一种康妇灵胶囊的检测方法与流程

本发明涉及一种康妇灵胶囊的检测方法，属于中药检测技术领域。

背景技术：

康妇灵胶囊是由杠板归、苦参、黄柏、鸡血藤、益母草、红花龙胆、土茯苓和当归八味制成，其功能主治为：苗医：蒙凯，布发讲港，嘎几昂代。嘎溜纳洛，巢窝蒙秋，巢窝即得。中医：清热燥湿，活血化瘀，调经止带。用于宫颈炎、阴道炎，月经不调，赤白带下，痛经，附件炎等。

康妇灵胶囊是贵州百灵企业集团和仁堂药业有限公司的独家品种，批准文号为：国药准字Z20025767。目前该药的执行标准编号为(WS-10558(ZD-0558)-2002-2012Z)，在原标准中，该药的鉴别仅有当归、黄柏和苦参3项薄层鉴别，且在苦参的薄层鉴别中，供试品前处理方法无法将主要成分苦参碱充分提出，导致主斑点不清晰，不易观察；含量测定项目也仅有黄柏中盐酸小檗碱的含量测定。

康妇灵胶囊在市场上有较高的占有率，为了保证该药的质量和疗效，就该药品目前的执行标准来看，并未对主药杠板归、臣药鸡血藤等药材进行质量控制，现有的检测项目已经不能确保康妇灵胶囊的质量得到良好控制。为进一步完善康妇灵胶囊的质量检测标准，保证药品质量的可控性以及用药的安全性，有必要建立康妇灵胶囊中杠板归鉴别方法、鸡血藤的含量测定方法、苦参的含量测定方法并修订苦参的鉴别方法，从而更好地对康妇灵胶囊产品的质量进行有效控制。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种康妇灵胶囊的检测方法，本发明针对现有质量检测标准的不足，改进了苦参的薄层鉴别方法，提升了康妇灵胶囊的质量检测标准，能够更加准确、全面、有效地控制康妇灵胶囊的产品质量。

本发明的康妇灵胶囊，按照重量份数计，是由杠板归600份、苦参300份、黄柏150份、鸡血藤300份、益母草300份、红花龙胆200份、土茯苓150份和当归180份制得。前述八味，当归粉碎成细粉，备用；其余杠板归等七味加水浸泡30分钟后，煎煮二次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.25～1.30(40℃)的清膏，加入上述当归细粉，混匀，80℃以下干燥，粉碎，制成颗粒，干燥，装入胶囊，即得。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种康妇灵胶囊的检测方法，包括性状、鉴别、检查和含量测定项目；其中鉴别是对当归、苦参、黄柏、杠板归的薄层色谱鉴别；含量测定是用高效液相色谱法测定制剂中黄柏、苦参、鸡血藤的含量；苦参的鉴别方法是以苦参碱对照品为对照，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝2～3∶1～2∶0.8～1∶0.1～0.3为展开剂的薄层色谱法。

前述检测方法中，苦参的鉴别方法具体为：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.3～0.6g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1～2mL浸润10～30分钟，再加入三氯甲烷15～25mL回流0.5～1小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；取苦参碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg苦参碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5～10μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝2～3∶1～2∶0.8～1∶0.1～0.3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

前述检测方法中，杠板归的鉴别方法是以杠板归对照药材和咖啡酸对照品为对照，以甲醇-甲酸＝200～150∶1～2为展开剂的薄层色谱法。

前述检测方法中，鸡血藤的含量测定方法是以芒柄花素对照品为对照，以乙腈-水＝35～40∶65～80为流动相的高效液相色谱法。

前述检测方法中，苦参含量测定方法是以苦参碱对照品为对照，以乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝75～85∶5～15∶5～15为流动相的高效液相色谱法。

前述检测方法中，当归的鉴别方法是以当归对照药材为对照，以正己烷-醋酸乙酯＝9∶1为展开剂的薄层色谱法；黄柏的鉴别方法是以盐酸小檗碱对照品为对照，以正丁醇-醋酸-水＝3∶1∶1为展开剂的薄层色谱法；黄柏含量测定方法是以盐酸小檗碱对照品为对照，以0.033moL/L磷酸二氢钾溶液-乙腈＝60:40为流动相的高效液相色谱法；鸡血藤的含量测定方法是以芒柄花素对照品为对照，以乙腈-水＝35∶65为流动相的高效液相色谱法；苦参含量测定方法是以苦参碱对照品为对照，以乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝80∶10∶10为流动相的高效液相色谱法。

前述检测方法中，杠板归的鉴别方法具体为：取本制剂内容物3～5g，加沸程为60～90℃的石油醚30～50mL，超声30～80分钟，滤过，除去石油醚液，药渣挥干溶剂，加水20～25mL，置80℃水浴上边振摇边热浸30～50分钟，取出，趁热滤过，滤液加稀盐酸1～3滴， 用乙酸乙酯振摇提取2～4次，每次用乙酸乙酯30～50mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使其溶解，作为供试品溶液；取杠板归对照药材2g按同样方法制成对照药材溶液；取咖啡酸对照品加甲醇制成每1mL含0.5mg咖啡酸对照品的溶液作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各1～3μL，分别点于同一聚酰胺薄膜层析板上，以甲醇-甲酸＝200～150∶1～2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

