测定获自所述受试者的体液中前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽的水平；以及将前体速激肽或其片段或包含前体速激肽的肽的所述水平与出现主要不良心脏事件或死亡的风险相关联，其中水平升高预示出现主要不良心脏事件或死亡的风险提高。术语“水平升高”意指某阈值水平以上的水平。物质P(SP)是神经肽：一种作为神经递质并作为神经调质而发挥作用的十一氨基酸多肽。其属于速激肽神经肽家族。物质P及其密切相关的神经肽神经激肽A(NKA)在前体速激肽原A基因差异剪接后由多聚蛋白前体产生。在CNS中，物质P参与疼痛传递系统。SP在伤害感受、炎症、血浆外渗、毛细管后小静脉中的血小板和白细胞聚集以及白细胞通过血管壁的趋向性迁移中起作用(OtsukaM,YoshiokaK.Neurotransmitterfunctionsofmammaliantachykinins.PhysiolRev.1993Apr；73(2):229-308.)。神经激肽(NK)受体主要存在于冠状血管和心内神经节中，而非心室或心房的心肌中(HooverDB,ChangY,HancockJC,ZhangL.Actionsoftachykininswithintheheartandtheirrelevancetocardiovasculardisease.JpnJPharmacol.2000Dec；84(4):367-73.)。对冠状动脉中NK1受体的直接作用可导致NO介导的血管舒张(OtsukaM,YoshiokaK.Neurotransmitterfunctionsofmammaliantachykinins.PhysiolRev.1993Apr；73(2):229-308.)，尽管该效应在患有冠状动脉疾病的患者中可能受损(BossallerC,HabibGB,YamamotoH,WilliamsC,WellsS,HenryPD.Impairedmuscarinicendothelium-dependentrelaxationandcyclicguanosine5’-monophosphateformationinatherosclerotichumancoronaryarteryandrabbitaorta.JClinInvest.1987Jan；79(1):170-4.)，从而导致占优势的NK2介导的血管收缩。SP和神经激肽A是负性收缩性和变时性的，通过胆碱能神经元起作用(HooverDB,ChangY,HancockJC,ZhangL.Actionsoftachykininswithintheheartandtheirrelevancetocardiovasculardisease.JpnJPharmacol.2000Dec；84(4):367-73.)。相比之下，NK1拮抗剂提高大鼠心肌梗死(AMI)模型中的收缩性和松弛性，而SP减弱去甲肾上腺素的正性收缩作用(WangLL,GuoZ,HanY,WangPF,ZhangRL,ZhaoYL,ZhaoFP,ZhaoXY.ImplicationofSubstancePinmyocardialcontractilefunctionduringischemiainrats.RegulPept.2011Apr11；167(2-3):185-91.)。SP(通过NK1受体)参与豚鼠中AMI之后的心肌顿抑(ChiaoH,CaldwellRW.TheroleofSubstancePinmyocardialdysfunctionduringischemiaandreperfusion.NaunynSchmiedebergsArchPharmacol.1996Mar；353(4):400-7.)。然而，SP的一些作用可能潜在地对AMI有益。SP参与缺血后适应(RenJY,SongJX,LuMY,ChenH.Cardioprotectionbyischemicpostconditioningislostinisolatedperfusedheartfromdiabeticrats:Involvementoftransientreceptorpotentialvanilloid1,calcitoningene-relatedpeptideandsubstanceP.RegulPept.2011Aug8；169(1-3):49-57.)，而NK1拮抗剂可导致动物模型中AMI尺寸有增加的趋势(ZhangRL,GuoZ,WangLL,WuJ.Degenerationofcapsaicinsensitivesensorynervesenhancesmyocardialinjuryinacutemyocardialinfarctioninrats.IntJCardiol.2012Sep20；160(1):41-7.)。缺血期间的伤害感受可导致表达NK1受体的骨髓祖细胞(其可能在缺血区域的血管生成中起作用)的移动(AmadesiS,ReniC,KatareR,MeloniM,OikawaA,BeltramiAP,AvolioE,CesselliD,FortunatoO,SpinettiG,AscioneR,CangianoE,ValgimigliM,HuntSP,EmanueliC,MadedduP.Roleforsubstancep-basednociceptivesignalinginprogenitorcellactivationandangiogenesisduringischemiainmiceandinhumansubjects.Circulation.2012Apr10；125(14):1774-86,S1-19.)。已经观察到心肌SP(MorreyC,BrazinJ,SeyediN,CortiF,SilverRB,LeviR.InteractionbetweensensoryC-fibersandcardiacmastcellsinischemia/reperfusion:activationofalocalrenin-angiotensinsystemculminatinginseverearrhythmicdysfunction.1.JPharmacolExpTher.2010Oct；335(1):76-84.)和肺部SP(GuoZ,WangXP,WangJP,ZhouRH,WangLL,WuJ.Up-regulationofsubstancePinthelungsduringacutemyocardialischemiaandinfarctioninrats.RegulPept.2010Feb25；160(1-3):160-7.)在AMI动物模型中增加，这提示其在AMI中的作用。