供电泳分离装置及其使用方法。本公开的实施方案的方面包括包括具有多个微孔的聚合物分离介质的装置。所述聚合物分离介质包括在施加所施加的刺激时共价结合在分离介质中的一种或多种目标样品组分的官能团。

下文中，首先更详细地描述本发明电泳分离装置。还公开了检测在样品中的分析物的方法，其中使用本发明装置。另外，还描述了包括本发明装置的系统和试剂盒。

装置

本公开的实施方案包括分离装置。在某些实施方案中，所述分离装置被构造成分离样品中的分析物。例如，分离装置可被构造成基于分析物的一种或多种物理和/或化学性质分离样品中的分析物。在一些情况下，所述分析物可包括在其分子量、尺寸、电荷(例如，质荷比)、等电点、亲和相互作用等方面的可检测的差异。本公开的分离装置可被构造成基于不同分析物的分子量、尺寸、电荷(例如，质荷比)、等电点、亲和相互作用等使不同分析物彼此区分。

在某些实施方案中，所述分离装置为微流体分离装置。“微流体装置”是被配置成控制并处置流体在几何学上限定于小标度(例如，亚毫米)的装置。所述微流体装置的实施方案包括聚合物介质，例如如在本文中更详细描述的聚合物分离介质。所述聚合物介质可包括特异性结合样品中的目标分析物的共价结合的捕获成员。

在某些实施方案中，所述分离装置包括固体载体。所述固体载体可被构造成支撑聚合物介质(例如，聚合物分离介质)。例如，聚合物分离介质可提供在固体载体上，使得聚合物分离介质的至少一部分与固体载体的表面接触(例如，所述装置包括承载聚合物介质的固体载体)。在一些情况下，固体载体由相对于在本发明装置和方法中使用的样品、缓冲液、试剂等呈惰性(例如，不降解或反应)的材料构成。例如，固体载体可由例如但不限于玻璃、石英、聚合物、弹性材料、纸、其组合等的材料制成。在某些实施方案中，固体载体基本上为透明的。“透明”意指一种物质允许可见光穿过该物质。在一些实施方案中，透明固体载体有助于检测与聚合物介质结合的分析物，例如包括例如荧光标记的可检测标记、产生该可检测标记或用该可检测标记标记的分析物。在一些情况下，该固体载体基本上为不透明的。“不透明”意指一种物质基本上阻挡可见光穿过该物质。在某些情况下，不透明固体载体可有助于分析对光敏感的分析物，例如在光存在下反应或降解的分析物。

在某些实施方案中，所述固体载体按尺寸制作以容纳聚合物分离介质。例如，固体载体可具有使得整个聚合物分离介质都由固体载体支撑的尺寸(例如，长度和宽度)。在一些情况下，固体载体可具有大于聚合物分离介质的尺寸(例如，长度和宽度)。在一些情况下，固体载体具有在10mm x 10mm至200mm x 200mm范围内的尺寸，包括100mm x 100mm或更小，诸如50mm x 50mm或更小，例如25mm x 25mm或更小，或10mm x 10mm或更小，或5mm x 5mm或更小，例如1mm x 1mm或更小的尺寸。在一些情况下，固体载体具有0.5mm-5mm、或1mm-4毫米、或1mm-3mm、或1mm-2mm的厚度。在某些情况下，固体载体具有1mm的厚度。

如上所述，固体载体可被构造成支撑聚合物分离介质。聚合物分离介质的方面在下文更详细地描述。

聚合物分离介质

所述聚合物分离介质可被构造成使样品的成分彼此分离。在一些情况下，分离介质被构造成基于在样品中的成分的物理性质分离所述成分。例如，分离介质可被构造成基于在样品中的成分的分子量、尺寸、电荷(例如，荷质比)、等电点、亲和相互作用等分离这些成分。

在某些情况下，分离介质被构造成基于在样品中的成分的尺寸和电荷分离这些成分。分离介质可被构造成将在样品中的成分分离成成分的不同可检测条带。“条带”意指独特的可检测区域，其中成分的浓度显著高于周围区域。各个成分条带可包含单一成分或若干成分，其中如上所述，在单个成分条带中的各种成分具有基本上类似的物理性质。

在某些实施方案中，所述分离介质被构造成在样品穿过分离介质时分离在样品中的成分。在一些情况下，分离介质构被造成在样品流经分离介质时分离在样品中的成分。分离介质的方面包括分离介质具有一个定向分离轴，或在其它情况下，多个定向分离轴，如在下文更详细地描述。在一些情况下，定向分离轴在样品穿过分离介质时在样品行进的方向中定向。

具有平面阵列的微孔的聚合物分离介质

在某些实施方案中，所述聚合物分离介质包括平面阵列的微孔。在这些实施方案中，所述定向分离轴与分离介质的长度(或宽度)对准。例如，定向分离轴可与分离介质的长度(或宽度)基本上平行。在一些实施方案中，所述分离介质为正方形或矩形的且分离介质的定向轴可与分离介质的长度(或宽度)对准。在这些实施方案中，所述样品沿分离介质的长度(或宽度)穿过分离介质。在一些情况下，在样品穿过分离介质的长度的情况下，分离介质的长度大于分离介质的宽度，如为分离介质的宽度的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍或200倍或更多倍。在一些情况下，较长的分离轴可有助于在样品中的不同分析物的条带之间解析度增加。

在某些实施方案中，所述分离介质包括在分离介质中的多个微孔。在一些情况下，分离介质包括在分离介质中的基本上平面阵列的微孔。“成阵列的微孔”包括任何二维或基本二维排列的微孔。例如，平面阵列的微孔可排列成成行和成列的微孔。在平面阵列微孔中的微孔可单独地寻址。当阵列包括定位在阵列中的特定预定位置(例如，“寻址”)处的多个微孔时，微孔为“可寻址的”。微孔可通过插入空间分离。平面阵列的微孔可包括在聚合物分离介质中的一个或多个，包括两个或更多个、4个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、750个或更多个、1000个或更多个、1500个或更多个、2000个或更多个、2500个或更多个、3000个或更多个、3500个或更多个、4000个或更多个、4500个或更多个、5000个或更多个、5500个或更多个、6000个或更多个、6500个或更多个、7000个或更多个、7500个或更多个、8000个或更多个、8500个或更多个、9000个或更多个、9500个或更多个、10,000个或更多个、或25,000个或更多个、或50,000个或更多个、或75,000个或更多个、或100,000或更多个微孔。在一些情况下，平面阵列的微孔可包括5000个或更多个微孔。各种聚合物分离介质可包括一个或多个阵列的微孔，例如1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、14个或更多个、16个或更多个、18个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个、45个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、或100或更多个阵列的微孔。在一些实施方案中，所述聚合物分离介质包括10个或更多个阵列的微孔。根据用途，任何或所有微孔均可彼此相同或不同并且各自可被构造成含有不同的样品或样品成分。个别微孔的方面在下文更详细地描述，但可应用到在成阵列的微孔中的任何或所有微孔。

在某些实施方案中，所述聚合物分离介质包括如上所述的平面阵列的微孔。平面阵列的微孔可被排列成使得每个微孔具有提供在分离介质的表面上(例如，在分离介质的顶部表面上)的开口端。在这些实施方案中，各微孔的内部体积可从在聚合物分离介质的表面上的微孔的开口端延伸到聚合物分离介质中。在某些实施方案中，微孔的开口端(且因此微孔的内部体积)与提供在分离介质的表面上的流体(例如，缓冲液、样品等)流体连通。在一些情况下，微孔的底部(即，封闭端)通过支撑聚合物分离介质的固体载体形成，例如，在如下实施方案中，其中微孔的内部体积延伸全程穿过分离介质，例如其中微孔的深度等于聚合物分离介质的厚度。在其它情况下，微孔的底部(即，封闭端)通过聚合物分离介质形成，例如，在如下实施方案中，其中微孔的内部体积没有延伸全程穿过分离介质，例如其中微孔的深度小于聚合物分离介质的厚度。

在某些实施方案中，微孔被构造成使得微孔的从微孔的封闭端到开口端的轴基本上垂直于分离介质的表面(例如，分离介质的具有微孔的开口端的表面)。在某些实施方案中，微孔的壁(例如，侧壁)由聚合物分离介质形成，例如，其中微孔的内部体积延伸到聚合物分离介质中并被聚合物分离介质包围。

在聚合物分离介质中的平面阵列的微孔的实例示于图1a中，其为承载包括16阵列的420个微孔/阵列(总共6,720个微孔)的聚合物分离介质的固体载体的图像。在图1a中示出的聚合物分离介质使用包括微柱区块的模具形成。如在以下实施例1中更详细地描述，从聚合物分离介质除去微柱模具产生具有如所示的成阵列的微孔的聚合物分离介质。

具有环形排列的微孔的聚合物分离介质

在其它实施方案中，不是排列为平面阵列的微孔，分离介质包括环形排列的微孔。例如，分离介质可包括具有多个径向定向分离轴的环形排列的微孔。在环形排列的微孔中的各微孔可与其自己的径向定向分离轴相关。在这些实施方案中，径向分离轴可排列成使得样品沿径向远离中心孔延伸穿过分离介质的方向从在分离介质中的中心孔朝向分离介质的外周穿过分离介质。

例如，在某些实施方案中，所述装置包括具有中心孔的聚合物分离介质。在一些情况下，中心孔定位在聚合物分离介质中，使得中心孔在聚合物分离介质中形成孔隙。在某些实施方案中，中心孔的外周孔由聚合物分离介质形成。例如，聚合物分离介质可包括孔隙，其中包围孔隙的聚合物分离介质形成中心孔的外周壁。在一些情况下，中心孔基本上为环形的。在一些情况下，分离介质被构造成使得样品置于分离介质的中心孔中。

在某些实施方案中，所述聚合物分离介质的中心孔包括定位在外周上且与中心孔流体连通的多个微孔。与中心孔流体连通的微孔可具有面对中心孔的内部体积的开口端，使得流体及其成分可从中心孔的内部体积流到微孔的内部体积，反之亦然。在一些实施方案中，各微孔具有与微孔的开口端相对的封闭端。在某些情况下，微孔的封闭端通过周围聚合物分离介质形成。在某些情况下，微孔与中心孔共平面。例如，微孔可被构造成使得微孔的从微孔的封闭端到开口端的轴与中心孔的横向(即，水平)半径共平面(例如，与在车轮中的辐条类似)。因而，微孔可具有与聚合物分离介质共平面的微孔的从微孔的封闭端到开口端的轴。

在某些实施方案中，如上所述，所述微孔大致围绕中心孔的外周排列。在一些情况下，微孔围绕中心孔的基本上整个外周排列。在某些实施方案中，微孔围绕中心孔的一部分外周、例如中心孔的90％的外周、或中心孔的80％、或70％、或60％、或50％、或40％、或30％、或20％或10％的外周排列。在一些情况下，包括微孔的中心孔的外周表面包括多个微孔，例如25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、150个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、600个或更多个、700个或更多个、800个或更多个、900个或更多个、1000个或更多个、1250个或更多个、1500个或更多个、1750个或更多个、2000个或更多个、2500个或更多个、3000个或更多个、3500个或更多个、4000个或更多个、4500个或更多个、或5000或更多个微孔。

在一些实施方案中，微孔与邻近微孔分隔某一距离。例如，微孔可与邻近微孔分隔500μm或更小、例如450μm或更小、或400μm或更小、或350μm或更小、或300μm或更小、或250μm或更小、或200μm或更小、或150μm或更小、或100μm或更小、例如90μm或更小、或80μm或更小、或70μm或更小、或60μm或更小、或50μm或更小、或40μm或更小、或30μm或更小、或20μm或更小、或10μm或更小的距离。在一些情况下，微孔可与邻近孔分隔10μm-100μm、例如10μm-90μm、或10μm-80μm、或10μm-70μm、或10μm-60μm、或20μm-60μm、或30μm-60μm、或40μm-60μm的距离。

在某些实施方案中，所述装置包括外罩。在一些情况下，所述外罩可布置在聚合物分离介质上，使得聚合物分离介质定位在载体和外罩之间。在某些实施方案中，外罩包括被构造成与中心孔流体连通的储集孔。例如，储集孔可具有与中心孔的内部体积流体连通的内部体积。在一些情况下，储集孔在聚合物介质中在外罩的表面(例如，外罩的底部表面)上形成。在一些情况下，储集孔定位在聚合物介质中，使得储集孔在聚合物介质中形成孔隙。在某些实施方案中，储集孔的外周壁由聚合物分离介质形成。例如，聚合物介质可包括孔隙，其中包围孔隙的聚合物介质形成储集孔的外周壁。在一些情况下，储集孔基本上为环形的。

在某些实施方案中，形成储集孔的聚合物介质布置在外罩上。因而，储集孔的顶部可由外罩的表面(例如，外罩的底部表面)形成。在一些情况下，储集孔的外周壁从外罩的底部表面基本上垂直向下延伸。外罩的实施方案可由与本发明装置相容并且与在本发明装置中使用的样品、缓冲液、试剂等相容的任何合适材料制成。在一些情况下，外罩由相对于在本发明装置和方法中使用的样品、缓冲液、试剂等呈惰性(例如，不降解或反应)的材料制成。例如，外罩可由例如但不限于玻璃、石英、聚合物、弹性材料、纸、其组合等的材料制成。在某些实施方案中，储集孔不包括在储集孔的外周上的微孔。

在某些实施方案中，储集孔的直径小于中心孔的直径。在一些情况下，中心孔的直径为50mm或更小，例如40mm或更小、或30mm或更小、或20mm或更小、或15mm或更小、或10mm或更小。在某些情况下，中心孔的直径为12mm。在一些情况下，储集孔的直径为40mm或更小，例如30mm或更小、或20mm或更小、或15mm或更小、或10mm或更小、或5mm或更小。在某些情况下，储集孔的直径为8mm。

在某些实施方案中，所述装置包括固体载体，所述固体载体具有具有中心孔的聚合物分离介质；和外罩，所述外罩具有具有如上所述的储集孔的聚合物介质。所述装置可被构造成使得外罩施加到固体载体使得固体载体的聚合物分离介质和外罩的聚合物介质彼此接触。在这些情况下，中心孔和储集孔可彼此流体连通，使得它们形成包括中心孔和储集孔两者的内部体积的封闭空间。在一些情况下，外罩可包括与储集孔流体连通(且因此与中心孔流体连通)的流体入口。

包括环形排列的微孔的聚合物分离介质的实例示于图32中，其为包括承载具有中心(下图)孔的聚合物分离介质(例如，聚丙烯酰胺凝胶，PAG)的固体载体和包括具有储集(上图)孔的聚合物介质(例如，聚丙烯酰胺凝胶，PAG)的外罩的装置的图像。储集孔包括与储集孔流体连通(且因此也与中心孔流体连通)的溶液入口。中心孔包括围绕中心孔的外周排列的微孔(图33)。

微孔的另外方面

在某些实施方案中，微孔具有具有限定形状的内部体积。例如，微孔的内部体积可具有圆柱体、立方体、矩形长方体、截头锥体(例如，正方形截头锥体、矩形截头锥体、锥形截头锥体等)等的形状。

在某些实施方案中，所述微孔的开口端具有大于所述微孔的封闭端的尺寸。例如，微孔的开口端可具有是微孔的封闭端的尺寸的1.1倍，例如微孔的封闭端的尺寸的1.2倍、或1.3倍、或1.4倍、或1.5倍、或1.6倍、或1.7倍、或1.8倍、或1.9倍、或2倍的尺寸(例如，根据微孔的形状，宽度和/或长度，或直径)。

“微孔”为具有微米标度的尺寸的孔。虽然尺寸可以变化，但在一些情况下，微孔的开口端具有100μm或更小，例如90μm或更小、或80μm或更小、或70μm或更小、或60μm或更小、或50μm或更小、或40μm或更小、或30μm或更小、或20μm或更小、或10μm或更小的宽度。例如，微孔的开口端可具有10μm-100μm、例如10μm-90μm、或10μm-80μm、或10μm-70μm、或10μm-60μm、或10μm-50μm、或10μm-40μm、或10μm-30μm的宽度。在某些实施方案中，微孔可具有按尺寸制作以在微孔中容纳单个细胞的开口端。

在一些情况下，微孔的封闭端具有100μm或更小、例如90μm或更小、或80μm或更小、或70μm或更小、或60μm或更小、或50μm或更小、或40μm或更小、或30μm或更小、或20μm或更小、或10μm或更小的宽度。例如，微孔的封闭端可具有10μm-100μm、例如10μm-90μm、或10μm-80μm、或10μm-70μm、或10μm-60μm、或10μm-50μm、或10μm-40μm、或10μm-30μm、或10μm-20μm的宽度。在某些实施方案中，微孔可具有按尺寸制作以在微孔中容纳单个细胞的封闭端。

在某些实施方案中，微孔具有100μm或更小、例如90μm或更小、或80μm或更小、或70μm或更小、或60μm或更小、或50μm或更小、或40μm或更小、或30μm或更小、或20μm或更小、或10μm或更小的深度(例如，从微孔的开口端到封闭端的距离)。例如，微孔可具有10μm-100μm、例如10μm-90μm、或10μm-80μm、或10μm-70μm、或10μm-60μm、或20μm-60μm、或30μm-60μm、或40μm-60μm的深度。在某些实施方案中，微孔可具有按尺寸制作以在微孔中容纳单个细胞的深度。

在聚合物分离介质中的微孔可为基本上均匀的。例如，在分离介质中的微孔的形状和尺寸可为基本上均匀的。在其它实施方案中，微孔可不同，例如具有不同的形状、不同的尺寸、其组合等。包括不同微孔的分离介质可有助于同时分析不同的样品成分。例如，具有不同形状和/或尺寸的微孔可优选捕获不同形状或尺寸的样品组分(例如，在样品中的不同形状或尺寸的细胞)。

分离介质的另外方面

在某些实施方案中，所述分离介质包括聚合物，例如聚合物凝胶。所述聚合物凝胶可为适合凝胶电泳的凝胶。聚合物凝胶可包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶(例如，甲基丙烯酰胺凝胶)、琼脂糖凝胶等。分离介质的解析可取决于多种因素，例如但不限于孔径、总聚合物含量(例如，总丙烯酰胺含量)、交联剂浓度、施加的电场、测定时间等。例如，分离介质的解析度可取决于分离介质的孔径。在一些情况下，孔径取决于分离介质的总聚合物含量和/或在分离介质中交联剂的浓度。在某些情况下，分离介质被构造成解析具有50,000Da或更小、或25,000Da或更小、或10,000Da或更小、例如7,000Da或更小，包括5,000Da或更小、或2,000Da或更小、或1,000Da或更小，例如500Da或更小、或100Da或更小的分子量差的分析物。在一些情况下，分离介质可包括聚丙烯酰胺凝胶，其具有1％-20％、例如3％-15％、包括5％-10％的总丙烯酰胺含量T(T＝丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体的总浓度，％w/v)。在一些情况下，分离介质具有7％的总丙烯酰胺含量。在某些情况下，分离介质具有6％的总丙烯酰胺含量。在某些实施方案中，分离介质包括具有1％-10％、例如2％-7％，包括2％-5％的交联剂含量C(％w/v)的聚丙烯酰胺凝胶。在一些情况下，分离介质具有3％的总丙烯酰胺含量。

在某些实施方案中，分离介质被构造为由前体部分形成。例如，分离介质可为由凝胶前体(例如，聚丙烯酰胺凝胶前体，如聚丙烯酰胺凝胶单体)形成的凝胶(例如，聚丙烯酰胺凝胶)。所述前体部分可被构造为反应形成分离介质。例如，凝胶前体可被构造为彼此反应以形成聚丙烯酰胺凝胶分离介质。在凝胶前体之间的反应可通过例如但不限于化学活化、光活化等任何合适的方案活化。在一些实施方案中，凝胶前体被构造成例如通过使凝胶前体与例如但不限于过氧化物的活化剂接触化学活化。在一些实施方案中，凝胶前体被构造为例如通过使凝胶前体与光接触来通过光活化(即，光活化)。光可具有适合活化分离介质的形成的任何波长，且在一些情况下可具有与在可见光谱中的蓝光相关的波长。例如，用于活化分离介质的形成的光可具有400nm-500nm、例如410nm-490nm、包括420nm-480nm、或430nm-480nm、或440nm-480nm、或450nm-480nm、或460nm-480nm、或465nm-475nm的波长。在某些情况下，用于活化分离介质的形成的光具有465nm-475nm的波长。在一些情况下，用于活化分离介质的形成的光具有470nm的波长。