前述检测方法中，鸡血藤的含量测定方法具体为：照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水＝35～40∶65～80为流动相，检测波长为240～260nm；

对照品溶液的制备：取芒柄花素对照品，加80％甲醇溶解，制成每1mL含0.03mg芒柄花素对照品的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物3～5g，加80％甲醇40～50mL，水浴回流提取30～70分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80％甲醇10mL使其溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

具体地，前述检测方法中，苦参含量测定方法为：照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以氨基键合硅胶为填充剂，乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝75～85∶5～15∶5～15为流动相，检测波长为210～225nm，流速为0.5～1.5mL/min，柱温为28～33℃，理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取苦参碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含苦参碱对照品0.1～0.3mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.3g～0.4g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1～2mL浸润10分钟，再加入三氯甲烷20～40mL回流1～2小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μL，注入高效液相色谱仪，测 定，即得。

进一步地，本发明所述检测方法包括：

性状：本制剂为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色颗粒及粉末；气微香，味苦；

鉴别：(1)取本制剂内容物3g，研细，加正己烷20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至0.5mL，作为供试品溶液；取当归对照药材1g，加正己烷10mL，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2～5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点；

(2)取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.3g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1mL浸润10分钟，再加入三氯甲烷20mL回流1小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；取苦参碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg苦参碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5～10μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝3∶2∶1∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)取本制剂内容物1g，研细，加甲醇5mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品试液；取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg盐酸小檗碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5～10μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水＝3∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(4)取本制剂内容物5g，加沸程为60～90℃的石油醚50mL，超声30分钟，滤过，除去石油醚液，药渣挥干溶剂，加水25mL，置80℃水浴上边振摇边热浸30分钟，取出，趁热滤过，滤液加稀盐酸1滴，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次用乙酸乙酯30mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使其溶解，作为供试品溶液；取杠板归对照药材2g按同样方法制成对照药材溶液；取咖啡酸对照品加甲醇制成每1mL含0.5mg咖啡酸对照品的溶液作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜层析板上，以甲醇-甲酸＝200∶2为展 开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：(1)黄柏照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.033mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈＝60∶40为流动相，检测波长为345nm，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取在105℃干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含盐酸小檗碱对照品40μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.2g精密称定，置25mL容量瓶中，加体积比为盐酸-甲醇＝1∶100的溶液15mL，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每粒(0.4g)含黄柏以盐酸小檗碱计，不少于1.2mg；

(2)苦参照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以氨基键合硅胶为填充剂，乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝80∶10∶10为流动相，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取苦参碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含苦参碱对照品0.12mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.3g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1mL浸润10分钟，再加入三氯甲烷20mL回流1小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每粒(0.4g)含苦参以苦参碱C₁₅H₂₄N₂O计，不少于1.0mg；

(3)鸡血藤照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水＝35∶65为流 动相，检测波长为254nm；

对照品溶液的制备：取芒柄花素对照品，加80％甲醇溶解，制成每1mL含0.03mg芒柄花素对照品的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物5g，加80％甲醇50mL，水浴回流提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80％甲醇10mL使其溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂含鸡血藤以芒柄花素计,每1g不少于3.5mg。

为了确保本发明检测方法科学、合理、可行，对本发明的检测方法进行了研究和考察。

一、苦参的薄层鉴别方法学考察：

1、仪器与试药

康妇灵胶囊(20130811、20130905、20131001)贵州百灵企业集团和仁堂药业有限公司提供；苦参碱对照品(110805-200508)由中国药品生物制品检定所提供；硅胶G薄层板：青岛海洋化工厂分厂生产的预制硅胶G薄层板及自制硅胶G薄层板；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DGG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)，十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，甲醇(分析纯20130411，上海申博化工有限公司)。三氯甲烷(分析纯20140528，上海申博化工有限公司)。(备注：其中自制硅胶G薄层板是通过以下方法制备：按重量份数计，取1份薄层层析硅胶G和3份0.2％-0.5％羧甲基纤维素钠水溶液在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.2～0.3mm)，取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30分钟，即得，置于有干燥剂的干燥箱中备用。)

2、专属性试验

取康妇灵胶囊样品按照本发明苦参的鉴别项目中方法制备供试品溶液和对照品溶液；取缺苦参的阴性样品，按照苦参的鉴别项目中供试品溶液的制备方法制得阴性供试品溶液；分别取供试品溶液、阴性供试品溶液和对照品溶液点样、展开、喷以稀碘化铋钾试液后日光下检视。在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上显相同的斑点。在阴性样品色谱中，与对照品色谱相应的位置上未显斑点，且斑点分离较好，无干扰，如图1所示。