已经证实物质P通过刺激NK-1R，具有降低TNF-α-诱导的人肌腱细胞凋亡的能力BrJSportsMeddoi:10.1136/bjsports-2013-092438。SP非常短暂的半衰期(12min)已阻碍在人体中的研究(Conlon,J.M.,Sheehan,L.ConversionofsubstancePtoC-terminalfragmentsinhumanplasma.Regul.Pept.1983；7:335–345.)。最近开发的针对稳定PTA(N-端前物质P；以前还称为N-端前体速激肽A或NT-PTA，其为不稳定SP的替代物)的测定(Ernst,A.,Suhr,J.,Kohrle,J.,Bergmann,A.DetectionofstableN-terminalprotachykininAimmunoreactivityinhumanplasmaandcerebrospinalfluid.Peptides2008；29:1201–1206.)，已经使得对人疾病中该速激肽的作用的研究能够进行。前体速激肽片段PTA1-37可能是物质P的替代性标志物。WO2010/128071描述了将患有急性或慢性疾病的受试者，像心肌梗死后的患者分成对药物像ACE抑制剂、利尿剂和β-阻断剂的响应者和非响应者以及服药有不良作用的那些。作为生物标志物，血管活性激素用于该作用，或者与内皮功能/功能异常相关。在低水平的血管活性激素时，施用药物(当激素是proANP时除了溶栓药物)对于已患有心肌梗死的患者具有不利作用，而在较高水平时，施用药物对于已患有心肌梗死的患者具有积极作用。这意味着，根据WO2010/128071，较低水平的生物标志物(除了proANP)表明患者较高的风险，因为施用药物(当激素是proANP时除了溶栓药物)对于已患有心肌梗死的患者具有不利作用。并且进一步根据WO2010/128071，较高水平的生物标志物(除了proANP)表明患者较低的风险，因为施用药物(当激素是proANP时除了溶栓药物)对于对于已患有心肌梗死的患者具有积极作用。对患有心脏疾病的患者的有效治疗和管理需要风险分级系统。已经描述了工具(NTproBNP、风险评分)，但是它们并不完美。因此，需要提高目前的风险分级技术的替代性工具或附加工具。本发明的主题是预测患有急性心肌梗死(AMI)的受试者中出现主要不良心脏事件或死亡的风险的方法，其包括：测定获自所述受试者的体液中前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽的水平；以及将前体速激肽或其片段或包含前体速激肽的肽的所述水平与出现主要不良心脏事件或死亡的风险相关联，其中水平升高预示出现主要不良心脏事件或死亡的风险提高。在优选的实施方案中，本发明的主题是预测患有急性心肌梗死的受试者中出现主要不良心脏事件或死亡的风险的方法，其包括：测定获自所述受试者的体液中前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽的水平，其中使用至少一种能结合PTA1-37，SEQIDNO.2，EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA的结合物，以及其中所述结合物对PTA1-37具有至少107M-1的亲和力，以及将前体速激肽或其片段或包含前体速激肽的肽的所述水平与出现主要不良心脏事件或死亡的风险相关联，其中水平升高预示出现主要不良心脏事件或死亡的风险提高。因此，前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽的水平越高，或者其中使用至少一种能结合PTA1-37，SEQIDNO.2的结合物测定的片段的水平越高，表明出现主要不良心脏事件或死亡的风险越高。在具体的实施方案中，本发明的这种预测并非是预测所述受试者是否表现出由药物引起的不利作用或者所述受试者是药物的响应者还是非响应者。在一具体的实施方案中，本发明的预测并非是预测所述受试者是否表现出由溶栓药物引起的不利作用或者所述受试者是溶栓药物的响应者还是非响应者。因此，在一具体的实施方案中，本发明的主题排除将受试者分成药物的响应者、药物的非响应者、以及在接受所述药物之后表现出不利作用的受试者。在具体的实施方案中，所述药物是溶栓药物。在本发明的一实施方案中，本发明的患有急性心肌梗死(AMI)的受试者中出现主要不良心脏事件或死亡的方法依赖于药物，具体依赖于溶栓药物的作用。出现主要不良心脏事件或死亡的风险预测不同于疾病或病况或事件的诊断。风险预测意指生物标志物预测或确定出现将来将发生而在测量和预测的时候并不存在的事件或病况的风险，其中诊断意指已发生的当前事件或当前病况的确定。有多种可能适于作为诊断标志物但没有任何预测能力的生物标志物，因为它们只有在事件发生时才改变。也有多种没有任何诊断能力的预测标志物。生物分子是否可能展现出任何诊断或预测能力在任何情况下都是不可预测的。在本发明的具体实施方案中，所述主要不良心脏事件是选自心肌梗死、中风、急性心力衰竭和死亡的急性主要不良心脏事件。在一具体的实施方案中，预测在接下来的6个月内或2年内出现所述急性不良事件的风险。在一具体的实施方案中，所述AMI在采集来自所述患者的样品体液的前24小时内已经发生。在一具体的实施方案中，所述AMI在采集来自所述患者的样品体液的前一周内已经发生。在一具体的实施方案中，所述AMI在采集来自所述患者的样品体液的前一个月内已经发生。在一具体的实施方案中，所述AMI在采集来自所述患者的样品体液的前2个月内已经发生。在本发明的具体实施方案中，预测患有急性心肌梗死的受试者中出现主要不良心脏事件或死亡的风险的方法包括：测定获自所述受试者的体液中前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽的水平；以及将前体速激肽或其片段或包含前体速激肽的肽的所述水平与出现主要不良心脏事件或死亡的风险相关联，其中水平升高预示出现主要不良心脏事件或死亡的风险提高。在一具体的实施方案中，在采集体液时和/或在测定获自所述受试者的体液中前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽的水平时，受试者未患心力衰竭。本发明的主要复合终点是在2年内评估的主要不良心脏事件(MACE)，包括全因死亡、心力衰竭(HF)住院治疗或复发性AMI(re-AMI)。在一实施方案中，这意指主要不良心脏事件选自全因死亡、心力衰竭(HF)住院治疗或复发性AMI(re-AMI)。在一具体的实施方案中，主要不良心脏事件选自2年内的全因死亡、心力衰竭(HF)住院治疗或复发性AMI(re-AMI)。HF住院治疗被定义为HF是需要用高剂量利尿剂、收缩剂(inotropes)或静脉内硝酸盐治疗的主要原因的再入院。