在一些情况下，分离介质具有10mm x 10mm-200mm x 200mm的尺寸，包括100mm x 100mm或更小，例如50mm x 50mm或更小，例如25mm x 25mm或更小，或10mm x 10mm或更小，或5mm x 5mm或更小，例如1mm x 1mm或更小的尺寸。在一些情况下，分离介质具有1μm-100μm、例如10μm-75μm、或10μm-50μm、或20μm-50μm的厚度。在一些情况下，分离介质具有30μm的厚度。

在某些实施方案中，所述分离介质包括缓冲液。所述缓冲液可为用于凝胶电泳的任何常规缓冲液。在某些实施方案中，所述缓冲液为Tris缓冲液。在某些实施方案中，所述分离介质包括缓冲液，例如Tris-甘氨酸缓冲液。例如，缓冲液可包括Tris和甘氨酸的混合物。

在一些情况下，缓冲液包括洗涤剂。在某些情况下，洗涤剂被构造成在样品中提供具有基本上类似的荷质比的分析物。具有基本上类似的荷质比的分析物可有助于基于在样品中的分析物的分子量将分析物分离到在分离介质中的一个或多个条带中。在某些情况下，洗涤剂为被构造成在样品中提供具有例如负电荷的电荷的分析物的阴离子洗涤剂。例如，洗涤剂可为阴离子洗涤剂，例如但不限于十二烷基硫酸钠(SDS)。

在某些实施方案中，分离介质被构造成基于成分的等电点(pI)(例如，等电聚焦，IEF)分离在样品中的成分。在一些情况下，分离介质包括如上所述的聚合物凝胶。例如，聚合物凝胶可包括聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。在某些情况下，聚合物凝胶包括pH梯度，在一些实施方案中，其与聚合物凝胶共聚合。在其中pH梯度与聚合物凝胶共聚合的实施方案中，pH梯度可为基本上固定的，产生具有固定的pH梯度的分离介质。在某些情况下，pH梯度包括弱酸或弱碱(例如，固定化电解质)、两性电解质等。

在某些实施方案中，分离介质被构造成基于尺寸分离在样品中的成分。例如，在一些情况下，分离介质包括具有孔径梯度的聚合物凝胶。孔径梯度可沿着分离介质的定向轴减小。例如，孔径梯度可具有沿着分离介质的定向轴减小的孔径，使得穿过分离介质的样品在分离介质中遇到逐渐变小的孔径。当在样品中的成分穿过孔径梯度时，在样品中的成分可基于尺寸分离。例如，在样品中的较大成分可比较小成分更容易保留在分离介质中，其能够通过减小的孔径梯度穿过更大的距离。

在一些情况下，分离介质的孔径取决于分离介质的总聚合物含量和/或在分离介质中的交联剂的浓度。在某些情况下，分离介质孔径足以解析具有50,000Da或更小、或25,000Da或更小、或10,000Da或更小、例如7,000Da或更小、包括5,000Da或更小、或2,000Da或更小、或1,000Da或更小、例如500Da或更小、或100Da或更小的分子量差的分析物。在一些情况下，分离介质可包括聚丙烯酰胺凝胶，其具有取决于总丙烯酰胺含量T(T＝丙烯酰胺和双丙烯酰胺单体的总浓度)的孔径，其中总丙烯酰胺含量T为1％-20％、例如3％-15％、包括5％-10％。在一些情况下，分离介质具有由7％的总丙烯酰胺含量限定的孔径。在某些情况下，分离介质具有由6％的总丙烯酰胺含量限定的孔径。在某些实施方案中，分离介质包括具有1％-10％、例如2％-7％、包括2％-5％的交联剂含量C(％w/v)的聚丙烯酰胺凝胶。在一些情况下，分离介质具有3％的总交联剂含量。

在某些实施方案中，分离介质被构造成共价粘合目标成分。共价键可在施加所施加的刺激时形成。例如，所施加的刺激可包括电磁辐射，例如光。在一些情况下，光为紫外(UV)光。在一些情况下，用以将目标成分共价结合到分离介质的光具有10nm-400nm、例如50nm-400nm、包括100nm-400nm、或150nm-400nm、或200nm-400nm、或250nm-400nm、或300nm-400nm、或325nm-375nm、或350nm-365nm的波长。在某些情况下，光具有350-365nm的波长。

在某些实施方案中，用以将目标成分共价结合到分离介质的光具有与用以活化分离介质的形成的光不同的波长。例如，如上所述，用于活化分离介质的形成的光可具有在可见光谱内的蓝光波长。如上所述，用以将目标成分共价结合到分离介质的光可具有紫外光的波长。因而，在某些实施方案中，分离介质被构造成在施加第一波长的光时形成，并被构造成在施加第二波长的光时共价结合目标成分。如上所述，第一波长的光和第二波长的光可分别为蓝光和紫外光。

在一些情况下，分离介质包括共价结合一种或多种目标成分的官能团。例如，目标成分可为目标分析物，例如但不限于蛋白质、肽等。所述官能团可包括在施加所施加的刺激如如上所述的电磁辐射(例如，光)时被活化的官能团。因而，在某些情况下，官能团为光可活化的官能团。在施加光时，光可活化的官能团可形成能够形成共价键的反应性物质，例如自由基烷基中间体。在施加所施加的刺激(例如，光)时可共价结合目标成分的官能团的实例包括但不限于二苯甲酮基团等。一旦被所施加的刺激活化，官能团就可结合目标成分(例如，蛋白质或肽)，在分离介质和目标成分之间形成共价键。例如，官能团可在官能团和目标成分之间形成碳-碳键。

在一些实施方案中，官能团与分离介质共聚合。例如，官能团可包括附接到分离介质的连接基团。官能团可在连接基团的第一末端结合连接基团，且连接基团的第二末端可结合分离介质，由此间接地结合官能团到分离介质。在一些情况下，结合分离介质的连接基团的第二末端包括共聚单体，例如但不限于丙烯酰胺共聚单体等。在一些实施方案中，连接基团的第二末端包括甲基丙烯酰胺共聚单体。在某些情况下，官能团为二苯甲酮官能团且连接基团包括共聚单体，例如丙烯酰胺共聚单体。例如，官能团(包括连接基团)可为N-(3-[(4-苯甲酰基苯基)甲酰氨基]丙基)甲基丙烯酰胺(也称作BPMA或BPMAC)。如上所述，连接基团可具有结合官能团的第一末端和结合分离介质的第二末端。在一些情况下，在第一末端和第二末端之间的连接基团的中间部分包括脂族基团，例如但不限于C1-C10烷基。在某些情况下，连接基团的中间部分包括低碳烷基(例如，C1-C6烷基)。例如，连接基团的中间部分可包括丙基。

可与分离介质共聚合的官能图的实施方案示于图5中，其显示包括感光的二苯甲酮官能团的交联的聚丙烯酰胺凝胶分离介质。感光的二苯甲酮基团可通过光活化以与目标成分(例如，在分离样品中的蛋白质)形成共价键。

在某些实施方案中，分离介质被构造成以最低捕获效率结合在样品中的成分。捕获效率为由分离介质结合的在样品中的成分的百分比。在一些情况下，捕获效率η为在梯度冲洗之后测量的荧光(AFUw)与在聚焦期间的荧光(AFUf)的比率，其由因子ε校正，以说明pH对物质荧光信号的预期影响。在某些实施方案中，分离介质被构造成具有1％或更大、例如5％或更大、包括10％或更大、或20％或更大、或30％或更大、或40％或更大、或50％或更大、或60％或更大、或70％或更大、或80％或更大、或90％或更大、或95％或更大的捕获效率在一些情况下，分离介质具有75％或更大的捕获效率。

聚合物分离介质的另外方面描述在2010年5月18提交的美国申请公开No.2011/0177618和2012年6月21日提交的美国申请公开No.2012/0329040中，其各自的公开内容通过引用并入本文中。

装置的另外方面

在某些实施方案中，所述装置包括经由聚合物分离介质和固体载体的一种或多种的一部分接触聚合物分离介质的表面的通道。在一些情况下，所述通道的一个或多个壁或末端与聚合物分离介质流体连通。在某些情况下，具有与聚合物分离介质流体连通的通道的一个或多个壁或末端的通道有助于将通道的内含物(例如，缓冲液、溶液、试剂，例如分析物检测试剂等)递送到聚合物分离介质的一个或多个区域。在一些情况下，递送物质到聚合物分离介质的一个或多个特殊区域通过有助于减少在测定方案期间使用的可消耗物质的量来增加效率。例如，经由通道递送分析物检测试剂到聚合物分离介质的预定区域可有助于与其中使全部聚合物分离介质接触分析物检测试剂的测定方案相比较减少所使用的分析物检测试剂的量。

在某些实施方案中，通道可定位成使得其穿过聚合物分离介质的一部分。在一些实施方案中，通道的一个或多个壁可由聚合物分离介质形成。例如，通道可提供在聚合物分离介质的表面中，使得通道在聚合物分离介质的表面中形成细长孔隙。在这些实施方案中，聚合物分离介质形成通道的侧壁和底部。在一些情况下，通道的一侧(例如，顶部)是开放的。在其它实施方案中，通道穿过聚合物分离介质的中心部分，使得通道形成由聚合物分离介质包围的孔隙。在这些实施方案中，通道的壁由聚合物分离介质形成。在某些实施方案中，通道定位成使得通道与聚合物分离介质共平面。

在一些情况下，通道定位成使得其穿过承载分离介质的固体载体的一部分。在一些实施方案中，通道的一个或多个壁可由固体载体形成。例如，通道可提供在固体载体的表面中，使得通道在固体载体的表面中形成细长孔隙。在这些实施方案中，固体载体形成通道的侧壁和底部。在一些情况下，通道的一侧(例如，顶部)是开放的，使得通道的内部体积被暴露(例如，暴露于覆盖的聚合物分离介质)。在其它实施方案中，通道穿过固体载体的中心部分，使得通道形成由固体载体包围的孔隙。在这些实施方案中，通道的壁由固体载体形成。在某些实施方案中，通道定位成使得通道与固体载体共平面。在某些实施方案中，固体载体为具有布置在其表面上的聚合物分离介质的载体。在某些情况下，一个或多个通道提供在如上所述的载体中。在一些实施方案中，固体载体为布置在聚合物分离介质的表面上的外罩。在某些情况下，一个或多个通道提供在如上所述的外罩中。在某些实施方案中，通道可提供在载体和外罩两者中。

在某些实施方案中，通道定位成使得通道不与聚合物分离介质共平面。例如，通道可定位成相对于聚合物分离介质的平面成一定角度。在一些实施方案中，通道定位成使得通道不与承载聚合物分离介质的固体载体共平面。例如，通道可定位成相对于固体载体的平面成一定角度。在这些实施方案中，通道可穿过聚合物分离介质的一部分和固体载体的一部分。

通道可与在第一末端(例如，上游端)的输入贮存器流体连通。输入贮存器可含有可在测定中的一个或多个步骤期间提供到分离介质的缓冲液、溶液、试剂等。在一些情况下，通道的相对末端(例如，下游端)可与输出贮存器流体连通。在其它实施方案中，通道的下游端可为封闭端，使得可将通道的内含物递送到通道的封闭端。例如，通道的封闭端可与聚合物分离介质的一部分接触，使得通道的内含物递送到聚合物分离介质的那部分。

在某些实施方案中，所述装置包括一个或多个通道。例如，装置可包括1个通道、或2个或更多个通道，例如3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、12个或更多个、14个或更多个、16个或更多个、18个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个、45个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、或100个或更多个通道。通道可为个别通道。在这些实施方案中，可提供个别通道以递送物质到聚合物分离介质的不同预定部分。在一些实施方案中，两个或多个通道可彼此流体连通。例如，两个或多个通道的内部体积可彼此连接，使得通道的内含物可流到另一通道中。在一些情况下，其中两个或更多个通道可彼此流体连通的实施方案有助于从单个上游输入通道提供给两个或更多个通道相同的缓冲液、溶液、试剂等。在一些情况下，其中两个或更多个通道可彼此流体连通的实施方案有助于从两个或更多个通道下游提供单个输出通道。

在某些实施方案中，所述通道的内部体积为孔隙。在一些情况下，孔隙可用溶液、缓冲液、试剂(例如，分析物检测试剂或抗体、蛋白质、酶、代谢物等)、其组合等填充，如对于测定方案可能需要的。在某些实施方案中，所述通道的内部体积含有材料。例如，通道的内部体积可含有聚合物材料，例如聚合物凝胶。聚合物凝胶可为适用于凝胶电泳的凝胶。聚合物凝胶可包括但不限于聚丙烯酰胺凝胶(例如，甲基丙烯酰胺凝胶)、琼脂糖凝胶等。在某些实施方案中，与聚合物分离介质相比较，在通道的内部体积中的聚合物材料具有不同的物理和/或化学性质。例如，与聚合物分离介质相比较，在通道的内部体积中的聚合物材料可具有不同的孔径、总聚合物含量(例如，总丙烯酰胺含量)、交联剂浓度和/或官能团。

在某些实施方案中，在通道中的溶液、缓冲液、试剂等可通过扩散递送到聚合物分离介质的一个或多个部分。例如，溶液、缓冲液、试剂等可提供在通道的内部体积中并且可允许扩散到与通道接触的聚合物分离介质的一个或多个部分。在一些情况下，溶液、缓冲液、试剂等可通过包括但不限于电泳、电渗、压力驱动的流动(例如，使用泵或重力)、其组合等的直接传输递送到聚合物分离介质的一个或多个部分。

根据用途，任何或所有的通道可彼此相同或不同且各自可被构造成含有不同的缓冲液、溶液、试剂等。个别通道的方面在下文更详细地描述，但可应用到在装置中的任何或所有的通道。

在某些实施方案中，所述通道为细长通道。细长通道具有大于其宽度的长度。在一些情况下，通道的长度大于通道的宽度，例如为通道的宽度的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍或200倍或更多倍。

在某些实施方案中，通道为微通道。“微通道”为具有微米标度的尺寸的孔。虽然尺寸可以改变，但在一些情况下，通道具有100μm或更小、例如90μm或更小、或80μm或更小、或70μm或更小、或60μm或更小、或50μm或更小、或40μm或更小、或30μm或更小、或20μm或更小、或10μm或更小、或5μm或更小、或1μm或更小的宽度。例如，通道可具有1μm-100μm、例如1μm-90μm、或1μm-80μm、或1μm-70μm、或1μm-60μm、或1μm-50μm、或1μm-40μm、或1μm-30μm、或1μm-20μm、或1μm-10μm的宽度。

在某些实施方案中，通道具有100μm或更小、例如90μm或更小、或80μm或更小、或70μm或更小、或60μm或更小、或50μm或更小、或40μm或更小、或30μm或更小、或20μm或更小、或10μm或更小、或5μm或更小、或1μm或更小的深度。例如，通道可具有1μm-100μm、例如1μm-90μm、或1μm-80μm、或1μm-70μm、或1μm-60μm、或1μm-50μm、或1μm-40μm、或1μm-30μm、或1μm-20μm、或1μm-10μm的深度。

在某些实施方案中，通道具有10μm或更大、例如20μm或更大、或30μm或更大、或40μm或更大、或50μm或更大、或60μm或更大、或70μm或更大、或80μm或更大、或90μm或更大、或100μm或更大、或150μm或更大、或200μm或更大、或250μm或更大、或300μm或更大、或350μm或更大、或400μm或更大、或450μm或更大、或500μm或更大、或550μm或更大、或600μm或更大、或650μm或更大、或700μm或更大、或750μm或更大、或800μm或更大、或850μm或更大、或900μm或更大、或950μm或更大、或1000μm或更大的长度。

在一些实施方案中，通道与邻近通道分隔某一距离。例如，通道可与邻近通道分隔500μm或更小、例如450μm或更小、或400μm或更小、或350μm或更小、或300μm或更小、或250μm或更小、或200μm或更小、或150μm或更小、或100μm或更小、例如90μm或更小、或80μm或更小、或70μm或更小、或60μm或更小、或50μm或更小、或40μm或更小、或30μm或更小、或20μm或更小、或10μm或更小、或5μm或更小的距离。

在某些实施方案中，所述通道为基本线性的。在其它实施方案中，通道为曲线的。在一些情况下，通道的一个或多个部分为基本线性的，而通道的一个或多个邻近部分为曲线的。在一些实施方案中，通道包括一个或多个弯曲或拐角。在这些实施方案中，通道可包括经由弯曲拐角连接到第二部分的第一部分。由一个或多个弯曲或拐角连接的通道的另外部分可根据需要提供。

如上所述，包括通道的装置在局部递送物质(例如，溶液、缓冲液、试剂等)到聚合物分离介质的一个或多个特殊部分方面得到应用。在一些实施方案中，通道可有助于以与不包括通道的装置相比较更快的速率将物质递送到聚合物分离介质。在一些实施方案中，通道有助于在测定方案期间在不同时段将一种或多种物质递送到聚合物分离介质的特殊部分。例如，第一物质可在第一时间点递送到聚合物分离介质的一部分，且第二物质可在第二时间点递送到聚合物分离介质的同一部分或不同物质。在某些情况下，物质从通道的定时释放可取决于所施加的刺激的施加或释放物质的反应。例如，物质可通过光活化反应、酸或碱活化反应等从通道释放。例如，在一些情况下，待释放的物质结合在通道的内部体积中的材料(例如，经由可降解的交联剂)，且可通过施加如上所述的所施加的刺激从所述材料释放(例如，去结合)。去结合的物质随后可从通道的内部体积穿行到聚合物分离介质中。在一些实施方案中，包括通道的装置有助于降低在测定方案期间使用的物质的量。在一些情况下，通道可有助于增加在聚合物分离介质的预定部分处物质的局部浓度。例如，与在与通道隔开一定距离的聚合物分离介质的区域中相比较，在通道中提供的物质的局部浓度在邻近通道的聚合物分离介质的区域中可较大。

在某些实施方案中，所述装置包括定向成通道的纵轴基本上垂直于聚合物分离介质的平面的通道，例如通道相对于水平布置的聚合物分离介质垂直定向。在一些情况下，通道包括如本文所述的中心孔。因而，通道可在聚合物分离介质中形成孔隙，其中包围孔隙的聚合物分离介质形成通道的外周壁。在一些情况下，通道(例如，中心孔)基本上为环形的。

在一些情况下，分离介质被构造成使得样品置于分离介质的通道中。在某些情况下，通道包括开口端，例如在聚合物分离介质的表面上的开口端(例如，顶部表面)。在一些情况下，通道的开口端具有相对的封闭端。封闭端可由聚合物分离介质形成(例如，其中通道的高度小于聚合物分离介质的厚度)，或可通过承载聚合物分离介质的固体载体形成(其中，通道穿过聚合物分离介质的全部厚度)。

在某些实施方案中，聚合物分离介质的通道(例如，中心孔)包括定位在外周上且与通道流体连通的多个微孔。与通道流体连通的微孔可具有面对通道的内部体积的开口端，使得流体及其成分可从通道的内部体积流到微孔的内部体积，反之亦然。在一些实施方案中，各微孔具有与微孔的开口端相对的封闭端。在某些情况下，微孔的封闭端通过周围聚合物分离介质形成。在某些情况下，微孔与通道共平面。例如，微孔可被构造成使得微孔的从微孔的封闭端到开口端的轴与通道的横向(即，水平)半径共平面(例如，与在车轮中的辐条类似)。因而，微孔可具有与聚合物分离介质共平面的微孔的从微孔的封闭端到开口端的轴。上述通道的实施方案的另外方面在本文中关于具有中心孔和环形排列的微孔的聚合物分离介质描述。

方法

方法的实施方案涉及分离样品的成分，例如细胞的成分(例如，细胞组分)。方法的方面包括使样品与包括多个如上所述的微孔的聚合物分离介质接触。在某些实施方案中，所述聚合物分离介质包括在施加所施加的刺激时共价结合在分离介质中的一种或多种目标样品组分的官能团，如在下文更详细地描述。在一些情况下，方法还包括对聚合物分离介质施加电场，以此方式足以将样品的至少一些组分从微孔移动到聚合物分离介质中，产生在聚合物分离介质中的分离的样品组分。