3、耐用性试验

3.1薄层板：按苦参的鉴别方法所述色谱条件，取康妇灵胶囊供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液分别点于硅胶G预制板和硅胶G自制板上，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶 液＝3∶2∶1∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，显色后，结果斑点分离好，无干扰，如图2所示。表明本发明苦参的鉴别方法适用于不同的薄层板。

3.2温度：按苦参的鉴别方法所述色谱条件，取康妇灵胶囊供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液分别点于硅胶G预制板上，在低温6℃和室温25℃下，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝3∶2∶1∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，显色后，结果斑点分离好，无干扰，如图3所示。表明温度对本发明苦参的鉴别方法不产生影响。

3.3湿度：按苦参的鉴别方法所述色谱条件，取康妇灵胶囊供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液分别点于硅胶G预制板上，在高湿度65％和低湿度32％条件下，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝3∶2∶1∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，显色后，结果斑点分离好，无干扰，如图4所示。表明湿度对本发明苦参的鉴别方法不产生影响。

本发明中苦参的鉴别方法，斑点清晰，分离好，重现性好，并且阴性对照无干扰，温度、湿度和不同薄层板均不影响鉴别效果，可作为康妇灵胶囊中苦参药材的薄层鉴别方法，故列入本发明检测项目。

二、杠板归的薄层鉴别方法学考察：

1、仪器与试药

康妇灵胶囊(20130811、20130905、20131001)贵州百灵企业集团和仁堂药业有限公司提供；杠板归对照药材(1109105-2001004)、咖啡酸对照品(110805-200102)由中国药品生物制品检定所提供；聚酰胺薄膜(上海鑫楚实业有限公司及浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)；试剂：甲醇、甲酸为分析纯；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DGG-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海齐欣科学仪器有限公司)，十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，甲醇(分析纯20130811，上海申博化工有限公司)。甲酸(分析纯20140518，上海申博化工有限公司)。

2薄层色谱条件的考察

2.1薄层板的选择

分别吸取杠板归鉴别项下的供试品溶液2μL和对照品溶液2μL，以薄层硅胶G板和聚酰胺薄膜2种不同类型材料薄层板，进行展开，取出，晾干，喷以显色剂，105℃加热5min，于365nm紫外灯下检视。见图5和图6。

由图5和图6可知，薄层硅胶G板并未将供试品分离；聚酰胺薄膜层析板分离效果良好，斑点圆整，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色斑点。故选取聚酰胺薄膜层析板展开。

2.2最佳点样量考察

分别吸取杠板归鉴别项下的供试品溶液和对照品溶液1、2、3、4、5、6μL，分别点于不同聚酰胺薄膜层析板上，进行考察，展开，取出，晾干，喷以显色剂，105℃加热5min，于365nm紫外灯下检视。见图7和图8。

由图7和图8可知，供试品2μL点样量效果最佳，当点样量大于3μL时，供试品溶液位置斑点出现拖尾现象；对照品溶液点样量1～6μL皆可，故选择点样量为1～3μL，最佳点样量2μL。

结合上述2种因素考察实验结果，可确定选用聚酰胺薄膜层析板，供试品溶液和对照品溶液最佳点样量皆为2μL。经预实验验证，确定杠板归的薄层鉴别方法，并按照《中国药典》2010版一部附录ⅩⅧA中药质量标准分析方法验证指导原则进行方法学验证。

3、专属性试验

取康妇灵胶囊样品按照本发明杠板归的鉴别项目中方法制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液；取缺杠板归的阴性样品，按照杠板归的鉴别方法中供试品溶液的制备方法制得阴性供试品溶液；分别取供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液按照杠板归的鉴别方法进行点样、展开，晾干，置于紫外光灯(365nm)下检视。在供试品色谱中，与对照药材及对照品色谱相应的位置上显相同的斑点。在阴性样品色谱中，与对照药材及对照品色谱相应的位置上未显斑点，且斑点分离较好，无干扰，如图9所示。

4、耐用性试验

4.1聚酰胺薄膜层析板：按杠板归的鉴别方法所述色谱条件，取康妇灵胶囊供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液分别点于两个不同厂家(上海鑫楚实业有限公司和浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)生产的聚酰胺薄膜层析板上，以甲醇-甲酸＝200∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，结果斑点分离好，无干扰，如图10和图11所示。表明本发明杠板归的鉴别方法适用于不同厂家生产的聚酰胺薄膜层析板。

4.2温度：按杠板归的鉴别方法所述色谱条件，取康妇灵胶囊供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液分别点于聚酰胺薄膜板上，以甲醇-甲酸＝200∶2为展开剂，在低温6℃和室温25℃下展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，结果斑点分离好，无干扰，如图12和图13所示。表明温度对本发明杠板归的鉴别方法不产生影响。