复发性AMI利用通用定义诊断(ThygesenK,AlpertJS,WhiteHD；JointESC/ACCF/AHA/WHFTaskForcefortheRedefinitionofMyocardialInfarction.UniversaldefinitionofmyocardialInfarction.Circulation2007；116:2634-53.)。次要终点是死亡和/或re-AMI以及死亡和/或HF再入院的复合，以及单独的re-AMI。6个月时死亡和/或re-AMI的终点用于包括GRACE评分的分析中，因为该时间点被用于风险评分的开发中。通过查阅地方医院数据库、国家统计局登记处和给患者打电话来获得终点。这意味着，在一实施方案中，主要不良心脏事件选自死亡和/或re-AMI以及死亡和/或HF再入院的复合，以及单独的re-AMI。在一具体的实施方案中，主要不良心脏事件选自6个月内死亡和/或re-AMI以及死亡和/或HF再入院的复合，以及单独的re-AMI。在一具体的实施方案中，主要不良心脏事件是死亡和/或re-AMI。在一具体的实施方案中，主要不良心脏事件是在6个月时死亡和/或re-AMI。前体速激肽及其片段或包含前体速激肽的肽可以用作释放的物质P和/或释放的神经激肽的替代性标志物，因为物质P/神经激肽以及前体速激肽及其片段或包含前体速激肽的肽以与前体速激肽等摩尔的量被释放。在一实施方案中，测定物质P或神经激肽之外的前体速激肽及其片段或包含前体速激肽的肽的水平。在另一实施方案中，测定物质P或神经激肽的水平。可以通过任何可用的分析方法，例如，使用至少一种能结合所述前体速激肽及其片段或包含前体速激肽的肽的结合物，来测定某种肽或肽片段的水平。此类结合物可以是抗体。所述水平可以通过例如质谱法来测定。在上述方法的一实施方案中，前体速激肽、其剪接变体或其片段的增加的水平是阈值以上的水平，其中所述阈值是(大约)100pmol/l或100pmol/l以上、优选(约)80pmol/L或80pmol/L以上、优选(约)70pmol/L或70pmol/L以上。阈值必须鉴于所用的校准方法来理解，并且上述数值必须鉴于本实施例1、2和3中所用的测定和校准方法来理解。使用本发明实施例1中所用的校准方法，健康受试者中前体速激肽的中值水平测定为53pmol/L。在本发明的一实施方案中，所述主要不良心脏事件是选自心肌梗死、中风、急性心力衰竭的急性主要不良心脏事件。在本发明的一实施方案中，来自所述受试者的所述体液样品在发生AMI之后的一定时间范围内采集，该时间范围为2个月、更优选1个月、更优选1周，最优选24小时内。在本发明的一实施方案中，所述水平升高预示在接下来的6个月内或接下来的2年内出现主要不良心脏事件或死亡的风险提高。在整篇说明书中，术语前体速激肽和前体速激肽A(PTA)同义使用。该术语包括前体速激肽A的所有剪接变体，即αPTA、βPTA、γPTA和δPTA。在整篇说明书中，应当理解，如果没有另外指明，术语前体速激肽的片段还包括物质P和神经激肽。术语“测定前体速激肽、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段包括物质P和神经激肽的水平”意指，通常测定针对前述分子内的区域的免疫反应性。这意味着，不必选择性测量某片段。应当理解，用于测定前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段包括物质P和神经激肽的水平的结合物，能结合包含所述结合物的结合区域的任何片段。所述结合物可以是抗体或抗体片段或非IgG支架。这意味着，在整篇说明书和权利要求书中，术语“测定前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽的水平”等同于“测定针对前述分子内的区域的免疫反应性”，并且等同于“测定结合物例如能结合前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽中所含的区域的抗体的水平”。本文所用的术语“受试者”指活人或非人生物体。本文优选的受试者是人受试者。获自所述受试者的体液中的前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽的水平与出现主要不良心脏事件的风险之间的关联性是连续的，即水平越高，风险越高。这能够从例如表2中的数据看出。与第一四分位数相比，第二、第三和第四四分位数分别展现出更高的风险。为了实用性，本领域技术人员可以使用阈值。因此，术语“水平升高”可以意指阈值水平以上的水平。体液可以选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)和唾液。在具体的实施方案中，在从所述受试者采集体液样品时，所述心血管疾病是急性心肌梗死(AMI)。在一具体的实施方案中，所述AMI是STEMI(ST-段抬高心肌梗死)或NSTEMI(非ST-段抬高心肌梗死)。在本发明的一实施方案中，所述受试者患有AMI，其中在一实施方案中，所述患者具有第九十九百分位数以上的心肌肌钙蛋白水平，且具有以下之一：胸痛持续>20分钟或者诊断系列心电图变化由新的病理性Q波或ST-段和T-波改变组成。在本发明另一具体的实施方案中，受试者中不良事件的预测或患有AMI之后出现另一不良事件的风险提高的受试者的鉴定，通过另外测定和使用至少一种选自以下的另外的标志物来改进：肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、CRP、LpLA2、胱抑素C和A型、B型钠尿肽以及它们的前体和片段包括ANP、proANP、NT-proANP、MR-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP甘油三酯、HDL胆固醇或其亚组分、LDL胆固醇或其亚组分、GDF15、ST2、肽素和任何评分，诸如例如PURSUIT、TIMI、GRACE和FRISC风险评分(B.EBackus,A.JSix,J.HKelder,W.BGibler,F.LMoll,1andP.ADoevendans,RiskScoresforPatientswithChestPain:EvaluationintheEmergencyDepartment,CurrCardiolRev.2011February；7(1):2–8.)。在本发明方法的一非常具体的实施方案中，除了前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段或包含前体速激肽的肽的水平之外，测定和使用以下标志物的水平：proBNP或其具有至少12个氨基酸的片段或前体和/或CRP。