在某些实施方案中，可使样品与聚合物分离介质接触，使得样品的成分定位在聚合物分离介质中的一个或多个微孔中。例如，可将样品施加到分离介质的表面且可允许在样品中的成分被动地沉降到微孔中，例如，溶液由于重力而被动地沉下)。在一些情况下，如上所述，聚合物分离介质包括平面阵列的微孔，且在一些情况下，样品成分可通过施加样品到分离介质并允许在样品中的成分被动地沉降到平面阵列的微孔中而定位在平面阵列的微孔中。在某些实施方案中，成阵列的微孔可包括具有基本均匀的，或在其它实施方案中不均匀的，如上所述的形状和/或尺寸的微孔。在其中聚合物分离介质包括不均匀的微孔的实施方案中，方法可包括使用不同形状和/或尺寸的微孔尺寸选择性沉降。例如，可将样品施加到分离介质且样品成分(例如，细胞)可根据细胞和微孔的形状和/或尺寸优先沉降到某些相应微孔中。

在其它实施方案中，如上所述，聚合物分离介质可包括环形排列的微孔。在这些实施方案中，将样品成分定位在微孔中的方法可包括对聚合物分离介质施加离心力，以此方式足以将样品的组分定位在微孔中。例如，可将样品引入聚合物分离介质的中心孔中，且随后可施加离心力(例如，通过旋转装置)，使得在微孔中的样品成分被迫进入在中心孔的外周上的一个或多个微孔中。在一些情况下，所施加的离心力可具有足以将例如细胞的样品组分定位到装置的微孔中的量值。在某些情况下，所施加的离心力可具有足以将例如细胞的样品组分定位到装置的微孔中而不会对在样品中的成分(例如，细胞)造成显著损害的量值。在某些情况下，所施加的离心力为50g(重力)或更大、例如60g或更大、或70g或更大、或80g或更大、或90g或更大、或100g或更大、或110g或更大、或120g或更大、或130g或更大、或140g或更大、或150g或更大。

将样品成分定位到微孔中的其它方法也是可能的。例如，样品成分可通过以下各项中的一种或多种或以下项定位在聚合物分离介质的一个或多个微孔中：对样品施加电场；施加密度梯度，使用例如但不限于微量吸管、喷嘴、光学镊子等定位装置将样品成分实体定位到微孔中；施加压力；施加磁力(例如，其中目标样品成分与磁化珠粒结合)；对流流动；使用尺寸不同的微孔进行尺寸选择性沉降；将含有细胞或细胞裂解物的样品的液滴定位到微孔中；其组合等。

在某些实施方案中，样品和/或样品组分可在将样品组分定位到微孔中之前或之后处置。例如，样品和/或样品组分可在定位到微孔中之前处置。在其它实施方案中，样品和/或样品组分可在定位到微孔中之后处置。在一些情况下，样品可包括一种或多种目标细胞。因而，方法可包括处置细胞以产生细胞组分。例如，方法可包括将细胞裂解以从细胞中释放细胞组分。在一些情况下，细胞组分可通过特殊细胞区室的不同裂解作用来产生。例如，特殊细胞区室的不同裂解作用可有助于个别地分析不同细胞区室的含量。在某些情况下，细胞组分可通过处理细胞使得细胞释放目标细胞组分(例如，在不使细胞裂解的情况下)由细胞产生。例如，可将细胞处理(例如，在加热器或冷却器温度下孵育，用活性剂处理等)，使得细胞分泌一种或多种目标细胞组分。在某些实施方案中，细胞可封装在样品液滴中且可将样品液滴如上所述处理，从而产生细胞组分。可将液滴定位在微孔中，且随后如上所述处理，或者可在定位液滴在微孔中之前处理液滴。

一旦将样品成分定位在微孔中，方法还包括分离在分离介质中的样品成分以产生分离的样品成分。在一些情况下，在样品穿过微孔的壁并穿过分离介质时，分离的成分通过凝胶电泳产生。在其它情况下，分离的样品通过在分离介质中等电聚焦来产生。分离的样品可包括成分(例如，分析物)的不同可检测条带，其中根据所进行的分离的类型，各条带包括具有例如分子量、尺寸、电荷(例如，荷质比)、等电点、亲和相互作用等基本类似的性能的一种或多种成分。

例如，在其中聚合物分离介质包括如上所述的平面阵列的微孔的实施方案中，方法可包括通过在聚合物分离介质上施加电场，以此方式足以将至少一些样品成分移动穿过微孔的侧壁并进入聚合物分离介质中以产生在聚合物分离介质中的分离的样品成分来分离样品成分。在其中聚合物分离介质包括如上所述的环形排列的微孔的其它实施方案中，方法可包括通过在聚合物分离介质上施加电场，以此方式足以将至少一些样品成分移动穿过微孔的封闭端(例如，微孔的底部)并进入聚合物分离介质中以产生在聚合物分离介质中的分离的样品成分来分离样品成分。

在某些实施方案中，所述装置被构造成使样品经受电场。电场可有助于样品移动穿过装置(例如，样品从装置的一个区域电动转移到装置的另一区域)。电场也可有助于通过如上所述的电泳(例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS-PAGE、等电聚焦等)分离在样品中的分析物。

例如，分离在样品中的分析物可包括施加被构造成将在样品中的分析物引导穿过装置的分离介质的电场。电场可被构造成基于分析物的物理性质而有助于在样品中的分析物的分离。例如，电场可被构造成基于分析物的分子量、尺寸、电荷(例如，荷质比)、等电点等而有助于在样品中的分析物的分离。在某些情况下，电场被构造成基于分析物的分子量而有助于在样品中的分析物的分离。在其它实施方案中，电场被构造成基于分析物的等电点(pI)而有助于在样品中的分析物的分离。

在一些情况下，方法还包括将分离的样品组分固定在聚合物分离介质中。固定可使用任何方便的方法，例如例如通过将聚合物分离介质暴露于紫外(UV)光将分离的样品组分到共价结合聚合物分离介质来完成。例如，在已经分离了在样品中的成分之后，方法还可包括对分离介质施加刺激以将成分共价结合到分离介质。在一些情况下，施加刺激包括施加电磁辐射到分离介质。例如，方法可包括将分离介质暴露于例如但不限于可见光、紫外光、红外光等光。在某些情况下，方法包括施加光(例如，紫外光)到分离介质以将成分共价结合到分离介质。

在某些实施方案中，用以将目标成分共价结合到分离介质的光具有与用以活化分离介质的形成的光不同的波长。例如，如上所述，用于活化分离介质的形成的光可具有在可见光谱内的蓝光的波长。如上所述，用以将目标成分共价结合到分离介质的光可具有紫外光的波长。因而，在某些实施方案中，方法包括将分离介质暴露于第一波长的光以形成分离介质，和将分离介质暴露于第二波长的光以将目标成分共价结合到分离介质。如本文所述，第一波长的光和第二波长的光可分别为蓝光和紫外光。

在某些实施方案中，所述方法包括确定目标分析物是否存在于样品中，例如确定在样品中一种或多种目标分析物的存在或不存在。在一些情况下，装置被构造成检测在样品中一种或多种分析物的存在。在所述方法的某些实施方案中，在样品中一种或多种分析物的存在可定性或定量地确定。定性确定包括其中关于在样品中分析物的存在向用户提供简单的是/否结果的确定。定量确定包括半定量确定，其中关于在样品中分析物的量向用户提供大致标度的结果，例如低、中等、高；以及精密标度结果，其中向用户提供分析物浓度的测量值。

在某些实施方案中，所述方法包括检测结合分离介质的目标分析物。目标分析物与分离介质的可检测的结合指示在样品中目标分析物的存在。在一些情况下，检测目标分析物包括使目标分析物与被构造成与目标分析物特异性结合的标记接触，例如所述标记可存在于分析物检测试剂中。分析物检测试剂可为特异性结合所靶向的蛋白质或核酸序列或生物大分子(例如，目标分析物)的任何分子。根据分析物的性质，分析物检测试剂可为但不限于：用于检测核酸的与靶DNA或RNA序列的独特区域互补的单链DNA；用于检测蛋白质和肽的抵抗肽分析物的表位的抗体；或任何识别分子，例如特异性结合对的成员。例如，合适的特异性结合对包括但不限于：受体/配体对的成员；受体的配体结合部分；抗体/抗原对的成员；抗体的抗原结合片段；半抗原；凝集素/碳水化合物对的成员；酶/底物对的成员；生物素/抗生物素蛋白；生物素/抗生蛋白链菌素；地高辛/抗地高辛；DNA或RNA适体结合对的成员；肽适体结合对的成员；等。在某些实施方案中，分析物检测试剂包括抗体。所述抗体可特异性结合目标分析物。

在某些实施方案中，所述分析物检测试剂包括可检测的标记。可检测的标记包括可使用所述方法和系统检测的任何常规标记，并且可包括但不限于荧光标记、比色标记、化学发光标记、多色试剂、酶联试剂、抗生物素蛋白-抗生蛋白链菌素缔合的检测试剂、放射性标记、金粒子、磁性标记等。在某些实施方案中，分析物检测试剂包括与可检测标记缔合的抗体。例如，分析物检测试剂可包括标记的抗体(例如，荧光标记的抗体)，其特异性结合目标分析物。因而，所述方法可包括检测标记的目标分析物。

如上所述，检测目标分析物包括使目标分析物与被构造成特异性结合目标分析物的分析物检测试剂(例如，标记)(例如，特异性结合目标分析物的抗体)接触。例如，使目标分析物与分析物检测试剂接触可包括施加分析物检测试剂的溶液到聚合物分离介质。可使分析物检测试剂与例如聚合物分离介质的顶部或一侧或多侧的聚合物分离介质的任何表面接触。在一些情况下，分析物检测试剂可移动穿过聚合物分离介质，使得分析物检测试剂接触固定在聚合物分离介质内的目标分析物。例如，分析物检测试剂可通过对施加电场、施加压力、施加离心力、被动扩散等移动穿过聚合物分离介质。

在某些实施方案中，检测目标分析物包括使目标分析物与特异性结合目标分析物的一次标记接触。在某些实施方案中，所述方法包括增强来自标记的目标分析物的可检测信号。例如，增强来自标记的目标分析物的可检测信号可包括使一次标记与被构造成特异性结合一次标记的二次标记接触。在某些情况下，一次标记为特异性结合目标分析物的一级抗体，且二次标记为特异性结合一级抗体的二级抗体。因而，增强来自标记的目标分析物的可检测信号可包括使一级抗体抗体与被构造成特异性结合一级抗体的二级抗体接触。使用如上所述的两种或更多种可检测标记可通过改进信噪比而有助于检测目标分析物。

在某些实施方案中，分析物检测试剂可能不与目标分析物特异性结合。在一些情况下，分析物检测试剂可被构造成自目标分析物产生可检测信号，而不特异性结合目标分析物。例如，目标分析物可为酶(例如，细胞酶)且分析物检测试剂可为所述酶的底物。在一些情况下，使分析物检测试剂(例如，酶底物)与目标分析物(例如，酶)接触可产生可检测信号，因为底物因酶而转化。

在某些实施方案中，所述方法包括除去分析物检测试剂且随后使目标分析物与另一分析物检测试剂接触(例如，剥离和再探测)。例如，方法可包括使标记的目标分析物与被构造成从目标分析物中解离分析物检测试剂的缓冲液(例如，剥离缓冲液)接触。解离的分析物检测试剂随后可从聚合物分离介质中洗去。在一些情况下，随后可使目标分析物与后续分析物检测试剂接触。后续分析物检测试剂可与初始分析物检测试剂相同或不同。剥离和再探测可有助于目标分析物与不同分析物检测试剂接触。

在某些实施方案中，所述方法包括储存聚合物分离介质。例如，方法可包括通过使聚合物分离介质脱水来储存聚合物分离介质。聚合物分离介质可储存持续例如但不限于1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更久的持续时间。在一些实施方案中，所述方法还包括使聚合物分离介质再水合。再水合的聚合物分离介质可用于本文所述的任何测定步骤中。例如，使聚合物分离介质脱水和再水合可在任何测定步骤之间进行，例如在产生聚合物分离介质和进行测定之间、在固定目标分析物到聚合分离介质和使分析物与分析物检测试剂接触之间、在剥离和再探测之间等。

可用本发明方法测定的样品可包括简单样品和复合样品两者。简单样品为包括目标分析物的样品，且可包含或可不包含不是目标的一种或多种分子实体，其中这些非目标分子实体的数目可较低，例如10个或更少、5个或更少等。简单样品可包括已经以某一方式加工例如以从样品中除去潜在地干扰分子实体的初始生物或其它样品。“复合样品”意指可或可不具有目标分析物，但还包括不是目标的许多不同蛋白质和其它分子的样品。在一些情况下，在本发明方法中测定的复合样品为包括10种或更多种、例如20种或更多种、包括100种或更多种、例如10³种或更多种、10⁴种或更多种(例如15,000、20,000或25,000种或更多种)独特(即，不同)的分子实体，它们在分子结构或物理性质(例如，分子量、尺寸、电荷、等电点、亲和相互作用等)方面彼此不同。

在某些实施方案中，目标分析物为细胞和/或细胞组分。在一些情况下，细胞从例如但不限于尿液、血液、血清、血浆、唾液、精液、前列腺液、乳头抽吸液、泪液、汗、粪便、颊棉签、脑脊髓液、裂解物样品、羊水、胃肠液、生检组织(例如，从激光捕获显微切割(LCM)获得的样品)等样品中获得。样品可为生物样品，或可使用成功提取DNA、RNA、蛋白质和肽的常规方法从源于人类、动物、植物、真菌、酵母、细菌、组织培养物、病毒培养物或其组合的生物样品中提取。在某些实施方案中，样品为流体样品，例如分析物(例如，细胞和/或细胞组分)在流体中的溶液。流体可为水性流体，例如但不限于水、缓冲液等。

如上所述的，可在本发明方法中测定的样品可包括一种或多种目标分析物。可检测分析物的实例包括但不限于：核酸，例如双或单链DNA、双或单链RNA、DNA-RNA杂化体、DNA适体、RNA适体等；有或没有改性的蛋白质和肽，例如抗体、双链抗体、Fab片段、DNA或RNA结合蛋白、磷酸化蛋白(磷酸化蛋白质组学)、肽适体、表位等；小分子，例如抑制剂、活化剂、配体等；寡糖或多糖；其混合物；等。

在某些实施方案中，所述方法被构造成分离和/或检测在样品中的目标成分，其中样品尺寸较小。例如，方法可被构造成分离和/或检测在样品中的目标成分，其中样品尺寸为1mL或更小、例如750μL或更小、包括500μL或更小、或250μL或更小、100μL或更小、或75μL或更小、或50μL或更小、或40μL或更小、或30μL或更小、或20μL或更小、或10μL或更小、或5μL或更小、或1μL或更小。在一些情况下，方法被构造成分离和/或检测在样品中的目标成分，其中样品尺寸为20μL或更小。

在某些实施方案中，所述方法包括在引导样品穿过分离介质之前浓缩、稀释或缓冲液交换样品。浓缩样品可包括在使样品与分离介质接触之前使样品与浓缩介质接触。浓缩介质可包括小孔径的聚合物凝胶、膜(例如，尺寸排阻膜)、其组合等。在使样品与分离介质接触之前浓缩样品可有助于在分离的样品中分析物的条带之间的解析度增加，因为分析物的各个分离条带在样品穿过分离介质时可较低程度地分散。稀释样品可包括在使样品与分离介质接触之前使样品与另外的缓冲液接触。缓冲液交换样品可包括在使样品与分离介质接触之前使样品与缓冲液交换介质接触。缓冲液交换介质可包括与样品缓冲液不同的缓冲液。缓冲液交换介质可包括但不限于分子筛、多孔树脂等。

在某些实施方案中，所述方法包括在检测目标分析物之前使与分离介质结合的分离的分析物与阻断剂接触。在一些情况下，在检测目标分析物之前使分离的分析物与阻断剂接触可有助于使可检测标记与分离的分析物的非特异性结合最少化。例如，在检测目标分析物之前使分离的分析物与阻断剂接触可有助于使标记的抗体与分离的分析物的非特异性结合最少化。阻断剂可为如上所述起作用的任何阻断剂，且可包括但不限于牛血清蛋白(BSA)、脱脂奶粉、酪蛋白和明胶。在其它实施方案中，不需要阻断步骤。因此，在这些实施方案中，所述方法不包括在检测目标分析物之前的阻断步骤。

在某些实施方案中，所述方法还包括任选的洗涤步骤，其可在所述方法的其它步骤之前、期间和之后的不同时间进行。例如，洗涤步骤可在分离的样品与分离介质结合之后、在使分离的样品与阻断剂接触之后、在分离的样品与可检测标记接触之后等进行。

所述方法的实施方案还可包括释放与分离介质结合的分析物。所述释放可包括使结合的分析物与释放剂接触。释放剂可被构造成破坏在分析物与分离介质之间的结合相互作用。在一些情况下，释放剂为破坏在分析物与分离介质之间的结合相互作用的试剂、缓冲液等，这使得分离介质释放分析物。在从分离介质释放分析物之后，所述方法可包括从分离介质移走分析物。例如，方法可包括在分离介质的下游引导所释放的分析物以便用二次分析装置进行二次分析，所述二次分析装置例如但不限于UV光谱仪和IR光谱仪、质谱仪、HPLC、亲和力测定装置、如本文所述的第二微流体装置等。

在一些实施方案中，所述方法包括单重分析在样品中的分析物。“单重分析”意指分析样品以检测在样品中一种分析物的存在。例如，样品可包括目标分析物与不是目标的其它分子实体的混合物。在一些情况下，所述方法包括单重分析样品以确定在样品混合物中目标分析物的存在。

某些实施方案包括多重分析在样品中的两种或更多种分析物。“多重分析”意指确定两种或更多种独特分析物的存在，其中所述两种或更多种分析物彼此不同。例如，分析物可包括在其分子量、尺寸、电荷(例如，质荷比)、等电点等方面的可检测的差异。在一些情况下，分析物的数目大于2种，例如4种或更多种、6种或更多种、8种或更多种等，直至20种或更多种，例如50种或更多种，包括100种或更多种独特分析物。在某些实施方案中，所述方法包括多重分析2种-100种独特分析物，例如4-50种独特分析物，包括4-20种独特分析物。在某些实施方案中，多重分析还包括使用两种或更多种不同的可检测标记。所述两种或更多种不同的可检测标记可特异性结合相同或不同的分析物。在一些情况下，所述两种或更多种不同的可检测标记可特异性结合相同的分析物。例如，所述两种或更多种不同的可检测标记可包括对在相同分析物上的不同表位具有特异性的不同抗体。使用对相同分析物具有特异性的两种或更多种可检测标记可通过改进信噪比而有助于检测所述分析物。在其它情况下，所述两种或更多种不同的可检测标记可特异性结合不同的分析物。例如，所述两种或更多种可检测标记可包括对在不同分析物上的表位具有特异性的不同抗体。使用各自对不同分析物具有特异性的两种或更多种可检测标记可有助于在单一测定中检测在样品中的两种或更多种相应分析物。

在某些实施方案中，所述方法为自动化方法。因而，所述方法可包括在将样品引入装置中之后最小的用户与装置和系统的相互作用。例如，分离在分离介质中的样品成分以产生分离的样品和对分离介质施加刺激以将所述成分共价结合到分离介质的步骤可通过所述装置和系统在预定的间隔下进行，使得用户不必手动地进行这些步骤。在一些情况下，自动化方法可有助于减少总测定时间。例如，包括在样品中的分析物的分离和检测的方法的实施方案可在240分钟或更短、例如180分钟或更短、120分钟或更短、例如90分钟或更短、或60分钟或更短、或45分钟或更短、或30分钟或更短、例如20分钟或更短、包括15分钟或更短、或10分钟或更短、或5分钟或更短、或2分钟或更短、或1分钟或更短的时间内进行。