4.3湿度：按杠板归的鉴别方法所述色谱条件，取康妇灵胶囊供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液分别点于聚酰胺薄膜板上，以甲醇-甲酸＝200∶2为展开剂，分别于高湿度65％和低湿度32％条件下展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视，结果斑点分离好，无干扰，如图14和图15所示。表明湿度对本发明杠板归的鉴别方法不产生影响。

上述试验结果表明：该薄层鉴别方法效果好，可作为康妇灵胶囊中杠板归药材的鉴别方 法，故列入本发明检测项目。

三、鸡血藤含量测定的方法学考察

鸡血藤为康妇灵方中的臣药，芒柄花素是其主要有效成分，故选择以芒柄花素作为本制剂内在质量的指标成分，经试验，该方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点。

1、仪器、试剂和样品

Agilent Technologies 1200series高效液相色谱仪，KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)，甲醇(分析纯20130411，上海申博化工有限公司)，乙酸乙酯(分析纯20140328，上海申博化工有限公司)，乙腈(色谱纯20140721，上海申博化工有限公司)，芒柄花素对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，编号为112542-201405)，康妇灵胶囊(20130811、20130905、20131001、20131107、20140301、20140303、20140305、20140306、20140307、20140309、20140310、20140312、20140401、20140402、20140403贵州百灵企业集团和仁堂药业有限公司提供)，其他均为分析纯。

2、色谱条件与系统适应性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水＝35∶65为流动相，检测波长为254nm；分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μL注入高效液相色谱仪，测定。

3、对照品溶液的制备

取芒柄花素对照品，加80％甲醇溶解，制成每1mL含0.03mg芒柄花素对照品的溶液，作为对照品溶液。

4、阴性对照溶液的制备

按处方比例及制备工艺，制备不含鸡血藤药材的阴性样品，同供试品制备方法制备阴性样品溶液。

5、供试品溶液的制备

取本制剂内容物5g，加80％甲醇50mL，水浴回流提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80％甲醇10mL使其溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

6、方法学验证

6.1系统适应性试验

按照上述色谱条件及样品处理方法，进行系统适应性试验，芒柄花素峰与其他成分达到基线分离，且峰形良好；阴性样品试验结果表明其它成分对芒柄花素的测定无干扰。结果见图16、图17、图18。

6.2线性关系的考察

取3项下的对照品溶液5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μL分别进样，按上述色谱条件记录色谱图，测定峰面积，以峰面积的对数值为纵坐标，芒柄花素对照品进样量的对数值为横坐标，进行线性回归，得回归方程：Y＝1.1465X+4.5823(Y为峰面积，X为浓度)，r＝0.9999。结果表明，芒柄花素在5.5850～27.9250μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

6.3精密度试验

取3项下的对照品溶液，按2项色谱条件进行实验，进样量均为10μL，连续进样5次，测得其峰面积积分值，RSD为0.72％，仪器精密度良好。

6.4重复性试验

取同一个批号的康妇灵胶囊(批号：20140304)，平行取样6份，按5项方法操作并检测。芒柄花素平均质量分数为5.37mg/g，RSD为0.10％，表明方法重复性好。

6.5稳定性试验

取同一批号的供试品溶液(批号：20140304)，按2项色谱条件进行试验，于0、4、8、12、16、20、24h各进样一次，进样量均为10μL，按峰面积积分值计算，芒柄花素的RSD值为0.14％，表明供试品溶液中芒柄花素在24h内具有良好的稳定性。

6.6加样回收率试验

称取已知芒柄花素含量的样品(质量分数为5.28mg/g)9份，分成3组(每组3份)，置50mL量瓶中，每组分别精密加入2.5204mg/mL的芒柄花素对照品溶液4、5、6mL，加乙醇约40mL，超声处理30分钟(功率250W，频率100Hz)，放冷，用乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，按5项下，自“加80％甲醇50mL”起，同法操作，并按2项下色谱条件进样，进样量均为20μl，测定峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 芒柄花素加样回收率试验结果(n＝9)

由表1结果可见，加样回收率均值为99.90％，RSD为1.57％，该方法的准确度高。

6.7样品含量测试结果

取11批样品，同5项方法处理样品，作为供试品溶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，各取续滤液10μL，注入高效液相色谱仪，按2项色谱条件测定，用外标两点法对数方程计算样品中芒柄花素的含量，结果见表2。

表2 11批康妇灵胶囊芒柄花素含量测试结果(n＝3)

由表2结果分析，可将含量限度定为：康妇灵胶囊含鸡血藤以芒柄花素计,每1g不少于3.5mg。

四、苦参含量测定方法考察

苦参为康妇灵胶囊方中的臣药，苦参碱是其主要有效成分，故选择以苦参碱作为本制剂内在质量的指标成分，经试验验证，本发明的方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点。