在本发明另一具体的实施方案中，另外确定至少一种选自以下的临床参数：年龄、收缩压、舒张压、降压药治疗、身体质量指数、患糖尿病、现时吸烟。前体速激肽可具有以下序列：SEQIDNO.1(前体速激肽A(1-107)EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRR体液中可以测定的前体速激肽的片段可以例如选自以下片段：SEQIDNO.2(前体速激肽1-37,P37)EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIASEQIDNO.3(物质P)RPKPQQFFGLM(–NH2)SEQIDNO.4(神经肽K)DADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLM(-NH2)SEQIDNO.5(神经肽γ)GHGQISHKRHKTDSFVGLM(-NH2)SEQIDNO.6(神经激肽1)HKTDSFVGLM(-NH2)SEQIDNO.7(C-端侧翼序列，PTA192-107)ALNSVAYERSAMQNYESEQIDNO.8(PTA同种型α)EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKMAYERSAMQNYERRRSEQIDNO.9(PTA同种型β)EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRRSEQIDNO.10(PTA同种型δ)EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDAGHGQISHKMAYERSAMQNYERRRSEQIDNO.11(PTA同种型γ)EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDAGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRRSEQSEQIDNO.12(PTA3-22)GANDDLNYWSDWYDSDQIKSEQIDNO.13(PTA21-36)IKEELPEPFEHLLQRI测定PTA、其剪接变体或其片段的水平可意指，测定针对PTA或其片段包括物质P和神经激肽的免疫反应性，用于测定PTA、其剪接变体或其片段的结合物，依赖于结合区域，可结合多于一种以上所示的分子。这对本领域技术人员而言是显而易见的。在本发明方法的更具体的实施方案中，测定P37(PTA1-37,SEQIDNO.2,EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA)的水平。在本发明更具体的实施方案中，使用至少一种或两种能结合PTA1-37，SEQIDNO.2，EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA的结合物，如果有多于一种结合物，它们优选结合PTA1-37，SEQIDNO.2，EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA内的两个不同的区域。所述结合物可以优选抗体或其结合片段。在更具体的实施方案中，能分别结合PTA1-37内的以下区域的一个或两个的结合物用于测定PTA、其变体和片段：GANDDLNYWSDWYDSDQIKPTA3-22(SEQIDNO.12)IKEELPEPFEHLLQRIPTA21-36(SEQIDNO.13)在具体的实施方案中，使用能结合PTA、其剪接变体或其片段的抗体或抗体片段，采用免疫测定法测量PTA、其剪接变体或其片段的水平。可以用于测定PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的免疫测定法可包括实施例1中所概括的步骤。所有阈值和数值必须结合实施例1中所用的测试和校准来理解。本领域技术人员可了解，阈值的绝对数值可受所用的校准影响。这意味着，本文给出的所有数值和阈值应当在本文所用的校准下理解(实施例1)。在本发明方法更具体的实施方案中，测定前体速激肽的水平。根据本发明，针对PTA或其它另外的生物标志物的诊断结合物选自抗体，例如IgG、典型的全长免疫球蛋白、或至少含有重链和/或轻链的F-可变结构域的抗体片段，例如化学连接的抗体(抗原结合片段)包括但不限于Fab片段，包括Fab微抗体、单链Fab抗体、具有表位标签的单价Fab抗体，例如Fab-V5Sx2；与CH3结构域二聚化的二价Fab(微抗体)；二价Fab或多价Fab，例如通过在异源结构域辅助下的多聚化，例如通过dHLX结构域的二聚化，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab‘)2-片段、scFv-片段、多聚化的多价或/和多特异性的scFv-片段、二价和/或双特异性的双体、(双特异性T细胞衔接器)、三功能抗体、多价抗体，例如来自不同于G的类别；单结构域抗体，例如来源于骆驼或鱼免疫球蛋白的纳米抗体。在具体的实施方案中，采用使用结合物的测定测量PTA、其剪接变体或其片段或其它另外的生物标志物的水平，所述结合物选自以下详细描述的能结合PTA、其剪接变体或其片段或可选地能结合另外的生物标志物的适体、非Ig支架。可用于测定前体速激肽(PTA)、其剪接变体或其片段的水平的结合物对PTA、其剪接变体或其片段展现出至少107M-1、优选108M-1的亲和常数，优选的亲和常数大于109M-1，最优选大于1010M-1。本领域技术人员了解，通过施加更高剂量的化合物被认为能补偿较低的亲和力，并且这样的测量不会导致超出本发明的范围。可以利用例如在Biaffin,Kassel,Germany(http://www.biaffin.com/de/)的服务分析所提供的Biacore方法确定结合亲和力，还参见上文。可用于测定PTA、其剪接变体或其片段的水平的结合物对PTA、其剪接变体或其片段展现出至少107M-1、优选108M-1的亲和常数，优选的亲和常数大于109M-1，最优选大于1010M-1。本领域技术人员了解，通过施加更高剂量的化合物被认为能补偿较低的亲和力，并且这样的测量不会导致超出本发明的范围。可以利用例如在Biaffin,Kassel,Germany(http://www.biaffin.com/de/)的服务分析所提供的Biacore方法确定结合亲和力，还参见上文。亲和常数为了测定抗体的亲和力，借助于无标记的表面等离子体共振，使用Biacore2000系统(GEHealthcareEuropeGmbH,Freiburg,Germany)测定PTA、其剪接变体或其片段对固定抗体的结合动力学。