本公开的实施方案的方面还包括制备上述聚合物分离介质的方法。在一些情况下，所述方法包括将聚合物分离介质的单体前体组合物定位在第一表面和包括一种或多种结构特征的第二表面之间；用具有足以引发前体组合物的聚合的波长的光(例如，蓝光)照射单体前体组合物，以产生所需组合物。所述方法还可包括除去包括所述一种或多种结构特征的第二表面，使得第一表面(例如，固体载体)承载包括多个如本文所述的微孔的聚合分离介质。在某些实施方案中，在第二表面上的结构特征包括多个柱。在第二表面上的柱可包括对应于微孔的内部体积的所需形状和尺寸的形状和尺寸。在包括在第二表面上的多个柱的实施方案中，可产生包括平面阵列的微孔的聚合物分离介质。在其它实施方案中，在第二表面上的结构特征可对应于包括如本文所述的环形排列的微孔的聚合物分离介质的中心孔的形状和尺寸。例如，第二表面可包括例如圆柱体的结构特征，所述圆柱体包括从圆柱体的轴长向远处延伸的多个柱。在圆柱体的周长上的柱可包括对应于微孔的内部体积的所需形状和尺寸的形状和尺寸。在一些实施方案中，圆柱体的高度对应于聚合物分离介质的所需厚度。

系统

某些实施方案的方面包括被构造成进行本公开的方法的系统。在一些情况下，所述系统包括如本文所述的分离介质。所述系统还可包括电磁辐射的来源(即，电磁辐射源)。在一些情况下，电磁辐射源为光源。例如，所述光源可包括可见光源、紫外光源、红外光源等。在一些情况下，电磁辐射源包括光源，例如紫外光源。如上所述，电磁辐射源可用以将电磁辐射施加到在微流体装置中的分离介质，以将样品成分固定(例如，共价结合)到分离介质。

在某些实施方案中，所述系统还包括检测器。在一些情况下，检测器被构造成检测可检测的标记。所述检测器可包括被构造成检测在测定中使用的可检测标记的任何类型的检测器。如上所述，可检测标记可为荧光标记、比色标记、化学发光标记、多色试剂、酶联试剂、抗生物素蛋白-抗生蛋白链菌素缔合的检测试剂、放射性标记、金粒子、磁性标记等。在一些情况下，可检测标记为荧光标记。在这些情况下，检测器可被构造成使荧光标记与电磁辐射(例如，可见光、UV、x射线等)接触，所述电磁辐射激发荧光标记并且使荧光标记发射可检测的电磁辐射(例如，可见光等)。发射的电磁辐射可由检测器检测以确定与分离介质结合的标记的分析物的存在。

在一些情况下，检测器可如上文所述被构造成检测来自荧光标记的发射。在某些情况下，检测器包括光电倍增管(PMT)、电荷耦合装置(CCD)、强化电荷耦合装置(ICCD)、互补金属-氧化物半导体(CMOS)传感器、目视比色读数器、光电二极管等。

本公开的系统可根据需要包括各种其它组件。例如，所述系统可包括流体处理组件，例如微流体的流体处理组件。流体处理组件可被构造成引导一种或多种流体穿过装置。在一些情况下，流体处理组件被构造成引导例如但不限于流体样品、缓冲液(例如，电泳缓冲液、洗涤缓冲液、释放缓冲液等)等流体。在某些实施方案中，流体处理组件被构造成递送流体到装置的分离介质，以使得流体接触分离介质。流体处理组件可包括泵(例如，微流体泵)。在一些情况下，泵被构造成用于压力驱动流体处理和导引流体穿过本文公开的装置和系统。在某些情况下，流体处理组件为被构造成递送例如1mL或更少、例如500μL或更少、包括100μL或更少、例如50μL或更少、或25μL或更少、或10μL或更少、或5μL或更少、或1μL或更少的少量流体的微流体流体处理组件。

在某些实施方案中，所述系统包括一个或多个电场发生器。电场发生器可被构造成对装置的各个区域施加电场，例如对分离介质施加电场。所述系统可被构造成施加电场，以使得样品以电动方式输送穿过装置。例如，电场发生器可被构造成向分离介质施加电场。在一些情况下，所施加的电场可与分离介质的定向轴对准。因而，所施加的电场可被构造成将在样品中的分析物和组分以电动方式输送穿过分离介质。在一些情况下，电场发生器被构造成以在10V/cm-1000V/cm，例如100V/cm-800V/cm、包括200V/cm-800V/cm、或400v/cm-800V/cm范围内的强度施加电场。

在某些实施方案中，所述系统包括电场发生器，所述电场发生器被构造成施加电场，使得在样品中的分析物和/或成分在分离介质中等电聚焦。例如，所施加的电场可与分离介质的定向轴对准且被构造成沿分离介质的定向轴等电聚焦样品成分。

在一些实施方案中，电场可为独特定向的。例如，电场可与分离介质的定向轴对准。电场可被构造成沿着分离介质的定向轴引导样品或分析物穿过分离介质。

在某些实施方案中，所述系统包括被构造成产生电场的一个或多个电场发生器。在某些情况下，电场发生器可在装置的近端，例如排列在装置上。在一些情况下，电场发生器定位在距装置一定距离处。例如，电场发生器可并入系统中以供所述装置使用。

效用

主题装置、系统和方法用于多种不同应用，在这些应用中需要确定在样品中一种或多种分析物的存在或不存在，和/或定量在样品中的一种或多种分析物。例如，主题装置、系统和方法用于蛋白质、肽、核酸等的分离和检测。在一些情况下，主题装置、系统和方法用于蛋白质的分离和检测。

主题装置、系统和方法用于干细胞去分化和分化方案的发展和验证。例如，诱导的多能干细胞可来源于例如皮肤细胞的体细胞，其可包括用各种外界刺激(例如，化学或生物刺激)重编程体细胞以诱导细胞到达多能性状态。在一些情况下，当用新外界刺激实验以获得多能性时，可能需要测量细胞类群的响应以确定是否已经获得多能性。主题装置、系统和方法用于测量细胞类群的这些响应以确定是否已经获得多能性。例如，主题装置、系统和方法用于测量多种蛋白质靶，所述蛋白质目标为已知的多能性指示剂，例如但不限于Oct-3/4、Nanog、SSEA-4和SOX2。主题装置、系统和方法用于确定转型细胞类群的异质性以确定成功转型到多能性状态的细胞的百分比。这类诱导的多能干细胞因此可经由外部化学或生物刺激分化以产生各种细胞类型，例如但不限于心肌细胞、神经元、肝细胞和内皮细胞。主题装置、系统和方法用于验证这类分化方案，因为，在某些实施方案中，主题装置、系统和方法可同时检测指示成功分化到靶细胞类型的多种蛋白质标志物。主题装置、系统和方法用于确定转型细胞类群的异质性以确定成功分化到靶细胞类型的细胞的百分比。

主题装置、系统和方法还用于“培养皿中的疾病”模型的发展和验证。例如，其可挑战研究人员来研究人脑中的疾病，因为从活患者提取神经元是困难并且危险的。作为替代方案，可产生疾病的细胞模型以允许基础科学研究和药物研发。这类模型可例如通过由来源于由具有遗传神经变性疾病的患者捐献的皮肤细胞的诱导的多能干细胞(IPSC)分化神经元来产生。为了产生这些模型，可如先前所述发展并验证干细胞分化方案以使皮肤细胞去分化成干细胞且随后使干细胞分化成神经元。该转型一旦成功，则可通过确定疾病的特征在分化的细胞中存在而验证所述模型。例如，神经元可由具有亨廷顿氏病(Huntington’s disease)的患者的皮肤细胞产生。一旦产生，则可对于患病形式的亨廷顿蛋白质的表达来试验所产生的细胞。主题装置、系统和方法用于检测在疾病模型中亨廷顿蛋白质的存在和异质性并验证与初级细胞的相似性。培养皿中的疾病模型还可通过细胞系的选择或遗传修饰而产生。可验证这类细胞以保证遗传修饰产生模拟在患病原代细胞中所见到的患病标志物(例如，蛋白质)的稳定表达。主题装置、系统和方法用于产生肝、肾、心脏、脑、血液或其它器官、组织和细胞类型的疾病模型。

主题装置、系统和方法还用于测量癌性肿瘤的异质性。例如HER-2和BRAF的特殊生物标志物指示某些癌症突变并且分别为例如曲妥珠单抗和威罗菲尼(vemurafenib)的药物的靶。癌症可为高度不均质的疾病且例如HER-2和BRAF的靶无法在肿瘤内均匀地表达。所述异质性可具有临床诊断和治疗的含义。主题装置、系统和方法用于分析在来源于肿瘤活检的细胞类群中多种靶的异质性。这种方法可有助于基础科学研究、药物发现和研发及靶向治疗的伴随诊断。

主题装置、系统和方法还用于确定药物化合物的作用机理。例如，“培养皿中的疾病”模型可用作药物研发的体外试验平台。可研发药物以靶向在疾病和疾病模型两者中存在的特殊目标和途径。主题装置、系统和方法用于分析在暴露于药物候选物之后细胞类群的异质响应。对药物的响应可与初级靶的存在相关且在未通过初级靶的存在或不存在解释的细胞类群内的异质响应可与其它蛋白质和信号途径进一步相关。以此方式，主题装置、系统和方法用于确定药物的作用机理，其可有助于药物化合物的更有效研究、研发和最后批准。

主题装置、系统和方法还用于分析从血液中分离的循环肿瘤细胞(CTC)。CTC为从原发肿瘤脱落的在循环中的癌性细胞且可用于早期癌症诊断、预后、监测治疗、检测转移或其它用途。因为CTC为异质的，所以可对于指示侵袭性、增殖或其它因子的蛋白质生物标志物试验各个个别细胞。从全血富集CTC的典型方法产生富含靶CTC的细胞的悬浮液。主题装置、系统和方法用于例如使用利用细胞的有效沉降以使在被捕获并分析的输入悬浮液中的细胞数目最大化的方法来分析这种细胞悬浮液。由主题装置、系统和方法分析CTC用于基础科学研究、管理轻微后遗症和癌症诊断。在某些情况下，有效沉降包括使用一种或多种或以下将样品成分定位在一个或多个孔中：对样品施加电场；施加密度梯度，使用例如但不限于微量吸管、喷嘴、光学镊子等定位装置将样品成分实体定位到微孔中；施加压力；施加磁力(例如，其中目标样品成分与磁化珠粒结合)；对流流动；使用尺寸不同的微孔进行尺寸选择性沉降；将含有细胞或细胞裂解物的样品的液滴定位到微孔中；其组合等。

主题装置、系统和方法还用于分析下游荧光活化的细胞拣选(FACS)。FACS可拣选上百万个细胞并将亚群分离为少到几百个细胞。然而，通过流式细胞仪进一步分析这种小亚群可能不合适，因为典型的流式细胞仪需要最少10,000个或更多个细胞。主题装置、系统和方法用于例如使用利用细胞的有效沉降或放置以使在被捕获并分析的输入悬浮液中的细胞数目最大化的方法来分析这种小细胞亚群。主题装置、系统和方法用于进一步分析用于包括在FACS拣选中的靶以及不是FACS拣选的一部分的靶的蛋白质靶的亚群。例如，来源于癌性人类或动物组织的原代细胞可通过FACS拣选以分离基于一种或多种表面标志物假定为癌症细胞的细胞亚群。主题装置、系统和方法随后可用于证实一种或多种表面标志物的存在并测定将进一步表征分离的亚群的状态和异质组成的例如细胞内蛋白质和转录因子的另外靶。

主题装置、系统和方法用于检测在样品中的核酸、蛋白质或其它生物分子。所述方法可包括检测在样品中的一组生物标志物，例如两种或更多种独特的蛋白质生物标志物。例如，所述方法可用于在生物样品中两种或更多种疾病生物标志物的迅速临床检测，例如，如可用于在受试者中的疾病病状的诊断或在受试者中的疾病病状的进行中的管理或治疗等。另外，主题装置、系统和方法可用于用于检测在样品中的分析物的方案，例如但不限于Western印迹等。

主题装置、系统和方法用于检测生物标志物。在一些情况下，主题装置、系统和方法可用于检测特定生物标志物的存在或不存在，以及在血液、血浆、血清或其它体液或分泌物，如但不限于尿液、血液、血清、血浆、唾液、精液、前列腺液、乳头抽吸液、泪液、汗、粪便、颊棉签、脑脊髓液、裂解物样品、羊水、胃肠液、生检组织等中特定生物标志物浓度的增加或降低。

生物标志物的存在或不存在或者生物标志物浓度的显著改变可用于诊断疾病风险、个体中疾病的存在或定制在个体中的疾病的治疗。例如，特定生物标志物或一组生物标志物的存在可影响给予个体的药物治疗或施加方案的选择。在评价潜在药物疗法时，生物标志物可用作例如存活或不可逆病状的天然终点的代替物。如果治疗改变与改良的健康直接相关的生物标志物，那么所述生物标志物可用作用于评价特定治疗或施加方案的临床益处的代替终点。因此，主题装置、系统和方法推动了基于在个体中检测的特定生物标志物或所述组的生物标志物的个人化诊断和治疗。此外，如上所述，本发明装置和系统的高灵敏性推动了与疾病相关的生物标志物的早期检测。由于在单一芯片上检测多种生物标志物的能力，以及灵敏性、可扩展性和使用简易性，本发明公开的微流体装置、系统和方法用于便携式和即时或近患者分子诊断学。

主题装置、系统和方法用于检测用于疾病或疾病状态的生物标志物。在某些情况下，主题装置、系统和方法用于检测用于表征细胞信号途径的生物标志物和用于药物发现和疫苗研发的细胞内通信。例如，主题装置、系统和方法可用于检测和/或量化在患病、健康或良性样品中生物标志物的量。在某些实施方案中，主题装置、系统和方法用于检测用于传染性疾病或疾病状态的生物标志物。在一些情况下，生物标志物可为分子生物标志物，例如但不限于蛋白质、核酸、碳水化合物、小分子等。

主题装置、系统和方法用于诊断测定，例如但不限于以下：检测和/或定量如上所述的生物标志物；筛选测定，其中以规则时间间隔试验无症状受试者的样品；预后测定，其中使用生物标志物的存在和/或数量来预测可能的疾病进程；分层测定，其中可预测受试者对于不同药物治疗的响应；效力测定，其中监测药物治疗的效力；等。例如，可经持续的时间，例如经几天、几周或几年检测并监测一种或多种生物标志物。可经持续的时间监测所述一种或多种生物标志物的存在和/或数量的改变。

主题装置、系统和方法还用于验证测定。例如，可使用验证测定来验证或证实潜在的疾病生物标志物为在多名个体中疾病存在或不存在的可靠指示物。用于主题装置、系统和方法的短测定时间可有助于增加以最小时间量筛选多个样品的通过量。例如，主题装置、系统和方法用于探测用于亲和试剂筛选的IEF分离介质。包括如本文所述的分离介质的高通量微流体装置可用以选择生物标志物同种型-特异性亲和试剂，例如特异性单克隆抗体。这类试剂可用于用于在临床蛋白质样品中存在的疾病特异性生物标志物同种型的ELISA测定。在一些情况下，可连续地或对于其高度特异性结合的多路(平行)能力筛选试剂。

主题装置、系统和方法还用于其中需要分离在样品中的一种或多种成分(例如，分析物)的多种不同应用中。在样品中的成分可基于多种不同分离技术分离，所述分离技术例如但不限于电色谱、电泳免疫测定、平衡分离(包括等电位和温度梯度聚焦)、胶束电动色谱、色谱变体、天然电泳和通过在变性条件下的蛋白质质量分离(例如，SDS-PAGE)。任何分离技术都可通过例如抗体(或变体)、凝集素、底物、配体、脂质、包覆颗粒或染料与后续分析物探测偶合。例如，基于用后续抗体探测进行的蛋白质定尺寸的分离提供集成的微流体Western印迹装置。

在一些情况下，主题装置、系统和方法可无需实验室实施设定而使用。与等效的分析研究实验室设备相比较，本发明装置和系统在便携式、手持式系统中提供可比较的分析灵敏性。在一些情况下，质量和操作成本低于典型的固定实验室设备。本发明系统和装置可整合至单一设备中，以使得所有测定步骤均可由单一设备执行，这些步骤包括分离、传递、标记以及检测目标分析物。例如，在一些情况下，并无单独设备用于分离、传递、标记以及检测目标分析物。另外，本发明系统和装置可在家庭环境中用于由未经医疗训练的人进行非处方药家庭试验以检测在样品中的一种或多种分析物。本发明系统和装置还可在临床环境中(例如，在床侧)用于快速诊断，或用于其中由于成本或其它原因而未提供固定的研究实验室设备的环境中。

试剂盒

本公开的实施方案的方面还包括被构造成在本文所述的方法中使用的试剂盒。在一些情况下，试剂盒包括如本文所述的装置，例如包括具有多个微孔的聚合物分离介质的装置。在某些实施方案中，试剂盒可包括被构造成包含装置的包装。所述包装可为密封包装，例如无菌密封包装。“无菌”意指基本上不存在微生物(例如，真菌、细菌、病毒、孢子形式等)。在一些情况下，包装可被构造成任选在气密和/或真空密闭下密封，例如不透水蒸气的包装。

本公开的方面另外包括还包括缓冲液的试剂盒。例如，所述试剂盒可包括缓冲液，例如电泳缓冲液、样品缓冲液等。在某些情况下，缓冲液为电泳缓冲液，例如但不限于Tris缓冲液、Tris-甘氨酸等。在一些情况下，缓冲液包括洗涤剂(例如，十二烷基硫酸钠，SDS)。

所述试剂盒还可包括另外的试剂，例如但不限于释放剂、变性剂、再折叠剂、洗涤剂、可检测标记(例如，荧光标记、比色标记、化学发光标记、多色试剂、酶联试剂、检测试剂(例如，抗生物素蛋白-抗生蛋白链菌素缔合的检测试剂)(例如如果没有多种分析物检测试剂(例如，第一分析物检测试剂和第二分析物检测试剂)，则以至少一种分析物检测试剂的形式)、校准标准、放射性标记、金粒子、磁性标记等)等。

在某些实施方案中，试剂盒可包括分析物检测试剂，例如如本文所述的可检测标记。可检测标记可与特异性结合对的成员缔合。合适的特异性结合对包括但不限于：受体/配体对的成员；受体的配体结合部分；抗体/抗原对的成员；抗体的抗原结合片段；半抗原；凝集素/碳水化合物对的成员；酶/底物对的成员；生物素/抗生物素蛋白；生物素/抗生蛋白链菌素；地高辛/抗地高辛；DNA或RNA适体结合对的成员；肽适体结合对的成员；等。在某些实施方案中，特异性结合对的成员包括抗体。所述抗体可特异性结合在与分离介质结合的分离的样品中的目标分析物。例如，可检测标记可包括标记的抗体(例如，荧光标记的抗体)，其特异性结合于目标分析物。

除以上组分以外，本发明试剂盒还可包括关于实施本发明方法的说明书。这些说明书可以多种形式存在于本发明试剂盒中，所述形式中的一种或多种可存在于所述试剂盒中。可提供这些说明书的一种形式为在例如在其上印刷信息的一张或多张纸的合适介质上、在试剂盒的包装中、包装插页中等的印刷信息。另一方式将是计算机可读取介质，例如CD、DVD、Blu-Ray、计算机可读取存储器等，信息已经记录或储存在其上。可存在的又一方式为网站地址，其可经由互联网用以在移送位点处存取信息。任何常规的方式均可存在于试剂盒中。

如可由上文所提供的公开内容所了解，本发明的实施方案具有多种应用。因此，本文所提供的实施例出于说明目的而提供并且并不意图以任何方式解释为限制本发明。本领域的技术人员将容易地识别多种非关键性参数，所述参数可能发生改变或修改以产生基本上类似的结果。因此，提出以下实施例以便向本领域的技术人员提供如何制备和使用本发明的完全公开内容和描述，并且不意图限制本发明人看待其发明的范围，也不意图表示以下实验为所进行的全部或仅有的实验。已经努力确保关于所用数字(例如，量、温度等)的精确性，但一些实验误差和偏差应加以说明。除非另外指示，否则份为质量份，分子量为质均分子量，温度以℃计，并且压力为在大气压下或接近大气压。