1、仪器、试剂和样品

高效液相色谱仪：Agilent technologies 1200series；G13150DAD检测器；KQ-250DB型数据超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；苦参碱对照品(中国药品生物制品检定所，批号100047-200606，供含量测定)；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；康妇灵胶囊(20130811、20130905、20131001、20131107、20140301、20140303、20140305、20140306、20140307、20140309、20140310、20140312、20140401、20140402、20140403)贵州百灵企业集团和仁堂药业有限公司提供，其他均为分析纯。

2、色谱条件与系统适应性试验

以氨基键合硅胶为填充剂，乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝75～85∶5～15∶5～15为流动相，检测波长为210～225nm，流速为0.5～1.5mL/min，柱温为28～33℃，理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于3000。

3、对照品溶液的制备

取苦参碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含苦参碱对照品0.1～0.3mg的溶液， 即得。

4、阴性样品溶液的制备

按处方比例及制备工艺，制备不含苦参药材的阴性样品，同供试品制备方法制备阴性样品溶液。

5、供试品溶液的制备

取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.3～0.4g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1～2mL浸润10分钟，再加入三氯甲烷20～40mL回流1～2小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

6、方法学验证

6.1系统适应性试验

按照上述色谱条件及样品处理方法，进行系统适应性试验，苦参碱峰与其他成分达到基线分离，且峰形良好，结果见图19和图20。取阴性样品溶液，按上述方法测定，试验结果表明其它成分对苦参碱的测定无干扰。

6.2线性范围考察

精密称取苦参碱对照品10.39mg，溶于10mL容量瓶中，得浓度1.039mg·mL^-1母液，精密吸取该母液1mL分别稀释到5mL、7.5mL、10mL、15mL、25mL得到5个梯度浓度的对照品溶液。以苦参碱对照品的浓度(C)为横坐标，峰面积积分值(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y＝0.9501+6403.0546X(Y为峰面积，X为浓度)，r＝0.999976。结果表明，苦参碱在0.2078μg～1.039μg范围内，与峰面积积分值成良好的线性关系。

6.3精密度试验

精密称取苦参碱对照品5.50mg，置50mL容量瓶中，定容得浓度为0.11mg·mL^-1的对照品溶液，按2项色谱条件，精密吸取对照品溶液10μL，重复进样6次，注入高效液相色谱仪，测定，计算得苦参碱峰面积RSD为0.86％(n＝6)，表明该方法精密度良好。

6.4稳定性试验

取同一批号的供试品溶液(批号20140301)，按2项色谱条件，于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、24小时各进样一次，测得其苦参碱峰面积的RSD为1.32％(n＝6)，表明供试品溶液在室温下24h内具有良好的稳定性。

6.5重复性试验

取本制剂内容物5份，精密称定，按照5项下的制备方法制备供试品溶液，按2项色谱条件测定。结果表明康妇灵胶囊中苦参碱的平均含量为5.24％，RSD＝0.75％(n＝5)，表明该方 法重复性较好。

6.6加样回收率试验

精密称取9份样品置于50mL容量瓶中，分成3组(每组3份)，根据重复性试验结果(苦参碱含量为5.24％)，分别精密称取含量为样品中苦参碱含量80％、100％、120％的苦参碱对照品置于上述容量瓶中，溶解定容至50mL，得到低、中、高浓度的供试溶液各三份，并按2项下色谱条件进样，进样量均为5μL，测定峰面积，记录色谱图，计算回收率。结果见表3。

表3 加样回收率试验

由表3可知，本发明的苦参含量测定方法准确度良好。

6.7耐用性试验

按照3项下方法制备对照品溶液，并按2项下色谱条件进样，测定，分别考察本方法在不同流动相比例、柱温、流速和不同厂家色谱柱条件下的测定结果。如表4所示。

表4 耐用性试验

由表4可知，流动相比例、柱温、流速和色谱柱在本发明提供范围内变化，仍能准确测定样品含量，说明本发明的苦参含量测定方法耐用性良好。

6.8检测限及定量限

精密称取苦参碱对照品5.14mg溶于100mL容量瓶中，加甲醇定容，再精密吸取1mL稀释至25mL，得浓度为0.002056mg·mL^-1的对照品溶液。进空白样作为观察基线。精密吸取供试品溶液1μL注入高效液相色谱仪，信噪比S:N＝21.75，当S:N＝3时，即检测限为0.284ng，当S:N＝10时，即定量限为0.945ng。

6.9样品含量测试结果

表5 康妇灵胶囊中苦参碱含量

根据表5结果可将康妇灵胶囊中苦参碱的含量限度定为：每粒(0.4g)康妇灵胶囊中苦参含量以苦参碱C₁₅H₂₄N₂O计，不得少于1.0mg。

本发明的有益之处在于：本发明提供的康妇灵胶囊的检测方法改进了苦参的鉴别方法，增加了杠板归的鉴别项目和鸡血藤、苦参的含量测定项目。其中苦参、杠板归的鉴别方法操作简单、分离度高、重现性好，并且阴性对照无干扰；苦参、鸡血藤含量测定方法，高效液相色谱图峰形好、分离度高，能够实现对苦参、鸡血藤含量进行快速、准确、高重现性、高回收率的测定。本发明的检测方法专属性强、精密度高、重复性好、回收率高、稳定性高、测量结果准确，提升了康妇灵胶囊的质量检测标准，进一步确保了产品质量的稳定以及临床用药的安全、有效。