利用以高密度与CM5传感器表面共价连接的抗小鼠Fc抗体，根据生产商的说明书(小鼠抗体捕获试剂盒；GEHealthcare)，进行抗体的可逆固定(Lorenzetal.,“FunctionalAntibodiesTargetingIsaAofStaphylococcusaureusAugmentHostImmuneResponseandOpenNewPerspectivesforAntibacterialTherapy“；AntimicrobAgentsChemother.2011January；55(1):165–173.)。人PTA对照样品可获自ICI-Diagnostics,Berlin,Germanyhttp://www.ici-diagnostics.com/。测定还可以通过合成的(对于我们的实验，我们使用合成的P37,SEQIDNO.2)或重组的PTA、其剪接变体或其片段来校准。在本发明的一实施方案中，实施所述方法一次以上，以便监测受试者中出现主要不良心脏事件的风险，或者以便监测治疗进程。在一具体的实施方案中，实施所述监测，以便评估所述受试者对所采取的预防措施和/或治疗措施的响应。在本发明的一实施方案中，使用所述方法，以便将所述受试者分级为风险组。本发明的主题还有确定样品中PTA、其剪接变体或片段的测定，其包含两种能结合PTA区域(其为氨基酸3-22(GANDDLNYWSDWYDSDQIK,SEQIDNO.12)和氨基酸21-36(IKEELPEPFEHLLQRI,SEQIDNO.13))内两个不同区域的结合物，其中所述区域的每一个都包含至少4个或5个氨基酸。在本发明的确定样品中PTA、其剪接变体或片段的测定的一实施方案中，所述测定的分析测定灵敏度能够定量健康受试者的PTA、其剪接变体或PTA片段，并且<20pmol/、优选<10pmol/l，且更优选<5pmol/l。在本发明的确定样品中PTA、其剪接变体或片段的测定的一实施方案中，此类测定是三明治测定，优选完全自动化的测定。其可以是ELISA、完全自动化的测定或手动测定。其可以是所谓的POC-测试(即时)。自动化或完全自动化的测定的实例包括可以用于以下系统之一的测定：RocheAbbottSiemensBrahmsBiomerieuxAlere测试形式的实例在上文提供。在本发明的确定样品中PTA、其剪接变体或片段的测定的一实施方案中，所述两种结合物中的至少一种被标记，以便被检测。标记物的实例在上文提供。在本发明的确定样品中PTA、其剪接变体或片段的测定的一实施方案中，所述两种结合物中的至少一种与固相连接。固相的实例是磁珠、聚苯乙烯管或微量滴定板。在一实施方案中，使用均相测定，即使用时间分辨发射放大穴(TRACE)技术。在本发明的确定样品中PTA、其剪接变体或片段的测定的一实施方案中，所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射碘标记物。本发明的又一主题是包含本发明测定的试剂盒，其中所述测定的组分可以包含在一个或多个容器中。在本发明方法的具体实施方案中，另外确定至少一种选自以下的临床参数：年龄、性别、收缩压、舒张压、降压药治疗(AHT)、身体质量指数、腰围、腰臀比、现时吸烟者、糖尿病遗传和既往心血管疾病(CVD)。本发明的主题还有预测患有AMI的受试者中出现主要不良心脏事件的风险的方法或鉴定患有AMI，具有增加的出现本发明的主要不良心脏事件的风险的受试者的方法，其中单独的前体速激肽或其至少5个氨基酸的片段的水平或者与预后可用的实验室或临床参数结合，用于预测受试者出现主要不良心脏事件的风险，其通过可以选自以下选项的方法：与“健康”或“表面健康”受试者群体的预定样品集合中前体速激肽或其片段或包含前体速激肽的肽的水平的中值比较，与“健康”或“表面健康”受试者群体的预定样品集合中前体速激肽或其片段或包含前体速激肽的肽的水平的分位数比较，基于Cox比例风险分析或通过使用风险指数计算诸如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合判别指数)来计算。在本发明方法的一实施方案中，实施所述方法一次以上，以便监测患有AMI的受试者中出现主要不良心脏事件的风险。在本发明方法的另一实施方案中，实施所述监测以便评估所述患有AMI的受试者对所采用的预防措施和/或治疗措施的响应。在本发明方法的另一实施方案中，所述方法用于将所述患有AMI的受试者分级为风险组。本发明还包括实施本发明方法的即时装置。本发明还包括进行本发明方法的测定和/或试剂盒。附图说明图1：显示典型的PTA剂量/信号曲线。标准曲线PTA。图2：在两年时有MACE(红色)或没有MACE(绿色)的那些受试者当中，AMI后5天内血浆PTA的概况。图3:显示生存者和具有6个月时死亡和/或MI终点的患者中，事件概率的上下重新分类的重新分类图。图4:6个月时死亡和/或MI终点的分类树。图5:对于6个月时死亡和/或MI的终点，使用PTA作为初始分类物的分类树。图6:显示死亡和/或MI事件随根据72.1pmol/L以下或以上的血浆PTA分级的时间的KaplanMeier图。生存函数图7:MEASURE_1的估算边际均值。实施例实施例1PTA-免疫测定法抗PTA抗体的开发用于免疫的肽/缀合物：合成(JPTTechnologies,Berlin,Germany)用于免疫的肽，其具有额外的用于将肽与牛血清白蛋白(BSA)缀合的N-端半胱氨酸残基。通过使用Sulfo–SMCC(Perbio-science,Bonn,Germany)将肽与BSA共价连接。连接方案根据Perbio手册进行表1：用于免疫的肽PTA序列(C)GANDDLNYWSDWYDSDQIK3-22(SEQIDNO.12)(C)IKEELPEPFEHLLQRI21-36(SEQIDNO.13)抗体按照以下方法产生：在第0天和第14天用100μg肽-BSA-缀合物(在100μl完全弗式佐剂中乳化)免疫BALB/c小鼠，并且在第21天和第28天用50μg(在100μl不完全弗氏佐剂)。在进行融合实验前三天，动物接受50μg溶解于100μl盐水中的缀合物，作为一次腹腔注射和一次静脉注射给予。用1ml50％聚乙二醇将来自免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞在37℃下融合30s。洗涤之后，将细胞接种于96孔细胞培养板中。通过在HAT培养基[补充20％胎牛血清和HAT添加剂的RPMI1640培养基]中培养来选择杂种克隆。两周后，将HAT培养基替换为HT培养基，持续三代，随后恢复正常的细胞培养基。在融合后三周，初筛细胞培养上清液中的抗原特异性IgG抗体。将阳性测试的微量培养物转移至24孔板进行增殖。再次测试之后，将所选的培养物利用有限稀释技术进行克隆和再克隆，并确定同种型(Lane,R.D.