实施例

实施例1

经由感光聚丙烯酰胺微图案化进行的单细胞免疫印迹

概述

本公开的实施方案提供在单个仪器中单细胞蛋白质表达的快速定量分析。实施方案包括单细胞免疫印迹的微流体方法，其包括将单细胞捕获到用大约为单个细胞尺寸数量级的孔微图案化的薄感光聚丙烯酰胺片材中。以单显微镜载玻片格式，使用单细胞印迹来进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、用SDS去除进行蛋白质固定(印迹)和随后抗体探测。微流体设计的可称量高通量性质支持单细胞免疫印迹适合约10,000个细胞通量/载玻片和适合迅速的3小时测定实施。该方法还可用于其它免疫印迹测定(例如，天然、DNA-蛋白质、RNA-蛋白质)和除抗体外的试剂(例如，适体、纳米抗体、凝集素、蛋白质)。实施方案还可用于单细胞或多细胞的测定。在某些实施方案中，可光图案化(蓝光)和光反应性(紫外光)聚丙烯酰胺凝胶用于具有限定堆叠界面的SDS-PAGE分离基质和在简短的UV转换之后具有高捕获效率(>75％)的蛋白质固定基质两者。在一些情况下，分析物只是在施加紫外光之后固定在分离介质中，且因而不需要阻断步骤。在下文讨论的实施例中，单细胞免疫印迹测定用于神经干细胞分析，显示出了给定的目标分析物40,000个蛋白质分子数量级的灵敏性。

在某些实施方案中，将细胞针对一系列蛋白质分化标志物以数以千计的细胞/小时测定时间(总测定时间小于2小时)的通量进行免疫印迹。显微镜载玻片格式与微阵列扫描检测集成，使得能够在每细胞10²-10⁶个拷贝的浓度范围内4-plex校准检测标记物。

单细胞蛋白质印迹可将样品需求从典型蛋白质印迹工艺流程的10,000个细胞以上范围降低到单细胞灵敏性。在一些实施方案中，该技术分离单细胞的蛋白质成分以及将其量化，从而提供与诸如流式细胞术、单细胞转录组学和全细胞成像技术的标准方法相匹敌的性能。从蛋白质分离提取分子量信息使得能够分析蛋白质-蛋白质相互作用。

方法

用于蛋白质分离和从单细胞捕获的具有可调谐孔隙度的双频带可调谐感光捕获凝胶(PACTgel)

使用用于单细胞免疫印迹的玻璃显微镜“开放式凝胶”。薄(约30微米)的稠聚丙烯酰胺凝胶通过化学或光化聚合在甲基丙烯酸酯官能化载玻片和SU-8-硅上微柱模具之间的界面处制造。微柱通常高为30微米和直径为20微米。所制造的凝胶从硅模具脱离以产生用充当单细胞的容器的微孔点缀的薄聚丙烯酰胺片材。聚丙烯酰胺也是感光的且包括具有可调谐孔隙度的双光谱带感光蛋白质捕获凝胶(PACTgel)分离和印迹聚合物。使用微流体和官能聚合物，从细胞沉降到基于重量分离变性蛋白质分析物(SDS-PAGE)到用荧光标记的一级抗体和二级抗体免疫印迹的测定步骤在聚合物层内在约3小时内进行。基于聚丙烯酰胺的PACTgel支架使用核黄素驱动的光致聚合策略构造，所述策略保存凝胶的光谱独特性紫外光响应捕获功能。光化学制造的PACTgel使用蓝光图案化。还在PAGE分离之后，利用经由紫外点光源施加的45秒UV暴露时间对PACTgel的定量蛋白质分析物捕获进行优化(对于所有分析物，捕获效率为约30％)。因为凝胶的二苯甲酮官能化光活化特性，所以在蛋白质固定之后不需要单独的阻断步骤。多达4种蛋白质分析物物质的同时探测用光谱多路二级抗体检测进行。

单细胞免疫印迹测定设计

聚丙烯酰胺凝胶层针对包括以下的若干功能作用工程化：1)经由基于重力的沉降以50％或更大的占位率(occupancy)捕获到适合单细胞捕获的微孔中，2)裂解并将溶解的蛋白质内含物约束在皮升标度的注射体积内，3)相对于并通过微孔的壁堆叠蛋白质内含物，4)在凝胶基质内筛分蛋白质条带，5)在凝胶支架内经由通过蛋白质交叉反应性二苯甲酮基团的共聚介导的高效紫外光触发的捕获过程固定蛋白质，和6)荧光凝胶内基于抗体的探测。

使用该平台，在通过中间状态向神经元和神经胶质终点的体内分化期间追踪关键大鼠神经干细胞标记物(即，巢蛋白和sox2)的表达。一系列亚群动力学用来自单细胞免疫印迹的标志物水平的绝对定量解析，使得能够剖析在分化过程中的蛋白质组学异质性。

详细方案

该方案描述在1"x 3"显微镜载玻片芯片上使用穿孔的聚丙烯酰胺片材的用于单细胞免疫印迹的制造和实验程序。所使用的材料和设备：

·得自ArrayIt的甲基丙烯酸酯官能化载玻片(产品编号SMRY3；Sunnyvale,CA)。

·任选的：得自Arrayit的8x 2孔密封圈杂交盒(产品编号AHC1x16)。

·具有驱动器(LEDD1B)和15V电源(TPS001)的瞄准蓝470nm LED光源(M470L2-C1)的ThorLabs(Newton,NJ)。

·用于载玻片孵育的小托盘。这些托盘由例如细胞培养瓶的基质制成。

·标准凝胶电泳电源，例如BioRad PowerPac HV(Hercules,CA)。(例如，用以操作整个芯片的>50mA的电源)。

·Hamamatsu UV点光源(San Jose,CA)。

·用于分离和读出图像的荧光显微镜。

试剂(除非在表1中另外指出，否则所有百分比都为w/v)：

方案(任选的终止点由\STOP"指示)：

1.凝胶制造

(a)从在SU-8中制造具有所需柱几何形状的硅晶片开始。

(b)将晶片在真空中紧挨着含有2ml二氯二甲基硅烷(DCDMS)的小皮氏培养皿硅烷化60分钟。将晶片用水冲洗并使用氮气流干燥。

(c)将甲基丙烯酸酯官能化载玻片放置到在柱结构之上的晶片上，其中被处理侧向下。

(d)制备PACTgel前体溶液并使其脱气。

(e)将洗涤剂和引发剂加到PACTgel前体中，混合并在完全润湿边缘以防止气泡夹带之后从载玻片的一个短侧稳定地注入。

(f)在上样之后，将载玻片轻轻地挤压以从间隙中挤出过量的前体溶液并保证在晶片上的柱与载玻片接触。

(g)蓝色LED朝下并成一定角度以从上方照射整个载玻片。将载玻片以约470lux的局部强度照射7.5分钟。

(h)在工作台上在LED关闭的情况下使聚合继续10-15分钟以上。

(i)用1ml移液管沿着载玻片的边缘施加2ml PBS。这有助于从晶片上提起载玻片。

(j)使用锋利的刀片将载玻片从硅晶片上撬开，将载玻片从一个短边缘提起。

(k)使用显微镜检查孔完整性并将载玻片浸在PBS中，凝胶侧向上，直至沉降细胞。

终止

2.细胞沉降(图6)

(a)将细胞再悬浮在PBS中并计数。在某些实施方案中，最佳孔填充在约1-3x10⁶个细胞/毫升下发生。

(b)将载玻片从PBS浴中移出，过量的液体通过引流到一角上除去并将载玻片放置在大的干燥皮氏培养皿上。施加1-1.5ml细胞溶液并孵育5-10分钟。使用显微镜定期检查细胞沉降。

(c)将皮氏培养皿以10-20°角度倾斜并使用吸管或轻微的真空从下边缘移出细胞溶液。

(d)通过将1ml等分试样(2-3次)施加到升高的边缘并在轻微真空下从下边缘除去而轻轻地洗涤载玻片。检查载玻片表面的散落的细胞并在载玻片相对清洁时进行测定。

(e)将1ml PBS施加到载玻片的一个边缘，使得其散布在载玻片的大致一半上，且通过从一个边缘降低将清洁的平面载玻片施加到顶部。随着载玻片降下，PBS均匀地散布在间隙之间，且过量的PBS从边缘流出。

(f)将过量的PBS擦去。

(g)整个载玻片在亮视野下使用4x放大倍数、1x 1像素混合(binning)成像，以使得能够随后计数孔占位率。

(h)除去顶部载玻片且立即进行以下步骤以防止载玻片干燥。

3.裂解和分离(图6)

(a)将细胞载玻片放置在具有在载玻片的各边缘的长度上运行的铂电极的开放式干燥电泳皿中，在短边缘使用凡士林以将载玻片暂时粘着到皿上。

(b)将皿放置在显微镜上的透明底部台上。

(c)在聚焦在荧光细胞上之后，将8ml N2吹扫的裂解/EP缓冲液倾注在整个载玻片上并靠近电极。

(d)观察细胞裂解作用(约10秒)，随后施加200-250V并观察荧光蛋白质迁移。

(e)停止电场并经由Hamamatsu供给距约75mm的距离施加紫外光约45秒以捕获蛋白质条带。功率为约40mW cm²。

(f)将载玻片从EP皿移出并放置在具有PBS的40ml锥形中并在4℃下储存，直至探测(在分离和捕获之后可进行至多达1周或更久)。

终止

4.免疫印迹(图6)

(a)将抗体以高浓度施加以使在含有0.1％Tween(TBST)和2％BSA的TBS(100mM tris pH 7.5+150mM NaCl)中从聚丙烯酰胺层(约10倍稀释或约0.6μM)排除最小化。

(b)将抗体用抵靠平面玻璃晶片的载玻片在由60μm SU-8垫片形成的间隙(约140μl抗体溶液)中孵育或如果多种靶待探测的话，则使用ArrayIt微阵列杂交盒(约40μl抗体溶液/盒孔)孵育。孵育时间为约1小时。

(c)将载玻片在探测之间在TBST浴(无BSA)中洗涤10-20分钟。

(d)将芯片通过在荧光显微镜上或使用微阵列扫描器平铺暴露而成像。

实施例2

引言

理解蛋白质介导的细胞信号传导和分化过程可通过捕获对大类群中的单细胞的响应异质性来促进。在标准显微镜载玻片上使用单细胞蛋白质印迹进行实验，在<4小时的过程中对于>6种蛋白靶/印迹实现103-104个分子检测限值。开放的微流体聚丙烯酰胺微孔阵列能够实现重力驱动的捕获单细胞到聚丙烯酰胺微孔阵列中，其能够实现UV引发的蛋白质捕获。对于约2,000个单细胞/载玻片进行细胞在微孔内的大规模裂解、蛋白质物质的电泳分离、印迹和特殊靶的抗体介导的检测。测定和装置设计的物理原理描述如下。进行实验以施加单细胞蛋白质印迹到两个动态过程：在刺激和分化时标上的神经干细胞响应。本文公开的装置和方法用于高通量分析蛋白质信号传导，所述蛋白质信号传导由于仅对基于抗体的检测的依赖性或者因需要分析细胞的汇集类群的灵敏度限值而可能难以使用典型的现有方案检测。

本公开的装置和方法还用于研究在包括组织和有机体发育、癌症、对医药的响应和免疫反应的细胞过程中的异质性。例如，本文公开的装置和方法用于研究细胞反应和适合测定在大类群中的单细胞的靶向蛋白质测量工具。本发明的装置和方法用于能够测量在细胞类群中的细胞间异质性的高特异性蛋白质测定。所述装置和方法可用于其中通过蛋白质印迹单独地评价数以千计的细胞的测定。蛋白质印迹组合了蛋白质电泳(以报道分子量)且随后用可检测探针标记(以产生探针-靶相互作用)，使得所述测定可用于在复杂背景中的半定量蛋白质分析。

进行实验以通过经数分钟到数天的响应时标研究神经干细胞模型系统的异质和动态蛋白质表达和磷酸化响应来研究多能干细胞响应体外均质刺激而分化成多组细胞谱系。

方法

细胞培养

将神经干细胞(NSC)从成年雌性Fisher 344大鼠的海马(hippocampi)中分离并在涂覆有10μg/mL多鸟氨酸(P3655,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和5μg/mL层粘蛋白(23017-015,Life Technologies,Foster City,CA)的组织培养物处理过的聚苯乙烯板上培养。将NSC在补充有N-2(17502-048,Life Technologies)和20ng/mL重组人类FGF-2(100-18,PeproTech,Rocky Hill,NJ)的1:1DMEM/F12(11039-021,Life Technologies)中培养，并在80％融合度下使用accutase(A11105-01,Life Technologies)次代培养以便细胞脱离。

通过稳定的逆转录病毒感染产生EGFP NSC细胞系。将逆转录病毒载体pCLPIT-GFP包装并将纯化的病毒在NPC上滴定。高度表达EGFP NSC在感染复数为3(MOI＝3)的情况下感染并在图2中分析，而低度表达EGFP NSC在MOI＝0.5下感染并用于所有其它研究中。稳定的细胞系通过在含有0.3μg ml^-1嘌呤霉素(P8833,Sigma-Aldrich)的培养基中选择历时72小时获得。

用于scWestern印迹EGFP表达研究的EGFP NSC如对于未感染的NSC所述那样来培养。对于scWestern印迹信号传导研究，将EGFP NSC FGF饥饿16小时。将细胞用accutase脱离并通过scWestern印迹分析悬浮液(参见下文的单细胞免疫印迹测定)。将用于scWestern印迹分化研究的EGFP NSC在补充有0.5ng/mL FGF-2、1μM视黄酸(RA,BML-GR100,Enzo Life Sciences,Farmingdale,NY)和1％胎牛血清(FBS,SH3008803,ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)的DMEM/F12/N2中培养0-6天。在所需分化时间之后将细胞用胰蛋白酶EDTA脱离(25-053-CI,Corning Cellgro,Manassas,VA)并分析(注意：细胞不是在微孔内分化；参见下文的单细胞免疫印迹测定)。对于相关的流式细胞术、蛋白质印迹和免疫细胞化学实验，参见验证测定。

蛋白质和试剂

15μm荧光聚苯乙烯微球来自Life Technologies(F-8844,Foster City,CA)。Alexa Fluor 488-标记的纯化的卵清蛋白和牛血清蛋白也来自Life Technologies(O34781,A13100)。用于单细胞免疫印迹校准的纯化的标准物为：来自牛脑的β-微管蛋白(TL238,Cytoskeleton,Denver,CO)、His标记的重组EGFP(4999-100,BioVision,Milpitas,CA)、重组人类pERK1(ab116536,Abcam,Cambridge,MA)。这些纯化的标准物的等分试样使用蛋白质标记试剂盒根据供应商说明书(A-10238,Life Technologies)用Alexa Fluor 568标记以便测定在间接校准实验中的分配系数(参见下文的单细胞免疫印迹校准)。

纯化的His标签的Dronpa在使用pET His6烟草蚀刻病毒(TEV)连接酶独立克隆(LIC)克隆载体2BT(EMD Millipore,Billerica,MA)转化的Rosetta感受态细胞中表达，在2YT培养基中在37℃下生长到OD600为0.5，用0.5mM IPTG诱导并在收获之前在37℃下再生长2.5小时。将细胞通过在4℃下以5,000rpm离心15分钟沉淀且将沉淀再悬浮在补充有蛋白酶抑制剂(25mM HEPES pH 7.5、400mM NaCl、10％甘油、20mM咪唑、1μg/ml亮抑酶肽和胃酶抑素、0.5mM PMSF)的Nickel缓冲液A中。将细胞使用Avestin C3匀浆器(Ottawa,ON,Canada)在15,000psi的压力下裂解。细胞碎片在15,000rpm下沉淀30分钟。将澄清的裂解物上样到5ml HisTrap FF Crude柱(GE Healthcare,San Francisco,CA)上，并将未结合的材料用Nickel缓冲液A洗掉。将结合的蛋白质用10CV梯度的至多400mM在Nickel缓冲液A中的咪唑洗脱。在503nm处以及在280nm处监测洗脱材料的吸收以帮助汇集靶蛋白质。将含有dronpa的馏分汇集并脱盐到IEX缓冲液A(50mM磷酸钠，pH 6.5)中。将脱盐的蛋白质上样到5ml SP HP离子交换柱(GE Healthcare)上且将未结合的材料用IEX缓冲液A洗掉。将结合的材料用20CV梯度的多达1M在IEX缓冲液A中的NaCl洗脱。将含有dronpa的馏分汇集并通过分析尺寸排阻色谱在于25mM HEPES、400mM NaCl、10％甘油、1mM DTT中平衡的Superdex200 5/150柱(GE Healthcare)上测定聚集。最后将样品脱盐到储存缓冲液(50mM磷酸钠pH 6.5、150mM NaCl、10％甘油、1mM DTT)中。

所使用的抗体试剂的细节列在对应于scWestern、常规蛋白质印迹和免疫细胞化学测定滴定的方法章节中。

N-[3-[(4-苯甲酰基苯基)甲酰氨基]丙基]甲基丙烯酰胺(BPMAC)根据标准方案经由在催化三乙胺存在下4-苯甲酰苯甲酸的琥珀酰亚胺基酯与N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐的反应内部合成。

微孔scWestern固体载体的制造

SU-8微柱通过标准软光刻方法在机械级硅晶片上制造。根据生产商准则将SU-8 2025光阻(Y111069,MicroChem,Newton,MA)旋转到(典型地)30μm的层厚度，并在以20,000dpi印刷有20μm环形图案特征的聚酯薄膜(mylar)掩模下以约40mW cm^-2暴露于365nm紫外光12秒。这些特征排列成沿分离的方向具有500μm的间距和在横向上具有190μm的间距的正方形构造。2×8个区块的14×30个特征(总计6,720个)间隔开9mm以匹配2×8个孔微阵列杂交盒(AHC1X16,ArrayIt Corp.,Sunnyvale,CA)的尺寸。也将以24mm间隔下跨越微柱阵列的长度的1mm厚的轨道图案化以在微柱的最高点处支撑玻璃固体载体。在暴露并使用SU-8显影溶液(Y020100,MicroChem)显影之后特征的均匀性通过光学轮廓测定法验证。在微柱区块内所测量的特征高度和直径分别为30.30±0.15μm(±SD,n＝4个微柱)和20.52±0.68μm(±SD,n＝4个微柱)。在阵列全长上隔开的区块的高度和直径测量方面的区块间CV分别为1.1％和5.2％(n＝3个微柱)。将晶片通过真空蒸气沉积2ml疏水硅烷二氯二甲基硅烷(DCDMS,440272,Sigma-Aldrich)1小时而硅烷化，用去离子水彻底洗涤并在使用前立即在氮气流下干燥。

将平面玻璃显微镜载玻片(48300-047,VWR,Radnor,PA)硅烷化以根据标准方案确立甲基丙烯酸酯官能团的自组装表面单层。将硅烷化的载玻片面向下放置到微柱晶片上并与SU-8轨道和微柱特征手动对准。凝胶前体溶液为在用HCl滴定到pH 8.8的75mM tris缓冲液中的8％T(重量/体积的总丙烯酰胺)、2.7％C(重量/重量的交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，来自30％T、2.7％C储备液(A3699,Sigma-Aldrich)；3mM BPMAC，来自在DMSO中的100mM储备液、0.1％SDS(161-0301,BioRad,Hercules,CA)、0.1％Triton X-100(BP151,Fisher,Hampton,NH)、0.0006％核黄素5’磷酸盐(F1392,Sigma-Aldrich)、0.015％过硫酸铵(APS,A3678,Sigma-Aldrich)和0.05％四甲基乙二胺(TEMED,T9281,Sigma-Aldrich)。对于细胞在罗丹明标记的scWestern凝胶中的共焦成像，前体包括来自在DMSO中的100μM储备液的3μM荧光单体甲基丙烯酰氧基乙基氨基硫羰基罗丹明B(23591,Polysciences,Warrington,PA)。将前体混合物超声处理并在加入洗涤剂(SDS、Triton)和聚合引发剂(核黄素、APS、TEMED)之前立即真空脱气(Aquasonic 50D,VWR)1分钟。然后使用标准200μl吸管将前体注入在载玻片和硅晶片之间的间隙中。在使前体芯吸穿过间隙约30秒之后，将载玻片暴露于来自安装在载玻片上方的瞄准的470nm LED(M470L2-C1,Thor labs,Newton,NJ)的在500lux下的蓝光7.5分钟(高级测光表，840022,Sper Scientific,Scottsdale,AZ)。使聚合再继续11分钟。将凝胶制造的载玻片在其边缘处用2ml磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH 7.4(21-040,Corning,Tewksbury,MA)润湿并使用刀片从晶片上撬开。在使用前可将制造的载玻片在4℃下在PBS中储存至多达2周，而没有筛分和光捕获性质损失。