附图说明

图1是本发明的苦参鉴别方法考察中供试品溶液、阴性供试品溶液和对照品溶液的薄层色谱图；

图2是苦参鉴别方法考察中分别采用硅胶G自制板和硅胶G预制板作为层析板的薄层色谱图；

图3是苦参鉴别方法考察中在低温6℃和室温25℃下的薄层色谱图；

图4是苦参鉴别方法考察中在65％湿度和32％湿度下的薄层色谱图；

图5是杠板归鉴别方法考察中用薄层硅胶G板的杠板归薄层色谱图；

图6是杠板归鉴别方法考察中用聚酰胺薄膜层析板的杠板归薄层色谱图；

图7是杠板归鉴别方法考察中供试品溶液点样量分别为1、2、3、4、5、6μL的薄层色谱图；

图8是杠板归鉴别方法考察中对照品溶液点样量分别为1、2、3、4、5、6μL的薄层色谱图；

图9是杠板归鉴别方法考察中供试品溶液、阴性供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液的薄层色谱图；

图10是杠板归鉴别方法考察中采用上海鑫楚实业的聚酰胺薄膜层析板的薄层色谱图；

图11是杠板归鉴别方法考察中采用浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂的聚酰胺薄膜层析板的薄层色谱图；

图12是杠板归鉴别方法考察中在低温6℃下的薄层色谱图；

图13是杠板归鉴别方法考察中在室温下的薄层色谱图；

图14是杠板归鉴别方法考察中在32％湿度下的薄层色谱图；

图15是杠板归鉴别方法考察中在65％湿度下的薄层色谱图；

图16是鸡血藤的含量测定考察中芒柄花素对照品HPLC色谱图；

图17是鸡血藤的含量测定考察中康妇灵胶囊样品HPLC色谱图；

图18是鸡血藤的含量测定考察中康妇灵胶囊阴性样品HPLC色谱图；

图19是苦参含量测定方法考察中苦参碱对照品的HPLC色谱图；

图20是苦参含量测定方法考察中康妇灵胶囊样品的HPLC色谱图；

图中附图标记的含义：图1～图4中：1胶囊样品20140301,2胶囊样品20140302，3胶囊样品20140303,4缺苦参的阴性样品，5苦参碱对照品；图5中：1胶囊样品20140301,2胶囊样品20140302，3胶囊样品20140303,4～5咖啡酸对照品；图6中：1胶囊样品20140301,2胶囊样品20140302，3胶囊样品20140303,4咖啡酸对照品；图9～图15中:1胶囊样品20140301,2胶囊样品20140302，3胶囊样品20140303,4杠板归对照药材，5咖啡酸对照品，6缺杠板归的阴性样品。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。

实施例1康妇灵胶囊具体的检测方法包括：

性状：本制剂为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色颗粒及粉末；气微香，味苦；

鉴别：(1)取本制剂内容物3g，研细，加正己烷20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至0.5mL，作为供试品溶液；取当归对照药材1g，加正己烷10mL，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各3μL，分 别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点；

(2)取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.3g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1mL浸润10分钟，再加入三氯甲烷20mL回流1小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；取苦参碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg苦参碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液8μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝3∶2∶1∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)取本制剂内容物1g，研细，加甲醇5mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品试液；取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg盐酸小檗碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液8μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水＝3∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(4)取本制剂内容物5g，加沸程为60～90℃的石油醚50mL，超声30分钟，滤过，除去石油醚液，药渣挥干溶剂，加水25mL，置80℃水浴上边振摇边热浸30分钟，取出，趁热滤过，滤液加稀盐酸1滴，用乙酸乙酯振摇提取2次，每次用乙酸乙酯30mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使其溶解，作为供试品溶液；取杠板归对照药材2g按同样方法制成对照药材溶液；取咖啡酸对照品加甲醇制成每1mL含0.5mg咖啡酸对照品的溶液作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜层析板上，以甲醇-甲酸＝200∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：(1)黄柏照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.033mol/L磷酸二氢 钾溶液-乙腈＝60∶40为流动相，检测波长为345nm，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取在105℃干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含盐酸小檗碱对照品40μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.2g精密称定，置25mL容量瓶中，加体积比为盐酸-甲醇＝1∶100的溶液15mL，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每粒(0.4g)含黄柏以盐酸小檗碱计，不得少于1.2mg。

(2)苦参照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以氨基键合硅胶为填充剂，乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝80∶10∶10为流动相，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取苦参碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含苦参碱对照品0.12mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.3g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1mL浸润10分钟，再加入三氯甲烷20mL回流1小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每粒(0.4g)含苦参以苦参碱C₁₅H₂₄N₂O计，不得少于1.0mg；