“Ashort-durationpolyethyleneglycolfusiontechniqueforincreasingproductionofmonoclonalantibody-secretinghybridomas”,J.Immunol.Meth.81:223-228；(1985),Ziegler,B.etal.“Glutamatedecarboxylase(GAD)isnotdetectableonthesurfaceofratisletcellsexaminedbycytofluorometryandcomplement-dependentantibody-mediatedcytotoxicityofmonoclonalGADantibodies”,Horm.Metab.Res.28:11-15,(1996))。单克隆抗体产生通过标准抗体产生方法产生抗体(Marxetal.,MonoclonalAntibodyProduction(1997),ATLA25,121)，并通过蛋白A层析法纯化。基于SDS凝胶电泳分析，抗体纯度>95％。抗体的标记和包被按照以下方案用吖啶酯标记所有抗体：标记的化合物(示踪物，抗PTA3-22)：将100μg(100μl)抗体(1mg/ml，于PBS中，pH7.4)与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml，于乙腈中，InVentGmbH,Germany)(EP0353971)混合，并在室温下孵育20min。通过凝胶过滤HPLC在Bio-SilSEC400-5(Bio-RadLaboratories,Inc.,USA)上纯化标记的抗体。将纯化的标记抗体稀释于(300mmol/l磷酸钾，100mmol/lNaCl，10mmol/lNa-EDTA，5g/l牛血清白蛋白，pH7.0)中。终浓度为每200μl约800.000相对光单位(RLU)的标记化合物(约20ng标记的抗体)。通过使用AutoLumatLB953(BertholdTechnologiesGmbH&Co.KG)测量吖啶酯化学发光。固相抗体(包被的抗体)：固相：用抗PTA22-36抗体(1.5μg抗体/0.3ml100mmol/lNaCl,50mmol/lTris/HCl,pH7.8)包被(室温下18h)聚苯乙烯管(GreinerBio-OneInternationalAG,Austria)。在用5％牛血清白蛋白封闭之后，管用PBS,pH7.4洗涤，并真空干燥。PTA免疫测定法：将50μl样品(或校准物)用移液管吸入包被的管中，在加入标记的抗体之后(200μl)，将管于18-25℃下孵育2h。通过用洗涤溶液(20mmol/lPBS,pH7.4,0.1％TritonX100)洗涤5次(每次1ml)来去除未结合的示踪物。通过使用LuminumeterLB953,Berthold,Germany测量管结合的标记抗体。校准：使用稀释于20mMK2PO4,6mMEDTA,0.5％BSA,50μM氨肽酶抑制剂,100μM亮抑酶肽,pH8.0中的合成P37的稀释物来校准测定。PTA对照血浆获自ICI-diagnostics,Berlin,Germany。分析测定灵敏度是(通过0-校准物(未添加PTA)的20次测定产生的中值信号+2SD2标准偏差(SD)，对应的PTA浓度由标准曲线计算出)4.4pmol/L。实施例2–在急性心肌梗死患者中的研究研究群体：我们研究了于2004年8月至2007年4月收入莱斯特大学医院NHS信托(UniversityHospitalsofLeicesterNHStrust)的1148例STEMI(＝ST-段抬高心肌梗死)和NSTEMI(＝非ST-段抬高心肌梗死)患者。该观察性队列研究遵照赫尔辛基宣言，并且得到地方伦理委员会的批准。从患者处获得了书面知情同意书。如果患者具有第九十九百分位数以上的心肌肌钙蛋白I水平，并具有以下之一，则诊断为AMI：胸痛持续>20分钟，或者诊断系列心电图变化由新的病理性Q波或ST-段和T-波改变组成(ThygesenK,AlpertJS,WhiteHD；JointESC/ACCF/AHA/WHFTaskForcefortheRedefinitionofMyocardialInfarction.UniversaldefinitionofmyocardialInfarction.Circulation2007；116:2634-53.)。在之前一个月内有已知的恶性肿瘤、肾替代疗法或手术的患者被排除。估算的肾小球滤过率(eGFR)由简化的肾病饮食改进配方计算出(SmildeTD,vanVeldhuisenDJ,NavisG,VoorsAA,HillegeHL.Drawbacksandprognosticvalueofformulasestimatingrenalfunctioninpatientswithchronicheartfailureandsystolicdysfunction.Circulation2006；114:1572-80.)。所有患者在主治医生的判定下接受标准药物治疗和血流重建。血浆样品：在诊断之后和症状发作36h之内，立即在15分钟卧床休息之后采集血液样品(用EDTA和抑肽酶抗凝)。血浆于-80℃储存直到在一批中进行用于盲性确定血浆PTA和NTproBNP的测定。超声心动描记术：使用Sonos5500或IE33仪器(PhilipsMedicalSystems,Reigate,UK)，在指标录入过程中，对895例(77.9％)患者进行经胸超声心动描记术。基于美国超声心动描记术学会方法进行16-节段左心室室壁运动指数(LVWMI)评分(SchillerNB,ShahPM,CrawfordM,etal.Recommendationsforquantitationoftheleftventriclebytwo-dimensionalechocardiography.AmericanSocietyofEchocardiographyCommitteeonStandards,SubcommitteeonQuantitationofTwo-DimensionalEchocardiograms.JAmSocEchocardiogr.1989；2:358-367.)。在合适的患者中，使用圆盘式双平面法(biplanemethodofdiscsformula)计算左心室射血分数(LVEF)。LV收缩功能异常(LVSD)定义为LVEF<40％或LVWMI>1.8。