单细胞免疫印迹测定

将制造的载玻片从PBS中移出并通过重力将过量的液体引流到一角，并使用kimwipe(Kimberly-Clark,Irving,TX)吸收。将1-2ml细胞悬浮液均匀地施加在载玻片的表面上并使其沉降在100×100mm皮氏培养皿内的平坦表面上。沉降时间在5-30分钟之间变化，其中微孔占位率通过亮视野显微术监测，直至达到大约40-50％的单细胞占位率。间歇地，每2-5分钟轻轻移动皮氏培养皿10秒足以确保细胞通过细胞在凝胶表面上滚动而进入微孔。在沉降之后，将载玻片从一个短边缘提起10-20°角度以除去过量的细胞培养基，且在载玻片的表面上的细胞通过轻轻移液4-51ml等分试样PBS到载玻片表面的抬起边缘而除去，其中过量的缓冲液通过真空从下边缘除去。将载玻片放平并通过施加1ml PBS到载玻片上准备细胞计数。将第二平面玻璃载玻片从一个短边缘到另一短边缘施加到PBS层以防止气泡夹带，并降低以形成载玻片“夹层”。在夹层内的微孔使用亮视野显微术在4×放大倍数下(Olympus UPlanFLN,NA 0.13)使用50ms暴露时间在1×1像素混合(pixel binning)下和导引机械台(装备有iXon+EMCCD照相机，Andor,Belfast,UK；机动化台，ASI,Eugene,OR；和快门汞灯光源，X-cite,Lumen Dynamics,Mississauga,Ontario,Canada；由MetaMorph软件，Molecular Devices,Sunnyvale,CA控制的Olympus IX71倒置荧光显微镜)的预置位置表成像。所有6,720个特征都可在约4分钟内成像。

在细胞计数之后，顶部载玻片通过轻轻滑过凝胶层而从夹层除去。随后立即将具有沉降的细胞的scWestern载玻片转移到由3mm厚的有机玻璃塑料制造的定制60×100mm水平电泳槽中。将铂丝电极(0.5mm直径，267228,Sigma-Aldrich)沿腔室的长边缘放置且用接线夹与标准电泳电源(250/2.5型，BioRad)对接。将载玻片使用石油膏暂时粘着到腔室的底面上。将10ml的由于12.5mM tris、96mM甘氨酸pH 8.3中(0.5×，来自10×储备液，161-0734,BioRad)的0.5％SDS、0.1％v/v Triton X-100、0.25％脱氧胆酸钠(D6750,Sigma-Aldrich)组成的改良的RIPA裂解/电泳缓冲液倾注在载玻片上以将细胞裂解。该缓冲液补充有1mM氟化钠和原钒酸钠用于磷蛋白印迹。裂解作用在电场关闭下进行10秒，接着施加200V(E＝40V cm^-1)约30秒。与单EGFP表达NSC的分离在10×放大倍数下使用对于EGFP优化的滤镜套装(XF100-3,Omega Optical,Brattleboro,VT)、4×4照相机像素混合、250ms暴露时间实时监测。在分离之后，将载波片立即使用UV汞弧灯(Lightningcure LC5,Hamamatsu,Bridgewater,NJ)从上方暴露45秒，所述UV汞弧灯被引导通过具有悬置在载玻片上方约10cm处的内联紫外线滤镜(300-380nm带通，XF1001,Omega Optical)的Lumatec系列380液体光导，其中在载玻片表面处的UV功率为约40mW cm^-2(320-400nm紫外辐照计；C6080-365,Hamamatsu)。

在分离并光捕获细胞内含物之后，将载玻片使用10ml的改良的RIPA缓冲液洗涤，接着用10ml TBST(用盐酸滴定到pH 7.5的100mM tris、150mM NaCl、0.1％Tween 20,9480,EMD Millipore)洗涤，各洗涤10分钟。在成功免疫探测之前，可将载玻片在4℃下在TBST中储存至少1周。

在FGF刺激实验中，在每孔细胞计数和裂解/电泳步骤之间通过将1ml 20ng/ml FGF-加标介质施加到载玻片表面上持续所需的刺激时间来刺激细胞。随后在裂解/电泳之前立即将过量的培养基从载玻片表面上引流。

纯化的蛋白质的scWestern印迹

纯化的蛋白质使用与针对单细胞方案类似的方案测定。凝胶载玻片用在改良的RIPA缓冲液中的纯化的蛋白质孵育30分钟，将其浸没在新鲜的改良的RIPA中5分钟，并与第二载玻片“夹层”以捕获在凝胶层内的蛋白质。如在单细胞测定中那样，对载玻片夹层进行电泳、UV介导的蛋白质捕获、洗涤和探测；在捕获步骤之后除去顶部玻璃层。

载玻片探测、成像和剥离

载玻片通过在2×8孔微阵列杂交盒(AHC1X16,ArrayIt)中扩散性递送用一级抗体和荧光标记的二级抗体探测。

用于单细胞印迹的具有倍数稀释的一级抗体(除非另外指出)为：兔抗卵清蛋白(1:20,ab1221,Abcam)、山羊抗-GFP(1:20,ab6673,Abcam)、兔抗β-微管蛋白(1:20,ab6046,Abcam)、兔抗波形蛋白(1:20,ab92547,Abcam)、兔抗-pERK1/2(1:40,Thr202/Tyr204,4370,Cell Signaling,Danvers,MA)、兔抗-ERK1/2(1:20,4695,Cell Signaling)、兔抗-pMEK1/2(1:40,Ser217/Ser221,9154,Cell Signaling)、兔抗-MEK1/2(1:20,9126,Cell Signaling)、山羊抗-SOX2(1:20,sc-17320,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)、小鼠抗巢蛋白(1:20,611658,BD Biosciences,San Jose,CA)、山羊抗-GFAP(1:20,ab53554,Abcam)、小鼠抗βIII-微管蛋白(1:20,T8578,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。二级抗体为来自Life Technologies的Alexa Fluor 488-、555-或647-标记的驴抗小鼠、兔或山羊IgG(A31571、A31573、A21447、A31570、A31572、A21432、A21202、A21206、A11055)，除了在图7中探测卵清蛋白使用Alexa Fluor 568-标记的山羊抗兔IgG(A-11011,Life Technologies)之外。所有都在与相应一级抗体相同的稀释因子下使用。

对于图7，将Alexa Fluor 488-标记的OVA和BSA的混合物分离并以在载玻片上一致的分离距离捕获在夹层载玻片构造中(在区块内探测的OVA带距孔唇(well lip)的距离：167±6.5μm，±SD，n＝6个印迹；在区块之间：164±3.8μm，±SD，n＝3个区块)。OVA物质使用特异性一级抗体和Alexa Fluor568-标记的山羊抗兔IgG二级抗体利用来自用于标记捕获的分析物的Alexa Fluor 488染料的单独的光谱通道探测。

将每个分离的区块用在补充有2％牛血清蛋白(BSA,A730,Sigma-Aldrich)的TBST中稀释到1:40至1:10(参见蛋白质和试剂)的40μl一级抗体溶液孵育1小时。将载玻片从杂交盒中移出并在10ml TBST中洗涤三次，每次洗涤15分钟(总共45分钟)。随后将载玻片类似地探测并用在补充有2％BSA的TBST中以1:20稀释的荧光标记的驴二级抗体洗涤。将载玻片在10ml DI水中洗涤最后一次持续5分钟，并在氮气流下干燥。使用具有400-550的PMT增益和30-100％的激光功率、对于最大动态范围优化的GenePix 4300A微阵列扫描器进行成像，而没有使免疫印迹荧光饱和。对于使用Alexa Fluor 488、555和647-标记的二级抗体的3-通道检测分别采用使用488nm激光、532nm激光和635nm激光的滤镜套装。488nm和532nm光谱通道的12.5mm直径发射滤镜来自Omega Optical(分别为XF3405和XF3403)；635nm通道采用嵌入式远红外的发射滤镜。

光谱渗透(bleed-through)低于中靶荧光谱线轮廓的噪音阈值，除了分别在图3和图4中共同探测ERK或β-微管蛋白(Alexa Fluor 555-标记的二级抗体)与EGFP(Alexa Fluor 488-标记的二级抗体)之外。将在图3d中ERK印迹受高于技术噪音的EGFP渗透影响的比度量自分析中弃去。在图4f中来源于类似地受EGFP渗透影响的β-微管蛋白印迹的比度量也被弃去。对于光谱渗透，没有荧光显微照片或导出数据组是荧光补偿的。

载玻片的剥离经由在由于用HCl滴定到pH 6.8的62.5mM tris中的2.5％SDS和1％β-巯基乙醇(M3148,Sigma-Aldrich)组成的加热到50℃的剥离缓冲液中孵育3小时来进行。在剥离之后，将载玻片在10ml TBST中洗涤三次，每次洗涤5分钟，并在4℃下储存在TBST中，直至再探测。发现该方法对于在剥离之前在干燥状态下载玻片的延长(约1个月)储存是稳健的。

单细胞免疫印迹数据分析

每孔细胞评分手动地或经由采用匹配阈值处理和颗粒分析的脚本的内部设计的定制软件基于在Imagej(http://rsbweb.nih.gov/ij/)中的细胞尺寸和圆度来进行，以在下游门控，从而在R中鉴定含有单细胞的微孔(http://www.r-project.org)。

为了量化自动化每孔细胞数评分的性能，计算精确度＝tp/(tp+fp)和灵敏度＝tp/(tp+fp)，其中tp为被评定为含有单细胞、实际上含有单细胞的孔的数目，fp为被评定为含有单细胞，但不含单细胞的孔的数目，且fn为被评定为不含单细胞、但实际上含有单细胞的孔的数目。精确度＝1意指所有孔都被评定为含有单细胞，实际上含有单细胞。灵敏度＝1意指实际上含有单细胞的所有孔都被被评定为含有单细胞。精确度和灵敏度度量分别为0.90±0.09(±SD，n＝在8个单独的载玻片上的420个孔的56个区块)和0.68±0.17，反映了在损失下游分析中包括的总孔数的情况下严格选择单细胞孔。

来自GenePix扫描器的荧光图像使用在Fiji(http://fiji.sc/Fiji)中的地标对应登记。定制脚本从来自各荧光图像的目标区域(ROI)的栅格中提取谱线轮廓。谱线轮廓为使用在点集之间的线性插值减去接近目标峰的边界的本底。数据质量控制通过视觉上考察由于外围谱线轮廓而标记的免疫印迹ROI来进行。明显受例如自动荧光微粒的存在影响的免疫印迹被从数据组中弃去，因为每孔零细胞印迹被不当地评定为高于技术噪音的不含β-微管蛋白加载控制信号的单细胞印迹。

将目标峰下总面积(AUC)(或由其导出的度量，诸如AUC比和校准AUC)，在适用的情况下使用函数AUCt＝arcsinh(AUC/F)转换，其中AUCt为arcsinh转换的值且F是指定从线性到对数样行为的转变的辅助因子。F的值通过根据F＝μones,below+3σones,below将其设置而优化，其中μones,below和σones,below为具有低于技术噪音阈值的AUC(或度量)的每孔单个细胞免疫印迹组的平均和标准偏差。技术噪音阈值T被设定为T＝μ零+3σ零，其中μ零和σ零为在给定实验中来自每孔零细胞免疫印迹的AUC或度量值的平均和标准偏差。在适用的情况下，标记具有在比度量的分子中低于T的AUC的免疫印迹以在作图时照此显示。将具有在分母中低于T的AUS的免疫印迹从数据组中弃去。

统计分析

单细胞印迹数据的非参数比较(仅单比较)使用Mann-Whitney U试验结合分别用于正态性和方差齐性的Shapiro-Wilk和Levine试验在SPSS v.21软件(IBM,Armonk,NY)中进行。

单细胞免疫印迹校准

直接和间接校准测定的概念综述和示意图提供在下文和图8中。

为了确定单细胞免疫印迹测定的线性动态范围和检测限值，使用两种方法来使用纯化的蛋白质将其校准(图2d及图8和10)。第一(“直接”)方法依靠对于用在标称浓度EGFP范围孵育的各孔在分离、捕获和探测之前立即直接测量在微孔中的EGFP浓度。将终点探针荧光相对于最初存在于相应微孔中的EGFP分子的数目作图在曲线上，通过相对于在与scWestern凝胶片材的厚度(30μm)相同的深度的微通道中进行的那些校准EGFP荧光测量结果来推断。第二(“间接”)方法不需要直接测量在微孔内存在的蛋白质分子，且作为替代，使用大斑点暴露以从游离溶液中捕获纯化的蛋白质，其中它们的凝胶浓度由分配系数测量结果推断(图9a-c)。最终结果为对于给定蛋白质的荧光探针读数相对于在尺寸大致为如果捕获的蛋白质来源于单细胞印迹条带而预期的尺寸的斑点内存在的蛋白质分子的数目的校准曲线。因此，可将浓度比可直接观察到的浓度低的蛋白质用于间接校准曲线中，因为给定蛋白质的凝胶浓度从标称溶液浓度和分配系数已知。

对于间接EGFP校准载玻片，验证抗体剥离的功效，显示出对于大多数校准范围(约10⁴-10⁶个分子)，在检测阈值下的残留信号(SNR＝3)，和高于该范围的SNR倍数降低>10(图2d和图10)。

对于EGFP的“直接”校准，将在补充有4μM BSA的改良的RIPA缓冲液中的8-等分试样稀释系列(40μl/等分试样)的EGFP(接近单细胞印迹中的总蛋白质水平)加到在ArrayIt杂交盒中的scWestern载玻片的单独孔中(图10)。如对于纯化的蛋白质印迹(参见纯化的蛋白质scWestern印迹)那样，用另一步骤将载玻片夹层并测定。在每个区块中的微孔亚组在电泳步骤之前立即使用导引在IX71荧光显微镜上的机械台的预置位置表对EGFP荧光成像(EGFP立方体，10×Olympus UPlanFLN NA 0.3物镜，200ms暴露时间，1×1像素混合)。在浓度范围上的分配系数根据K＝([EGFP]凝胶-[EGFP]凝胶,bg)/([EGFP]孔-[EGFP]孔,bg)由这些图像确定，其中[EGFP]凝胶和[EGFP]孔为在30μm深度的单独微流体通道中通过荧光校准确定的处于平衡的EGFP的凝胶内和孔内浓度(图9)。定制直通道微流体芯片使用标准湿式蚀刻方法在钠钙玻璃中制造(PerkinElmer,Waltham,MA)。在用EGFP溶液孵育之前，[EGFP]凝胶,bg和[EGFP]孔,bg对于scWestern载玻片的本底荧光校正。在各微孔体素中EGFP分子的数目也由这些数据估计，假设圆柱形微孔具有标称尺寸：20μm直径，30μm深度(9.4pl体积)。

“间接”校准通过捕获到scWestern凝胶片材并在缺乏电泳步骤的情况下探测在补充有4μM BSA的改良的RIPA中的给定纯化蛋白质的稀释系列来进行(图8和10)。斑点UV暴露经由10×物镜施加到在各微孔区块内载玻片的底侧上持续45秒，各载玻片在Olympus IX71荧光显微镜上穿过定制的UV-长波通滤镜套装(激发300-380nm，发射>410nm；XF1001,XF3097；Omega Optical)，在载玻片表面处的UV功率为约40mW cm^-2(320-400nm紫外辐照计；C6080-365,Hamamatsu)。以此方式捕获的纯化蛋白质的凝胶内浓度使用各蛋白质的Alexa Fluor 568-标记的等分试样自单独的分配系数测量结果确定(图9)。EGFP的间接校准对于与来自单细胞印迹实验的典型印迹EGFP条带的体素尺寸(面积45×45μm，深度30μm)相当的体素尺寸使用推断的凝胶内浓度报道了分子数。校对在间接校准数据中的探针AFU和SNR值的在缺乏校准标准的情况下由UV暴露的凝胶斑点的非特异性探测所引起的荧光本底。

确定在微孔内裂解期间的本体缓冲液速度

在裂解期间的本体最大流动速度(忽略矢量信息)在scWestern载玻片上倾注荧光微珠粒示踪的RIPA缓冲液(10⁵珠粒/ml)期间在10ms的暴露时间下通过广视野荧光显微术(4×物镜，EGFP滤镜套装)估计(图11)。速度由由于珠粒经过暴露时间在水平方向上移动引起的荧光条纹所得出，其中物镜聚焦在scWestern载玻片平面的中心上方约1mm处以观察本体流体行为。

COMSOL流体模型

在scWestern微孔中的流体流动以COMSOL Multiphysics 4.2a中模型化(图11)。COMSOL模型化显示，除了在靠近孔顶部的再循环漩涡附近之外，局部流体速度作为距在凝胶表面下面的微孔的垂直距离的函数单调性减小。在其下面，假定佩克莱特数(Peclet number)为1的4.4μm s^-1的临界局部流体速度经由Pe＝Lu/D确定，其中特征性长度L为微孔直径(20μm)，且u为局部流体速度。D＝kBT/6πμrH＝8.8×10^-11m²s^-1为作为低分子量模型分析物的EGFP的游离溶液扩散率，其中玻耳兹曼常数(Boltzmann constant)kB＝1.38×10^-23m²kg s^-2K^-1，温度T＝293.15K，水的动态粘度μ＝0.001kg m^-1s^-1，流体动力学半径rH＝0.595(Mw)^0.427＝2.43nm(Mw＝27kDa，EGFP的分子量)。

在4.4μm s^-1的该临界速度下的等速曲线对于在z方向上分别低于其(Pe<1)和高于其(Pe>1)的微孔坐标大致限定在裂解缓冲液倾注期间扩散和平流占主导的质量输送状态的区域(图11)。

将在微孔之上的本体流动模拟为水在横截面100×100μm的正方形通道中的稳态层流。将通道的顶部和侧壁设定为滑移边界条件。将通道的底壁和微孔壁设定为没有滑移。将入口速度设定为0.0087ms^-1以实现0.013ms^-1的最大本体流动速度。将出口压力设定为0。微孔再循环流动通过颗粒迹线显现。

流式细胞术

对于用于EGFP表达的流式细胞术，将EGFP NSC和未感染的NSC用accutase脱离，通过在4％低聚甲醛中的悬浮液(P6148,Sigma-Aldrich)固定15分钟，且随后阻断并用流动染色缓冲液(具有1mg/mL皂苷的5％驴血清；D9663和47036,Sigma-Aldrich；在PBS中)透化15分钟。将细胞用在流动染色缓冲液中的山羊抗-GFP(1:100；对于产品细节，参见载玻片探测、成像和剥离)孵育1小时；接着用在流动染色缓冲液中的Alexa Fluor 555-标记的驴抗山羊IgG(1:100)孵育1小时。流式细胞术使用Millipore EasyCyte 6HT-2L进行。

常规蛋白质印迹

对于在图3中的信号传导研究，将EGFP NSC在6孔板中以2.5×105个细胞/孔接种。使细胞FGF饥饿16小时，用20ng/mL FGF孵育所需的刺激时间，并在含有蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂混合物(87786和78420,ThermoFisher Scientific)和10mg/mL PMSF(78830,Sigma-Aldrich)的RIPA缓冲液(50mM tris、150mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS，pH 8)中裂解。对于分化测定，将EGFP NSC在6cm皿中以5×105个细胞/皿接种。第0天分化的细胞在第二天裂解；将第6天分化的细胞在分化培养基(DMEM/F12/N2，0.5ng/mL FGF，1μM RA，1％FBS)中培养6天，随后裂解。将通过二辛可宁酸测定(23227,ThermoFisher Scientific)的相等总蛋白质浓度的细胞裂解物在SDS-PAGE凝胶上电泳分离并使用标准方法转移到硝酸纤维素膜上。将印迹在TBS中针对磷蛋白抗体用0.1％Tween-20(BP337,ThermoFisher Scientific)和3％BSA(A4503,Sigma-Aldrich)或针对所有其它抗体用5％脱脂奶粉阻断1小时。印迹在相同阻断缓冲液中用一级抗体探测过夜：兔抗-pERK1/2(1:2000)、兔抗-ERK1/2(1:1000)、兔抗-pMEK1/2(1:1000)、兔抗-MEK1/2(1:1000)、山羊抗-SOX2(1:500)、小鼠抗巢蛋白(1:1000)、山羊抗-GFAP(1:1000)、小鼠抗βIII-微管蛋白(1:2000)、兔抗-β-微管蛋白(1:500)；接着用适当的辣根过氧化物酶缀合的二级抗体孵育1小时：小鼠抗山羊HRP(1:5000,31400)、山羊抗小鼠HRP(1:10000,32430)、山羊抗兔HRP(1:10000,32460)，所有抗体都得自ThermoFisher Scientific。将蛋白质条带使用SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate(34076,ThermoFisher Scientific)检测且将印迹在ChemiDoc XRS+成像系统(BioRad)上数字成像。将印迹在3％乙酸、0.5M NaCl，pH 2.5的溶液中剥离10分钟，用0.5M NaOH中和1分钟，随后根据需要再探测。印迹密度测定法在ImageJ中通过测量减去本底的ROI强度来进行。