(3)鸡血藤照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水＝35∶65为流动相，检测波长为254nm；

对照品溶液的制备：取芒柄花素对照品，加80％甲醇溶解，制成每1mL含0.03mg芒柄花素对照品的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物5g，加80％甲醇50mL，水浴回流提取30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80％甲醇10mL使其溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂含鸡血藤以芒柄花素计,每1g不少于3.5mg。

实施例2康妇灵胶囊具体的检测方法包括：

性状：本制剂为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色颗粒及粉末；气微香，味苦；

鉴别：(1)取本制剂内容物3g，研细，加正己烷20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至0.5mL，作为供试品溶液；取当归对照药材1g，加正己烷10mL，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点；

(2)取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.6g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水2mL浸润30分钟，再加入三氯甲烷25mL回流0.5小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；取苦参碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg苦参碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝2∶1∶0.8∶0.3为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(3)取本制剂内容物1g，研细，加甲醇5mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品试液；取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg盐酸小檗碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水＝3∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：黄柏照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.033mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈＝60∶40为流动相，检测波长为345nm，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取在105℃干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含盐酸小檗碱对照品40μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.2g精密称定，置25mL容量瓶中，加体积比为盐酸-甲醇＝1∶100的溶液15mL，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每粒(0.4g)含黄柏以盐酸小檗碱计，不得少于1.2mg。

实施例3康妇灵胶囊具体的检测方法包括：

性状：本制剂为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色颗粒及粉末；气微香，味苦；

鉴别：(1)取本制剂内容物3g，研细，加正己烷20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至0.5mL，作为供试品溶液；取当归对照药材1g，加正己烷10mL，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点；

(2)取本制剂内容物1g，研细，加甲醇5mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品试液；取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg盐酸小檗碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水＝3∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(3)取本制剂内容物3g，加沸程为60～90℃的石油醚30mL，超声80分钟，滤过，除去石油醚液，药渣挥干溶剂，加水20mL，置80℃水浴上边振摇边热浸50分钟，取出，趁热滤过，滤液加稀盐酸3滴，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次用乙酸乙酯50mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使其溶解，作为供试品溶液；取杠板归对照药材2g按同样方法制成对照药材溶液；取咖啡酸对照品加甲醇制成每1mL含0.5mg咖啡酸对照品的溶液作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各3μL，分别点于同一聚酰胺薄膜层析板上，以甲醇-甲酸＝150∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光 斑点；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：(1)黄柏照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.033mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈＝60∶40为流动相，检测波长为345nm，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取在105℃干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含盐酸小檗碱对照品40μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.2g精密称定，置25mL容量瓶中，加体积比为盐酸-甲醇＝1∶100的溶液15mL，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每粒(0.4g)含黄柏以盐酸小檗碱计，不得少于1.2mg；

(2)鸡血藤照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水＝40∶70为流动相，检测波长为240nm；

对照品溶液的制备：取芒柄花素对照品，加80％甲醇溶解，制成每1mL含0.03mg芒柄花素对照品的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物3g，加80％甲醇40mL，水浴回流提取70分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80％甲醇10mL使其溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂含鸡血藤以芒柄花素计,每1g不少于3.5mg。

实施例4康妇灵胶囊具体的检测方法包括：

性状：本制剂为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色颗粒及粉末；气微香，味苦；

鉴别：(1)取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.4g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1.5mL浸润20分钟，再加入三氯甲烷15mL回流0.75小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品 溶液；取苦参碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg苦参碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝2∶2∶0.9∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)取本制剂内容物4g，加沸程为60～90℃的石油醚40mL，超声50分钟，滤过，除去石油醚液，药渣挥干溶剂，加水22mL，置80℃水浴上边振摇边热浸40分钟，取出，趁热滤过，滤液加稀盐酸2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次用乙酸乙酯40mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使其溶解，作为供试品溶液；取杠板归对照药材2g按同样方法制成对照药材溶液；取咖啡酸对照品加甲醇制成每1mL含0.5mg咖啡酸对照品的溶液作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各1μL，分别点于同一聚酰胺薄膜层析板上，以甲醇-甲酸＝180∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：苦参照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以氨基键合硅胶为填充剂，乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝85∶5∶10为流动相，检测波长为225nm，流速为1.5mL/min，柱温为33℃，理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取苦参碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含苦参碱对照品0.3mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.4g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1.5mL浸润10分钟，再加入三氯甲烷40mL回流2小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每粒(0.4g)含苦参以苦参碱C₁₅H₂₄N₂O计，不得少于1.0mg。