全球急性冠状动脉事件注册(GRACE)评分：基于急性冠状动脉综合征患者的国际观测数据库，可以在初始表现时计算GRACE评分以预测住院死亡率(GrangerCB,GoldbergRJ,DabbousO,etal.GlobalRegistryofAcuteCoronaryEventsInvestigators.Predictorsofhospitalmortalityintheglobalregistryofacutecoronaryevents.ArchInternMed.2003；163:2345-53.)，或用于定义为死亡和/或re-MI的6个月主要不良心脏事件(MACE)(EagleKA,LimMJ,DabbousOH,etal.Avalidatedpredictionmodelforallformsofacutecoronarysyndrome:estimatingtheriskof6-monthpostdischargedeathinaninternationalregistry.JAMA2004；291:2727–33.)。我们使用离开时的GRACE评分与6个月死亡和/或re-AMI比较。终点：主要复合终点是在2年内评估的主要不良心脏事件(MACE)，包括全因死亡、心力衰竭(HF)住院治疗或复发性AMI(re-AMI)。HF住院治疗被定义为HF是需要用高剂量利尿剂、收缩剂或静脉内硝酸盐治疗的主要原因的再入院。复发性AMI利用通用定义诊断(ThygesenK,AlpertJS,WhiteHD；JointESC/ACCF/AHA/WHFTaskForcefortheRedefinitionofMyocardialInfarction.UniversaldefinitionofmyocardialInfarction.Circulation2007；116:2634-53.)。次要终点是死亡和/或re-AMI以及死亡和/或HF再入院的复合，以及单独的re-AMI。6个月时死亡和/或re-AMI的终点用于包括GRACE评分的分析中，因为该时间点被用于风险评分的开发中。通过查阅地方医院数据库、国家统计局登记处和给患者打电话来获得终点。我们实现了100％的随访。统计学分析：在SPSSVersion20(SPSSInc,Chicago,Illinois)和Stata12.1(Texas,USA)上进行统计学分析。假设15％的事件率，以及协变量预测高达30％的生物标志物差异，600例患者的样本大小将能够(p<0.05时，90％)检测1.5的生物标志物风险比。将生物标志物水平进行log10转化，因此风险比是指这些标志物水平的十倍增加。GRACE评分用作原始评分。针对非高斯数据采用非参数检验(Mann-WhitneyU-检验、KruskalWallis检验和斯皮尔曼(RS)相关性)。使用单变量一般线性模型评估PTA水平的独立预测因素。为了评估生物标志物的预后价值，‘基础’模型使用Cox生存分析生成，其包括与单变量分析的任何研究终点显著相关(p<0.10)的变量(年龄、性别、既往缺血性心脏病(IHD)史、高血压或糖尿病、Killip分级、eGFR和对数肌钙蛋白I)。将生物标志物(NTproBNP、PTA)加入该基础模型以用同时登记的所有变量评估每一种的相对预后价值。第二‘比较’Cox模型用于评估这些生物标志物和GRACE评分的相对预后能力。用Pencinaetal所描述的无类别净重新分类改进(NRI)计算，通过重新分类分析评估PTA至GRACE评分的其它预后价值(PencinaMJ,D'AgostinoRBSr,SteyerbergEW.Extensionsofnetreclassificationimprovementcalculationstomeasureusefulnessofnewbiomarkers.StatMed.2011；30:11-21.)。我们利用卡方自动交互检测(CHAID,利用SPSS进行分析)构建了分类树，其在每一步骤选择与因变量具有最强相互作用的生物标志物。患者特征研究群体的特征按照PTA四分位数显示在表2中。PTA水平较高的患者是年长的女性，有既往高血压史、IHD、糖尿病、HF、且具有较高的GRACE评分、NTproBNP和葡萄糖水平。他们还有受损更严重的心脏功能和肾功能。表2：根据PTA四分位数录入的1148例AMI患者的特征。数值数据表示为n(％)。对于分别的连续变量或类别变量，P值被引述用于ANOVA(F统计值)或Kruskal-Wallis检验。报告为数值(％)或平均数±SD。相关分析斯皮尔曼分析(rs)显示，PTA与年龄(0.521)、eGFR(-0.555)、舒张BP(-0.178)、NTproBNP(0.428)、射血分数(-0.175)(均为P<0.0005)和心率(0.100,P<0.001)显著相关。PTA与肌钙蛋白或峰值肌酸激酶水平不相关。单变量一般线性模型以根据模型中所占的差异的递减次序，显示PTA水平的以下独立的预测因素(表3):eGFR、年龄、既往糖尿病和IHD史、1以上的Killip分级、LV室壁运动评分、女性和舒张BP。eGFR占差异的大多数(20.7％)。表3：显示PTA水平的独立预测因素的单变量一般线性模型PTA的日曲线从110例患者获得连续5天的血浆样品，其中的29例在2年内出现MACE。图2显示了血浆概况以及具有重复测量的一般线性模型，其表明PTA随时间的显著变化(p<0.001)，以及在具有MACE的那些受试者中水平更高(p<0.03).In在事后测试(post-hoctesting)中，第1天时的PTA水平高于第3、4或5天(p<0.001，分别为0.004和0.002，对于多重比较为邦弗朗尼校正的)。第1天和第2天时的PTA水平类似。PTA的时间概况与MACE没有统计学显著的相互作用。生存分析在2年内的随访期间，PTA水平升高的患者(log10转化的，并且表示为连续变量)具有更多的MACE、死亡以及HF再住院治疗或re-AMI(表2)。表4报道了影响2年时MACE结果的多因素的单变量和多变量风险比。表4：AMI后2年时的MACE的Cox回归分析。为模型1报道了多变量分析结果，模型1包括对用于预测MACE的单变量分析是显著的变量和生物标志物(除了GRACE和LV收缩功能异常)。多变量模型2和3用于预测死亡和/或re-MI(模型2)以及死亡和/或HF再入院(模型3)的复合终点。仅报道了显著的风险比。在用于预测2年时MACE的多变量分析中，显著独立的预测因素包括年龄、1以上的Killip分级、用他汀类药物、ACE/ARB和利尿剂的治疗、以及PTA。在用于预测死亡和/或re-MI(模型2)以及死亡和/或HF再入院(模型3)的次要复合终点的其它模型中，PTA仍然是独立的预测因素(分别为p<0.0005和p<0.002)。在用于MACE和这些次要复合终点(其包括LVSD的超声心动图证据(数据未显示))的每一个的模型中，PTA(均为P<0.005)以及LVSD(p值范围为0.015至0.025)仍然是显著独立的预测因素。