免疫细胞化学

对于在图3中的信号传导研究，将EGFP NSC在96孔板中以5x 103个细胞/孔接种。使细胞饥饿FGF并如对于常规蛋白质印迹所描述来刺激。对于在标准细胞培养条件下的分化测定，将EGFP NSC在24孔板中以4×104个细胞/孔接种并使其分化。对于scWestern微孔，将EGFP NSC在培养板中分化，悬浮适当天数，沉降到scWestern载玻片上，并用与用于培养板的工艺流程类似的工艺流程在ArrayIt杂交盒内加工。将细胞培养物和沉降的细胞用4％低聚甲醛固定15分钟，且随后阻断并用染色缓冲液(在PBS中具有0.3％Triton-X100的5％驴血清)透化30分钟。将培养物和细胞用在染色缓冲液中的一级抗体组合孵育24-48小时：兔抗-pERK1/2(1:200；对于产品细节，参见载玻片探测、成像和剥离)、小鼠抗-ERK1/2(1:50,4696,Cell Signaling)、兔抗-pMEK1/2(1:200)、小鼠抗-MEK1/2(1:25,4694,Cell Signaling)、山羊抗-SOX2(1:100)、小鼠抗-巢蛋白(1:200)、山羊抗-GFAP(1:500)、小鼠抗-βIII-微管蛋白(1:500)；接着用在染色缓冲液中的适当Cy3-、Alexa Fluor 555-和647-标记的驴抗小鼠、兔或山羊IgG二级抗体(1:250,Life Technologies；15-165-150,715-605-150,711-605-152,705-605-147,Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)孵育2小时，其中DAPI作为核复染剂(5μg/mL，D1306,Life Technologies)。细胞培养物使用Nikon Eclipse Ti倒置荧光显微镜(Nikon Instruments,Melville,NY)或ImageXpress Micro XL Widefield High Content Screening System(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)成像。微孔内细胞使用Olympus IX71显微镜成像(参见，单细胞免疫印迹测定)。

共焦图像在具有扫描场共焦光学器件(Prairie Technologies,Middleton,WI)的BX51W1显微镜(Olympus,Center Valley,PA)上获得并用Icy bioinformatics软件(Quantitative Image Analysis Unit,Institut Pasteur,Paris,France)分析。对于在图4c中在scWestern微孔中的分化细胞的共焦成像，使用兔抗-GFAP(1:500,ab7260,Abcam)；所有其它抗体试剂与所列出的那些相同。

免疫化学数据分析

对于在图3a中的信号传导研究，细胞经由定制ImageJ脚本使用阈值处理和颗粒分析鉴定以定位DAPI染色的核。将用于分析的单细胞分离并通过门控距最近邻域的距离和R中本底信号的均匀性来选择。通过将围绕每个单个细胞的减掉本底的75×75像素ROI的像素强度求和量化荧光。在各ROI中约50％的像素由本底信号组成，其为高斯分布。将具有最高像素计数的强度值用作平均本底强度且用于个别ROI的本底扣除。将噪音阈值设定为T＝3σbg，其中σbg为在各种实验条件下在荧光显微照片中本底信号强度的最大标准偏差。具有在分子中低于T的荧光的测量结果在作图数据中照此鉴定。具有在分母中的低于T的荧光的测量结果从数据组中弃去。

来自用于在图4中的分化实验的培养板和scWestern微孔中的ICC实验的荧光显微照片根据在ImageJ中任意确定的荧光阈值对于标志物表达手动评定。不同的盲法研究人员(blinded researcher)进行ICC计数和scWestern标志物表达分析。

结果

用于单细胞分析的scWestern印迹阵列的设计和表征

单细胞蛋白质(scWestern)印迹在涂覆有用成阵列的6,720个微孔微图案化的薄光可活化的聚丙烯酰胺(PA)凝胶的显微镜载玻片上进行(图1)。scWestern阵列包括在位于玻璃显微镜载玻片上的30μm-厚感光聚丙烯酰胺凝胶中图案化的数以千计的微孔(直径20μm，深30μm)。所述阵列包括针对通过软光刻法制造的SU-8光阻底版铸造的16个区块的14×30个微孔(图1a)。

微孔(20μm直径)在30μm厚PA凝胶相对于用SU-8微柱镶嵌的硅晶片聚合期间图案化(图1b)。为了允许数以千计的单细胞同时发生蛋白质印迹，将scWestern阵列和测定设计以致密阵列格式集成所有6个蛋白质印迹阶段并允许同时处置数以千计的细胞。三种特性支持scWestern阵列设计并形成单细胞蛋白质印迹能力的基础。

首先，与数以千计的微孔各自的本地化驱动形成对比，scWestern阵列是全球寻址的。对于细胞接种，使用被动的重力驱动的细胞沉降。单细胞的悬浮液沉降到scWestern阵列上，引起在5-10分钟的沉降时间内每个孔捕获0-4个细胞。对于1,000-1,800个细胞mm^-2载玻片面积(总计2-3.5×10⁶个细胞)的大鼠神经干细胞密度，观察在40-50％的孔中的单细胞(图12)。裂解沉降的细胞可用于随后的蛋白质电泳。为了使细胞全面地裂解，使用在scWestern阵列表面上的本体缓冲液交换。使用被改良以使细胞内蛋白质的溶解最大化，同时维持适用于随后电泳的传导性的RIPA缓冲液。RIPA缓冲液提供变性、非还原条件。细胞裂解在微孔中在2.6±1.5秒(±SD，n＝6个细胞)内观察到，接着观察在约10秒内自细胞提取的蛋白质(图1e)。倾注裂解缓冲液到开放微孔上不会从微孔中平流吹扫细胞内含物(图11)。在微孔中的流体流动在平均细胞裂解时间下模拟。模拟指示在最初约20μm的微孔深度中的再循环流动，其中几乎停滞的流动占据在微孔的底部10μm(佩克莱特数Pe<1)。随着沉降的细胞大部分被对流传输屏蔽，扩散可能主要造成蛋白质从孔中的损失。根据经验，在裂解期间测量到40.2±3.6％的组合EGFP蛋白质损失(±SD，n＝来自3个单独载玻片的3个微孔)。在图1e中，在各种二级抗体上的独特荧光染料能够实现多路靶分析(EGFP：Alexa Fluor 488-标记的二级抗体，βTUB：Alexa Fluor 555-)。经由化学剥离实现的剥离和再探测允许以二聚体形式的波形蛋白的scWestern印迹(VIM’,107kDa；Alexa Fluor 555-)。所有图的抗体稀释因子如先前在上文陈述。

其次，为了实现高密度微孔阵列布局，将阵列对于短分离距离蛋白质电泳优化。在scWestern阵列中，在微孔之间的间距确定有用的分离距离。为了在细胞裂解之后引发并驱动电泳，在浸没的scWestern载玻片上施加电场。所施加的电场驱动蛋白质穿过微孔壁并进入薄凝胶片材，这引发聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。为了理解在该结构中的PAGE性能，测定分配到微孔中的荧光标记的梯形蛋白质(27-132kDa，图1d)的模型溶液(图9)。

蛋白质在游离溶液和聚丙烯酰胺凝胶之间的分配-预期包括蛋白质的颗粒根据分配系数K在致密的水凝胶网络和游离溶液之间分配，K为cl与cb的比率，即局部凝胶和本体游离溶液蛋白质浓度的比率：

其中为聚合物网络的体积分数，a为蛋白质的斯托克斯-爱因斯坦半径(Stokes-Einstein radius)及af为聚合物纤维半径。从scWestern微孔平衡分配和重复注射荧光蛋白质dronpa的证明以及一系列目标纯化蛋白质靶的测量的分配系数示于图9中。

已知预期其因大(约150kDa)尺寸的探针抗体而加重的预测的分配效果，测定了探针抗体在80μm厚的scWestern凝胶层中平衡的时间(图13)。在凝胶涂覆的载玻片之上在游离溶液中孵育荧光标记的一级抗体超过30分钟，将载玻片在TBST中洗涤并定期成像。随着抗体通过扩散离开载玻片，载玻片荧光的指数衰减在大约5分钟的时间常数T下观察到，且大约4T＝20分钟的完全洗掉时间完全比得上估计的扩散时间t～x²/4D＝27分钟。凝胶层通常为30μm厚以通过更密切地匹配细胞的尺寸而使在微孔内多细胞的垂直堆叠的发生率最小化。预期大约4分钟的抗体扩散时间。

该实验指示探针抗体与scWestern凝胶的迅速平衡可在探测和洗涤期间实现，已知其微尺度厚度，虽然探针的溶液浓度增加以补偿以0.17的测量分配系数相对于其本体溶液浓度降低探针的凝胶浓度方面的分配效果(图9)。

在电泳期间，蛋白质相对于微孔凸缘的堆叠是在PAGE之后观察到的。在变性非还原PAGE条件下，验证了在蛋白质分子量和迁移距离之间的对数线性关系，正如对于完全变性且还原SDS-PAGE所预期的那样(R2＝0.97，图14)。观察到二聚体的分离，指示缓冲条件可适合分析蛋白质-蛋白质相互作用。获得中等PAGE性能；具有51±1.6％(±SD，n＝3次分离)的分子量差的蛋白质对可在约500μm的分离长度内解析。在scWestern阵列中，分析物迁移距离的变化系数在阵列的区块内和阵列的区块之间的4％内(图7)。

第三scWestern特性为使用小特征性长度用于反应和传输，这有助于蛋白质印迹测定的印迹和探测阶段。对于在PAGE之后的印迹阶段，蛋白质条带在PAGE之后经由简短地暴露于紫外光(45秒)而共价固定在感光PA凝胶中。二苯甲酮甲基丙烯酰胺共聚单体交联到凝胶中赋予了这种光捕获行为。与设计用来将物质固定到通道表面的方法不同，使用感光凝胶提供更有效的假均质3D反应环境。为了理解感光PA凝胶的捕获效率、线性度和物质特异性，我们首先测量以在NSC中表达的EGFP的表观捕获效率。在表达EGFP的NSC沉降、裂解和PAGE分析之后，将EGFP条带的固有荧光与其在UV诱导的捕获和洗涤之后的荧光相比较(图1e)。测量到η＝27.5±2.9％的捕获效率(±SD，n＝来自对单独4天的实验的6个印迹)，指示在先前对于天然PAGE确定的那些效率(对于未标记的野生型GFP，η＝1.8％)和对于变性/还原PAGE确定的那些效率(对于各种荧光标记靶，η>75％)PAGE之间在效率方面每天一致的捕获性能。裂解、分离和印迹步骤在75秒内完成。

固定的蛋白质分离的探测通过使抗体扩散到薄PA凝胶层中来进行。为了多路复用scWestern印迹，微孔阵列通常组织成由420个微孔组成的16个“区块”；布局与允许施加和分离独特探测溶液的微阵列垫圈相容。探测步骤由与45分钟缓冲液洗涤步骤交替进行的用一级抗体和荧光标记的二级抗体溶液连续1小时孵育scWestern阵列组成(图7)。抗体穿过薄PA凝胶的扩散动力学指示平衡时间常数<5分钟(图13)。在探测之后，scWestern阵列使用荧光微阵列扫描器成像，在具有3-plex靶定量的单个样品中有48个靶的scWestern印迹。

为了在各细胞中提供多路靶分析，对于再探测性能，使用化学剥离评价单细胞scWestern印迹。在单细胞印迹之后通过用强烈变性的缓冲液孵育scWestern阵列，实现与针对EGFP和β-微管蛋白的探针相关的信噪比大于10倍的降低(图1e)。另外，再探测在剥离的载玻片上的EGFP，取得与第一轮探测类似的SNR，但对于仅有二级抗体的对照，结果并非如此(图15)。

细胞类群的单细胞蛋白质印迹

进行实验以衡量scWestern印迹以便同时分析6,720个微孔。图2a显示表达EGFP的NSC对于βTUB(Alexa Fluor 647-标记的二级抗体)和EGFP(Alexa Fluor 555-,RFU：相对荧光单位)的一个区块总共5,040个同时发生的scWestern印迹中的420个。接种在微孔中的细胞的亮视野显微照片允许确定每个孔中的细胞数目。使用scWestern印迹测定来分析跨越单个载玻片的12个区块的表达EGFP的神经干细胞(NSC)。可能5,040个印迹中的4,128个印迹(82％)在尘粒和缺陷方面通过了半自动化门控。这些印迹中的1,608个(39％)对单细胞进行。两个靶EGFP和β-微管蛋白在同一scWestern阵列中探测，其中所得scWestern印迹读出强度索引经由手动评定确定的相关微孔占位率(细胞/孔)值(图2a和图16)。对于所有其它数据组使用对于每孔单个细胞装置的门控优化的自动化评定(参见，方法)。

空间微孔占位率连续观测值平均值为0-2.1个细胞/孔，其中平均值为1.1个细胞/孔(图2b)。在该度量下的空间变化是可能归因于在scWestern阵列中不均匀的细胞沉降密度。β-微管蛋白条带的总荧光随着每个孔中的细胞数目非线性地改变(图2b)。非线性归于非泊松细胞沉降统计学，这可能反映在微孔接种中的细胞尺寸偏差(图2d)。

细胞沉降统计学和对β-微管蛋白荧光分布的影响-Fano因子描述偏离泊松分布的每孔细胞沉降分布(对于泊松分布，F＝σ²/μ＝1；对于每孔细胞分布，F～0.55-0.75；图12)。缩减的每孔细胞分布可反映由微孔接种施加的尺寸偏差，这可降低β-微管蛋白沿每孔细胞轴的每个细胞贡献。平均起来，超过1个细胞/孔的每个额外的细胞分别使2和3个细胞/孔的原始细胞的β-微管蛋白贡献增加79％和42％；相对于预期标准偏差而言105％和36％的标准偏差基于简单相加相同的1个细胞/孔β-微管蛋白分布(即，μf,2’s＝μf,1’s+0.79μf,1’s，μf,3’s＝μf,2’s+0.42μf,1’s；SDf,2’s＝SDf,1’s+1.05(√2-1)SDf,1’s，SDf,3’s＝SDf,2’s+0.36(√2-1)SDf,1’s；其中μf,i’s和SDf,i’s分别为在i个细胞/孔印迹上β-微管蛋白荧光信号的平均值和标准偏差)。

β-微管蛋白荧光分布通过源于在分裂细胞同质类群中的转录和翻译的随机动力学模型的γ分布充分描述。所述模型假设泊松mRNA产生和指数分布的蛋白质裂解量，产生：f(x)＝(x^a-1e^-x/b)/(Γ(a)b^a)，其中x为总印迹荧光，a＝μp²/σp²(噪音项的倒数)，b＝σp²/μp(Fano因子)，且Γ为γ函数。scWesternβ-微管蛋白数据因此与对于在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的荧光蛋白质融合文库的γ分布单细胞蛋白表达谱一致。

scWestern印迹的分析性能

为了评价scWestern印迹的检测性能，测定由逆转录病毒转导产生的表达EGFP的NSC，因为预期在这些NSC中的EGFP表达是变化的(图2c)。对于scWestern印迹和流式细胞术测定而言，EGFP+细胞(高于技术噪音的印迹信号)分别为19％和26.7±1.1％(±SD，n＝3次工艺重复实验)，且动态范围是相当的。来自载玻片的稀疏接种区域的每孔零细胞scWestern印迹(印迹4,100-4,128个，0’s*)允许估计理想的技术噪音。与常规平板凝胶蛋白质印迹的约0.5-2μg各种一级抗体/泳道相比较，抗体消耗量为约32μg各抗体/scWestern阵列或4.8ng/单细胞印迹(图17)。

scWestern印迹的分析性能-1:20的抗体稀释因子用于为EGFP和β-微管蛋白提供在scWestern印迹荧光信号和试剂消耗量之间的可接受的平衡(图17)。在这些探测条件下，对于每个由6,720个scWestern印迹构成的载玻片，估计32μg各抗体的消耗量，或者4.8ng/印迹(与常规平板凝胶蛋白质印记的约0.5-2μg各一级抗体/泳道相比较)。

scWestern印迹动态范围根据技术噪音限值和最大细胞荧光强度评估。scWestern印迹技术噪音通过评估来自具有两个特征的印迹的信号来确定：(i)微孔不含细胞和(ii)微孔远离的确含有细胞的微孔。选择这些标准，因为来自最接近每孔有限个细胞测定的每孔零细胞印迹的scWestern信号为来自空间隔离的每孔印迹零细胞的scWestern信号(来自像素数归一化阈值μ零+3σ零＝2.5×10⁴至2.4×10⁵个分子)的约10倍。因此，在具有高动态范围靶的细胞类群中，在阵列密度和低拷贝数限值测量结果的保真度之间存在设计折衷。在测定技术噪音限值之后，发现理想的动态范围对于scWestern印迹和常规流式细胞术是相当的，分别处于2.9和2.6数量级下。

分析scWestern印迹荧光读出的线性度和灵敏度。确定EGFP的“直接”校准和β-微管蛋白、pERK和ERK靶的“间接”校准(图2d)。直接方法使在盖片封闭的微孔分离中纯化EGFP分子的数目与在免疫印迹之后的探测荧光相关；而间接方法使用分配系数测量结果来推断在来自点印迹型实验的印迹scWestern条带中的分子数目(图8和10)。校准结果适合EGFP(图2d)，指示来自在27,000个分子(45zmol)下的检测限值的2.2个数量级的线性动态范围。该检测限值将检测25,000个分子的“理想”噪音阈值匹配到10％内，指示检测限值由与荧光微阵列扫描器相关的技术噪音大致设定。27,000个分子的检测限值相对于microwestern阵列改进45倍，且相对于微流体蛋白质印迹改进3.2倍。有效抗体剥离在间接EGFP校准载玻片上验证(图2d)。β-微管蛋白、pERK和ERK的间接校准曲线显示在由产生SNR＝3的浓度扩展的各纯化标准物的推断凝胶内浓度方面超过1.3-1.8个数量级的线性度(R²＝0.94-0.98，图2d及图10和18)。另外，针对在将蛋白质从完整细胞转移到印迹条带所固有的约40倍稀释因子所校正的β-微管蛋白和ERK的估计的生理学浓度在两个曲线的线性区域内。

在FGF刺激NSC之后观察细胞间的信号异质性

使用scWestern阵列以监测在通过神经前体细胞促分裂原FGF刺激之后在大鼠NSC中的MAPK信号传导动力学。scWestern印迹以6个时间间隔经60分钟的时程进行(图3)。我们首先探测磷酸化的ERK(pERK)和MEK(pMEK)靶，接着再探测总ERK和MEK(图3a和图19)。β-微管蛋白和EGFP允许估计各靶的分子量。对pERK、ERK、pMEK和MEK观察到的分子量在其标称分子量的10％内。对于每对磷酸化靶读出和总靶读出，除了在103±3kDa(±SD，n＝3次分离)下的pERK轮廓中的假定非特异性条带之外，分离轮廓相对应。EGFP印迹来自在阵列中与其它印迹相同行中的细胞，它们各自来自相同的细胞。注意由pERK抗体鉴定的103kDa脱靶峰与ERK条带不符。该未知峰显示强烈的细胞间可变性，如通过常规蛋白质印迹确证，这与中靶pERK信号无关(图3b，及图20和21)。