实施例5康妇灵胶囊具体的检测方法包括：

性状：本制剂为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色颗粒及粉末；气微香，味苦；

鉴别：(1)取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.5g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水2mL浸润15分钟，再加入三氯甲烷22mL回流0.8小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；取苦参碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg苦参碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液9μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝3∶1∶0.9∶0.2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)取本制剂内容物3.5g，加沸程为60～90℃的石油醚35mL，超声60分钟，滤过，除去石油醚液，药渣挥干溶剂，加水24mL，置80℃水浴上边振摇边热浸45分钟，取出，趁热滤过，滤液加稀盐酸3滴，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次用乙酸乙酯45mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使其溶解，作为供试品溶液；取杠板归对照药材2g按同样方法制成对照药材溶液；取咖啡酸对照品加甲醇制成每1mL含0.5mg咖啡酸对照品的溶液作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各1μL，分别点于同一聚酰胺薄膜层析板上，以甲醇-甲酸＝160∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：(1)苦参照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以氨基键合硅胶为填充剂，乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝75∶10∶15为流动相，检测波长为210nm，流速为0.5mL/min，柱温为28℃，理论塔板数按苦参碱峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取苦参碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含苦参碱对照品0.2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.35g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水2mL浸润10分钟，再加入三氯甲烷30mL回流1.5小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入高效液相色谱仪，测定， 即得；

本制剂每粒(0.4g)含苦参以苦参碱C₁₅H₂₄N₂O计，不得少于1.0mg；

(2)鸡血藤照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水＝38∶72为流动相，检测波长为260nm；

对照品溶液的制备：取芒柄花素对照品，加80％甲醇溶解，制成每1mL含0.03mg芒柄花素对照品的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物4g，加80％甲醇45mL，水浴回流提取50分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80％甲醇10mL使其溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂含鸡血藤以芒柄花素计,每1g不少于3.5mg。

实施例6康妇灵胶囊具体的检测方法包括：

性状：本制剂为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色颗粒及粉末；气微香，味苦；

鉴别：(1)取本制剂内容物3g，研细，加正己烷20mL，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至0.5mL，作为供试品溶液；取当归对照药材1g，加正己烷10mL，同法制成对照药材溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯＝9∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点；

(2)取本制剂内容物1g，研细，加甲醇5mL，超声处理30分钟，滤过，滤液作为供试品试液；取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg盐酸小檗碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液6μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸-水＝3∶1∶1为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：苦参照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以氨基键合硅胶为填充剂，乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液＝80∶15∶5为流动相，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min，柱温为32℃，理论塔板数按苦参碱 峰计算应不低于3000；

对照品溶液的制备：取苦参碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含苦参碱对照品0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.3g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1mL浸润10分钟，再加入三氯甲烷25mL回流1小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每粒(0.4g)含苦参以苦参碱C₁₅H₂₄N₂O计，不得少于1.0mg。

实施例7康妇灵胶囊具体的检测方法包括：

性状：本制剂为胶囊剂，内容物为棕黄色至棕褐色颗粒及粉末；气微香，味苦；

鉴别：(1)取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.3g精密称定，置具塞锥形瓶中,加氨水1mL浸润25分钟，再加入三氯甲烷20mL回流1小时，放冷，滤过，用三氯甲烷洗涤锥形瓶及滤渣后再次过滤，合并滤液，蒸干，残渣加无水乙醇溶解，转移至5mL容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，再用0.45μm滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；取苦参碱对照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg苦参碱对照品的溶液，作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液7μL，吸取对照品溶液2μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以丙酮-甲苯-醋酸乙酯-浓氨溶液＝3∶2∶1∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)取本制剂内容物4.5g，加沸程为60～90℃的石油醚45mL，超声45分钟，滤过，除去石油醚液，药渣挥干溶剂，加水23mL，置80℃水浴上边振摇边热浸35分钟，取出，趁热滤过，滤液加稀盐酸2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次用乙酸乙酯35mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使其溶解，作为供试品溶液；取杠板归对照药材2g按同样方法制成对照药材溶液；取咖啡酸对照品加甲醇制成每1mL含0.5mg咖啡酸对照品的溶液作为对照品溶液；照《中国药典》2010年版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜层析板上，以甲醇-甲酸＝190∶2为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：应符合《中国药典》2010年版一部附录ⅠL胶囊剂项下有关的各项规定；

含量测定：(1)黄柏照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.033mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈＝60∶40为流动相，检测波长为345nm，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取在105℃干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL中含盐酸小檗碱对照品40μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物，研细，混匀，取0.2g精密称定，置25mL容量瓶中，加体积比为盐酸-甲醇＝1∶100的溶液15mL，超声处理20分钟，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每粒(0.4g)含黄柏以盐酸小檗碱计，不得少于1.2mg；

(2)鸡血藤照《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水＝40∶80为流动相，检测波长为250nm；

对照品溶液的制备：取芒柄花素对照品，加80％甲醇溶解，制成每1mL含0.03mg芒柄花素对照品的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备：取本制剂装量差异项下的内容物5g，加80％甲醇50mL，水浴回流提取60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加80％甲醇10mL使其溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得；

本制剂含鸡血藤以芒柄花素计,每1g不少于3.5mg。