表5报道了2年时re-AMI终点的单变量和多变量风险比。表5：AMI后2年时的re-MI终点的Cox回归分析。为模型1报道了多变量分析结果，模型1包括对单变量分析是显著的变量和NTproBNP(除了GRACE和LV收缩功能异常)。多变量模型2报道了在向模型1添加pro-SP之后的风险比。多变量模型3报道了在向模型2添加超声心动图LVSD之后的风险比。仅报道了显著的风险比。在包括显著单变量预测因素和NTproBNP的模型1中，对于既往IHD史有显著性的趋势(p＝0.055)。向其添加PTA表明，PTA是re-AMI的显著预测因素(模型2,表5)。当添加超声心动图LVSD时，PTA显示出显著性的趋势(模型3,表5)。与GRACE评分比较广泛使用的GRACE风险评分(EagleKA,LimMJ,DabbousOH,etal.Avalidatedpredictionmodelforallformsofacutecoronarysyndrome:estimatingtheriskof6-monthpostdischargedeathinaninternationalregistry.JAMA2004；291:2727–33.)最初是为预测6个月时的死亡和/或MI而推导出的。GRACE评分以及生物标志物NTproBNP和PTA在单变量分析中是MACE的预测因素(表6)。表6：6个月时终点的Cox回归分析。单变量HR指6个月时的MACE。多变量模型包括用于预测MACE(模型1)、死亡和/或MI(模型2)以及死亡和/或HF(模型3)的GRACE评分和生物标志物。仅报道了显著的风险比。在用于6个月时MACE、死亡和/或MI以及死亡和/或HF的多变量分析中，GRACE评分和PTA仍然是预测因素，而NTproBNP仅为MACE以及死亡和/或HF模型保留(表6中的模型1和3)。对于6个月时死亡和/或MI使用接受者操作特征曲线(ROC)分析，在添加PTA的情况下，曲线下面积(AUC)仅从GRACE评分的0.695(95％CI0.649-0.741)增加至0.722(0.677-0.768)(P＝0.016，与单独的GRACE评分相比)。在将NTproBNP添加至该ROC的情况下，AUC没有进一步增加(0.722(0.676-0.768))，尽管该AUC显著大于单独的GRACE评分的AUC(P＝0.027)。采用Pencinaetal(PencinaMJ,D'AgostinoRBSr,SteyerbergEW.Extensionsofnetreclassificationimprovementcalculationstomeasureusefulnessofnewbiomarkers.StatMed.2011；30:11-21.)所描述的无类别重新分类分析(Category-freereclassificationanalysis)来计算NRI(>0)，使得对于分析不选择任意的截止概率。图3显示Steyerberg所提出的重新分类图(SteyerbergEW,VickersAJ,CookNR,GerdsT,GonenM,ObuchowskiN,PencinaMJ,KattanMW.Assessingtheperformanceofpredictionmodels.Aframeworkfortraditionalandnovelmeasures.Epidemiology2010；21:128--138.)，将仅使用GRACE评分的事件概率针对使用PTA调整的GRACE评分的事件概率作图。在没有不良后果的那些受试者中PTA调整的概率被分类到下面(即图3中的对角线以下)。NRI在没有6个月时死亡和/或MI终点的那些受试者中是22.3(95％CI15.6–29.0,P<0.0005)，而在具有终点的那些受试者中为9.3(95％CI-6.7–25.3,P＝NS)，具有31.6的总NRI(>0)(95％CI14.3–49.0,P<0.0005)，这提示PTA通过将没有终点的那些受试者分类到下面而改善了占优势的GRACE评分的风险分级(表7)。表7：连续的上下NRIp低CI高CI无终点32951822.3.00015.629.0有终点82689.3.253-6.725.3总计31.6.00014.349.0三分位数上下NRIp低CI高CI无终点861355.8.0012.39.2有终点21154.0.317-3.811.8总计9.8.0251.218.3风险阈值0.05和0.1上下NRIp低CI高CI无终点5815711.7.0008.315.1有终点610-2.7.317-7.92.6总计9.0.0052.815.3对于6个月时死亡和/或MI的终点，使用连续重新分类、三分位数或0.05和0.1两个指定的风险阈值，显示将PTA添加到仅使用GRACE评分的分类中的净重新分类改进(NRI)和NRI的显著性的重新分类分析。选择三分位数作为6个月时死亡和/或MI的概率的两个截止值时，重新分类分析表明，PTA将没有终点的那些受试者主要分类到下面，具有显著的净NRI(9.8,P<0.025)。选择6个月时死亡和/或MI的概率的两个截止值(5％和10％)时，没有6个月时死亡和/或MI的终点的那些受试者当中的NRI是11.7(P<0.0005)，而具有该终点的那些受试者当中的非显著性NRI，导致9.0的总NRI(P<0.005)。决策树分析为了确定生物标志物的最佳截点，我们构建了决策树(使用PTA和NTproBNP水平以及GRACE评分)，以将患者分为生存者或具有终点的那些受试者。对于6个月时死亡和/或MI的终点(图4)，在具有2256pmol/L以下的NTproBNP和137以下的GRACE评分的那些受试者当中，82.8pmol/L以下的PTA选择了具有低风险死亡和/或MI的亚组(n＝583,总共的50.8％)(6.3％相比原群体中的15.5％)。在使用PTA作为初始分类物的决策树中(图5)，72.08pmol/L以下的PTA水平和137以下的GRACE评分限定了其中事件率为6.8％的低风险的患者组(n＝512,总共的44.6％)。在这些当中，只有3例患者(0.26％)在6个月内死亡，以及1例(0.09％)在30天内死亡。121.6pmol/L以上的PTA水平限定了高风险的患者组，其具有37.7％的死亡/MI率和30.7％的死亡率(图5)。KaplanMeier分析使用72.1pmol/L的截止值，死亡和/或MI的复合终点的KaplanMeier生存分析证明具有水平以下(n＝689,总共的60％)或该截止值以上的那些受试者之间的显著差异(对数秩检验的P值<0.0005)(图6)。当前第1页1 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