与脱靶物质的非特异性探针结合可影响细胞内蛋白质的单细胞分析(例如，免疫细胞化学，ICC；流式细胞术)。根据该分析利害关系，进一步表征脱靶信号在ERK的scWestern印迹中的贡献。对总pERK探针信号的非特异性103kDa贡献包含平均13％(最大52％)的零时间点(未刺激的)scWestern印迹信号。然而，在对应于对FGF刺激的最大NSC响应的12分钟时间点下，103kDa脱靶pERK探针信号包括平均仅0.7％的总信号(最大18％)。在没有scWestern印迹的情况下，将难以检测在刺激时标中约103kDa脱靶峰对免疫荧光的贡献的细胞间可变性，因为在没有靶特异性敲低实验的情况下ERK磷酸化的基准水平不易于与常规测定中的脱靶探测区别开。

紧接着，将来自scWestern印迹的动态响应测量结果与常规平板凝胶蛋白质印迹相比较。常规蛋白质印迹和scWestern印迹在ERK和MEK的磷酸化动力学方面均显示出类似的趋势(图3c和图3d及图22)，并且在由scWestern印迹得到的未刺激细胞类群的响应和最大细胞类群响应之间的差别在统计上是显著的。

在FGF刺激实验中scWestern和ICC数据的统计分析(图3d,e)。在单细胞pERK:ERK和pMEK:MEK scWestern印迹数据中的12分钟最大值和20分钟最大值的倍数改变分布分别与相应时间零点分布显著不同(pERK:ERK:Mann-Whitney U＝537,n0分钟＝186,n12分钟＝57,P<0.001；pMEK:MEK:Mann-Whitney U＝6,884,n0分钟＝186,n20分钟＝236,P<0.001)。对于上下文，通过scWestern印迹得到的β-微管蛋白、ERK和MEK的平均倍数改变在细胞类群中在各刺激时间下<1.6(图23)。类似地，对于pERK:ERK和pMEK:MEK ICC数据在5分钟最大值和20分钟最大值下的倍数改变分布(图24)与相应时间零点分布显著不同(pERK:ERK:Mann-Whitney U＝123,n0分钟＝160,n5分钟＝115,P<0.001；pMEK:MEK:Mann-Whitney U＝6,653,n0分钟＝184,n20分钟＝223,P<0.001)。对于上下文，通过ICC得到的ERK和MEK的平均倍数改变在细胞类群中在各刺激时间下<1.5(图24)。

最大pMEK:MEK磷酸化趋势定量地与在最大值下的比率相对在零时间点下的那些比率的约3.5倍增加一致。对于两种测定格式，pERK:ERK比的响应大于对于pMEK:MEK比所观察到的响应，而最大值在常规印迹密度测定法和scWestern荧光成像之间在时间方面不同。在常规蛋白质印迹和scWestern印迹之间观察到响应滞后，这归因于在常规蛋白质印迹中在刺激和裂解之间的中间加工步骤。pERK:ERK分布对于0、5、30和60分钟时间点具有大于2.5的偏斜值(图23)，这指示稀有活化细胞对静止类群的贡献。这些由于组成型信号传导或瞬时FGF独立性偏移基准磷酸化状态而可能出现。对于pERK:ERK和pMEK:MEK磷酸化响应，偏斜值在12分钟刺激时间点最小(分别为1.1和0.1)，而pMEK:MEK比在12分钟刺激时间点正态分布(Shapiro-Wilk W＝0.98,n12分钟＝57,P＝0.58)，指示类群范围接近每个靶的最大磷酸化的最高限度。响应动力学和/或量值的细胞间异质性高，其中对于pERK:ERK和pMEK:MEK，12分钟时的四分位差分别为7.3和3.7倍变化单位。

为了将在对于FGF刺激的蛋白质信号传导响应中的细胞间异质性与常规单细胞技术相比较，我们通过高通量ICC分析了ERK和MEK磷酸化(图3e，及图24和25)。pERK:ERK轮廓与scWestern和常规蛋白质印迹数据两者极为类似。相反，pMEK:MEK响应在三次工艺重复实验中强烈减弱，最大平均倍数改变小于2，尽管在统计上是显著的。该不良响应可归因于pMEK抗体的不当核定位，这与pMEK/MEK28的预期细胞质定位冲突(图26和27)。在ICC中pMEK抗体的脱靶特异性可能遮蔽由scWestern印迹和常规蛋白质印迹捕获的隐蔽的磷酸化响应。

在NSC分化期间的细胞间异质性

大阵列细胞经由scWestern印迹分析以研究经过6天时间向星形细胞(神经胶质纤丝酸性蛋白，GFAP+)和神经元(βIII-微管蛋白，βIIITUB+)终点的单细胞水平巢蛋白(NEST)+/SOX2+NSC分化动力学来分析。NSC在培养板中朝向混合神经元和星形细胞类群分化(图4a)。每24小时，将NSC沉降到scWestern微孔中(图4b，c)并经6天时间进行单细胞印迹。scWestern印迹成功地报道NEST(95.7±3.5kDa)、SOX2(43.3±1.9kDa)、βIIITUB(47.2±0.7kDa)和GFAP(54.0±1.0kDa，所有±SD，n＝3次分离；图4d、图28)的特异性条带。除了SOX2外，各种靶蛋白在其预期质量(如通过常规蛋白质印迹确定)的20％内，SOX2与其33.8kDa的标称质量相差28％。假设在所观察的SOX2质量方面的差别源于三种来源之一：(i)蛋白质的高9.7pI和在scWestern中的变性但非还原的PAGE条件，(ii)与其它(所有胞内)蛋白质靶相比较对从核中提取SOX2的有限的裂解时间和差别影响，(iii)脱靶探测。与文献报道一致，NEST在常规蛋白质印迹中表现出双条带(对于NEST和NEST*分别为82kDa和149kDa，图4e、图29)；然而，scWestern印迹仅报道保留在微孔中观察到的较高分子量材料的较低分子量条带。

常规蛋白质印迹显示经6天分化时程NEST(82kDa条带)和SOX2>10倍减少且βIIITUB和GFAP>10倍增加(图4e)。类似趋势对于NEST、βIIITUB和GFAP在分化时标上在β-微管蛋白标准化scWestern印迹数据中是明显的；且对于SOX2，程度较低(图4f，及图30和31)。分别在第0天和第6天的NEST和GFAP的单细胞表达水平为特定异质的，跨越自它们相应的技术噪音阈值22倍和46倍的范围。在scWestern印迹中评定超过技术噪音的βIIITUB+(神经元)和GFAP+(星形细胞)细胞类型百分比在第6天为53％和7.1％。这些值将在原始培养板中来自研究人员盲法ICC实验的手动评定计数匹配到15％内(下表1)，指示在scWestern印迹中的技术噪音阈值如实地描绘标志物阳性和阴性细胞状态。

在细胞沉降期间来自在培养板和scWestern微孔(柱沉降)中的ICC数据的手动评定计数方面没有观察到细胞类型偏移的证据。这些数据指示scWestern印迹对于多样化如球状NSC到高度分枝的神经元和胶质细胞类型的细胞形态是实用的(下表1)。通过培养板和微孔内ICC，从第0天到第6天，NEST+NSC计数从大约90％降到40％；在该类群中百分比改变的类似量值通过scWestern印迹观察到(53％降到2％)。登记该测量结果的表观位移指示scWestern测定从刺激响应性82kDa NEST物质分离荧光信号的能力，而ICC测量结果可通过表达刺激无响应的149kDa NEST*物质达到下阈值(图4a)。然而，ICC和scWestern测定两者都不反映第0天和第6天之间由常规蛋白质印迹观察到的SOX2表达的急剧下降，可能指示在各自中的脱靶抗体读出，还通过在由scWestern印迹预测的SOX2分子量方面的相对较高的误差所证明。

讨论

本文公开了单细胞蛋白质印迹，其能够实现数以千计的单细胞的靶向蛋白质组学分析。scWestern印迹用于高通量单细胞蛋白质组学工具，以便研究基础细胞过程，诸如免疫细胞化学、流式细胞术等。而现有蛋白质分析工具遭受试剂特异性的共有弱点，在scWestern印迹中包括分离和免疫探测步骤减小该弱点。scWestern印迹有助于降低测定的假阳性率，因为免疫荧光检测读出用诸如靶分子量的次要特征的测定补充。scWestern印迹还用于从在集成上游功能或形态学筛选的工艺流程中稀有原代细胞的分析，到用于特异性评价的抗体库筛选，到响应药剂的细胞间可变性的定量(例如，对于稀有细胞，诸如循环肿瘤细胞)的大范围调查。最后，在此详述的scWestern印迹由于有目的地缺乏复杂的宏观到微观的对接和流动控制方案而被设计成广泛采用。

表2.在分化第0天和第6天在来自图4f的单细胞scWestern印迹荧光数据中通过培养板和微孔内ICC和通过设定在技术噪音水平下的阈值评定为标志物阳性的细胞的百分数(±SD，n＝3次工艺重复，每次重复评定大于100个细胞)。值得关注的是粗体的神经元(βIIITUB⁺)和星形细胞(GFAP⁺)的终点计数。

实施例3

包括环形排列的微孔的聚合物分离介质

实验使用包括如在图32中所示具有环形排列的微孔的聚合物分离介质的根据本公开的装置进行。装置包括两个图案化聚丙烯酰胺凝胶(PAG)载玻片(图32)。将底部PAG用12mm直径的中心孔图案化，其被平面倾斜的微孔包围以捕获不同尺寸的细胞(图33)。8mm直径的贮存器在顶部PAG中未用微孔图案化，且两个PAG载玻片“夹”在一起以产生用以捕获细胞的封闭腔室。将细胞和缓冲液注入在顶部PAG中的中心入口中。在填充在较小孔中的空间(图32-绿色染料；例如，中心阴影区域)之前，沉积的溶液最初移动到在8mm孔边缘和12mm孔边缘之间的孔隙(图32-蓝色染料；例如，外部阴影环)。该填充将细胞定位到靠近侧微孔处并产生孔隙，到孔隙的腔室用缓冲液或其它溶液填充。使用离心力以将细胞主动地定位到微孔中。装置将细胞快速地沉降到微孔中，以便随后的蛋白质分离。将PAG载玻片分离(图36A和图36B)并探测目标蛋白质。图34显示用于分析细胞蛋白质的工艺流程的示意图。

主题装置的实施方案提供对于细胞类群(例如，稀有细胞类群，诸如循环肿瘤或干细胞)的单细胞蛋白分析。这些稀有细胞类群可能需要专门的操作来防止细胞损失。当用聚苯乙烯珠粒测试时，当以4000RPM或约112g旋转2分钟时，主题装置的实施方案的捕获率为约90％(图35)。细胞迅速沉降到微孔中和所述装置的封闭腔室在加工期间保护细胞，这有助于降低细胞死亡。主题装置的实施方案有助于分析目标蛋白质(例如，细胞内蛋白质)。分析处于单细胞水平的蛋白质可有助于检测细胞行为的变化。

本公开的实施方案通过但不限于以下条款进一步描述：

1.一种装置，其包括：

包含多个微孔的聚合物分离介质，其中所述聚合物分离介质包含在施加所施加的刺激后共价结合至所述分离介质中的一种或多种目标样品组分的官能团。

2.条款1的装置，其还包括接触所述聚合物分离介质的表面的固体载体，其中所述装置包括穿过所述聚合物分离介质和所述固体载体的一个或多个的一部分的至少一个通道。

3.条款1或条款2的装置，其中所述微孔在所述聚合物分离介质中排列成微孔阵列。

4.前述条款中任一项的装置，其中所述微孔包含在所述聚合物分离介质的表面上的开口端和在所述聚合物分离介质中的相对封闭端。

5.条款1的装置，其中所述聚合物分离介质包含中心孔，所述中心孔包括定位在外周上且与所述中心孔流体连通的多个微孔。

6.条款5的装置，其中每个微孔包含与所述中心孔流体连通的开口端和在所述聚合物分离介质中的相对封闭端。

7.条款5或条款6的装置，其中所述微孔基本上围绕所述中心孔的整个外周排列。

8.条款5的装置，其还包括承载所述聚合物分离介质的固体载体，其中所述装置包括穿过所述聚合物分离介质和所述固体载体的一个或多个的一部分的至少一个通道。

9.条款5的装置，其中所述聚合物分离介质包含在施加所施加的刺激后共价结合至所述分离介质中的一种或多种目标样品组分的官能团。

10.前述条款中的任一项的装置，其中所述聚合物分离介质包含100个或更多个微孔。

11.前述条款中任一项的装置，其中所述微孔按尺寸制作以容纳单个细胞。

12.条款4或6的装置，其中所述微孔的开口端具有大于所述微孔的封闭端的宽度。

13.前述条款中的任一项的装置，其中所述聚合物分离介质包含凝胶。

14.条款13的装置，其中所述凝胶的形状为长方体。

15.条款14的装置，其中所述长方体具有25至250微米的厚度。

16.前述条款中任一项的装置，其中所述微孔具有5至40微米的深度和5至20微米的直径。

17.前述条款中任一项的装置，其中所述施加的刺激为电磁辐射。

18.条款17的装置，其中所述电磁辐射为光。

19.一种方法，其包括：

使样品与前述条款中任一项的装置接触；和

以足以将所述样品的至少一些组分从所述微孔移动到所述聚合物分离介质中的方式向所述聚合物分离介质施加电场，以产生在所述聚合物分离介质中的分离的样品组分。

20.条款19的方法，其中所述聚合物分离介质包含在施加所施加的刺激后共价结合至所述分离介质中的一种或多种目标样品组分的官能团。

21.条款19或20的方法，其中所述样品包括细胞和/或细胞组分。

22.条款19-21中任一项的方法，其还包括将所述细胞裂解以在所述样品中产生细胞组分。

23.条款19-22中任一项的方法，其还包括孵育所述细胞以在所述样品中产生细胞组分。

24.条款19-23中任一项的方法，其中使所述样品与所述聚合物分离介质接触包括将所述样品的至少一些组分定位到一个或多个微孔中。

25.条款24的方法，其中所述定位包括使样品组分由于重力被动地沉降。

26.条款24的方法，其中所述定位包括向所述聚合物分离介质施加离心力。

27.条款24的方法，其中所述定位包括向所述聚合物分离介质施加电场。

28.条款24的方法，其中所述定位包括向所述样品施加密度梯度。

29.条款24的方法，其中所述定位包括使用微量吸管或喷嘴将所述样品的至少一些组分引入一个或多个微孔中。

30.条款24的方法，其中所述定位包括使用光学镊子将所述样品的至少一些组分引入一个或多个微孔中。

31.条款24的方法，其中所述定位包括向所述样品施加磁场，且其中在所述样品中的至少一些组分结合磁化珠粒。

32.条款24的方法，其中所述定位包括向所述样品施加对流流动。

33.条款24的方法，其中所述定位包括使用不同形状和/或尺寸的微孔进行尺寸选择性沉降。

34.条款24的方法，其中所述样品的至少一些组分包含在液滴中，且所述定位包括将所述液滴引入到所述微孔中。

35.条款19-34中任一项的方法，其还包括基于所述样品组分的尺寸分离在所述聚合物分离介质中的样品组分。

36.条款19-34中任一项的方法，其还包括基于所述样品组分的等电点分离在所述聚合物分离介质中的所述样品组分。

37.条款19-34中任一项的方法，其还包括基于所述样品组分的质荷比分离在所述聚合物分离介质中的样品组分。

38.条款19-34中任一项的方法，其还包括基于所述样品组分的亲和相互作用分离在所述聚合物分离介质中的样品组分。

39.条款19-38中任一项的方法，其还包括将所述分离的样品组分固定在所述聚合物分离介质中。

40.条款39的方法，其中所述固定包括将所述分离的细胞组分共价结合到所述聚合物分离介质。

41.前述条款中任一项的方法，其中所述分离的细胞组分通过将所述聚合物分离介质暴露于紫外(UV)光而共价结合至所述聚合物分离介质。

42.条款19-41中任一项的方法，其还包括检测所述分离的样品组分。

43.条款42的方法，其中所述检测包括使所述分离的样品组分与分析物检测试剂接触。

44.条款43的方法，其还包括使所述分离的样品组分与第二分析物检测试剂接触。

45.条款43或44的方法，其中所述分析物检测试剂包括标记的分析物特异性结合成员。

46.条款45的方法，其中所述标记的分析物特异性结合成员为标记的抗体。

47.条款43的方法，其中所述分离的样品组分包含酶且所述分析物检测试剂包含所述酶的底物。

48.条款43的方法，其中所述检测包括向所述聚合物分离介质施加电场以足以将所述分析物检测试剂移动到所述分离的样品组分。

49.条款48的方法，其中所述分析物检测试剂通过所述聚合物分离介质的顶部表面施加。

50.条款58的方法，其中所述分析物检测试剂通过所述聚合物分离介质的侧表面施加。

51.条款43-50中任一项的方法，其还包括从所述聚合物分离介质中除去所述分析物检测试剂。

52.条款51的方法，其还包括使在所述聚合物分离介质中的所述分离的样品组分与分析物检测试剂再接触。

53.条款19-52中任一项的方法，其还包括使所述聚合物分离介质脱水。

54.条款53的方法，其还包括长时间储存所述脱水的聚合物分离介质。

55.条款54的方法，其还包括使所述聚合物分离介质再水合。

56.条款55的方法，其还包括使所述聚合物分离介质与分析物检测试剂接触。

57.条款19-56中任一项的方法，其还包括使所述聚合物分离介质成像以产生所述分离的细胞组分的图像。

58.条款57的方法，其还包括从所述分离的细胞组分的图像中鉴定特殊细胞组分。

59.前述条款中任一项的装置，其中所述聚合物分离介质为基本均匀的。

60.前述条款中任一项的装置，其中所述聚合物分离介质关于所述聚合物分离介质的孔径、pH梯度或官能度中的一项或多项是不均匀的。

61.一种试剂盒，其包括：

根据前述条款中任一项的装置；和

含有所述装置的包装。

62.条款61的试剂盒，其还包括分析物检测试剂。

虽然出于清晰理解的目的已经通过说明和实施例详细地描述了以上实施方案，但本领域的普通技术人员根据本公开的教义显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下可以对其做出某些变化和修改。还应理解，本文所用的术语为出于仅描述特定实施方案的目的，并且不意图为限制性的，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书限制。

在提供值的范围的情况下，应理解本发明内涵盖这一范围的上限与下限之间的各插入值，准确到下限的单位的十分之一(除非上下文另外清楚指示)，以及这一所述范围内的任何其它所述值或插入值。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在这些较小范围内并且也涵盖于本发明内，从属于所述范围内的任何特定排除的限值。在所述范围包括所述限值中的一个或两个的情况下，本发明中还包括排除那些所包括的限值中的任一个或两个的范围。

在本说明书中引用的所有公开和专利均以引用的方式并入本文中，就如同各个单独公开或专利特定地且单独地被指示为以引用的方式并入，并且以引用的方式并入本文中以公开和描述引用所述公开时所涉及的方法和/或材料。对任何公开的引用都是针对其在申请日之前的公开内容并且不应被解释为承认本发明由于先前发明而无权先于所述公开。此外，所提供公开的日期可能不同于可需要独立确认的实际公开日期。

应注意，如本文中和所附权利要求书中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指示物。此外应注意，可起草权利要求书以排除任何任选要素。因而，对于使用如“唯一”、“仅”等与权利要求书要素的叙述相关的排他性术语或使用“负面”限制来说，这一陈述意图起到前提基础的作用。

本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的是，本文所描述和说明的各个单个实施方案具有独立的组分和特征，这些组分和特征可容易地与任何其它若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何所陈述方法均可以所陈述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。

因此，以上仅仅说明本发明的原理。应了解，本领域的技术人员将能够设想各种安排，虽然这些安排未在本文中明确地描述或展示，但是它们体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所引用的所有实施例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不对此类特别引用的实施例和条件构成限制。此外，本文中引述本发明的原理、方面和实施方案以及其特定实施例的所有陈述均意图涵盖其结构等效物和功能等效物。此外，此类等效物意在包括目前已知的等效物和未来开发出的等效物，即不管结构如何，所开发的执行相同功能的任何元件。因此，本发明的范围并非意图限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。