区别两不同产地的同一种茶叶产品的方法与流程

本发明为有关一种区别两不同产地的同一种茶叶产品的方法，尤其是台湾金萱茶与越南金萱茶的区别。

背景技术：

茶是一种全球风行的嗜好性饮料，世界各地都有其特殊与爱好的风味茶品。在我国是以兼具果香与奶香的半发酵茶品较受国人喜爱，例如：包种茶及乌龙茶。其中金萱品种的茶树(台茶12号)，由于树势强健，环境适应力强，且叶片大型与厚实，浓绿且富光泽，呈椭圆形状，非常适合用来制作包种茶及乌龙茶。然而，台湾产制的金萱茶由于人工成本愈来愈高，许多业者已将茶树移至人工较为便宜的越南种植，并在该地进行制茶，然后再销回台湾，并佯称是台湾产制的金萱茶，以较高价格出售。由于两地的金萱茶在茶树品种、制茶技艺、茶叶外观与茶汤色香风味上几乎无法分辨，使得茶商们有恃无恐地以越南金萱茶来混充台湾金萱茶。因此，不论是消费者或主管机关，均希望有一套快速且能够确实分辨两地茶叶的方法，以应用在台湾金萱与越南金萱的分辨上。

无特定标的化学分析(non-targeted chemical analysis)是针对食品掺杂、造假等议题而逐渐为人所知的化学分析技术，其作法是针对样品进行全然且无偏见的(holistic and unbiased)化学分析，再利用所分析的化学结果进行统计运算，以顺利区别两组不同来源、处理、加工方式等的样品(Gallart-Ayala,H.,Chéreau,S.,Dervilly-Pinel,G.,and Le Bizec,B.2015.Potential of mass spectrometry metabolomics for chemical food safety.Bioanalysis 7:133-146)。还有例如Pongsuwan等人(Pongsuwan,W.,Fukusaki,E.,Bamba,T.,Yonetani,T.,Yamahara,T.,and Kobayashi,A.2007.Prediction of Japanese green tea ranking by gas chromatography/mass spectrometry-based hydrophilic metabolite fingerprinting.J.Agric.Food Chem.55:231-236)和Chen等人(Chen,Y.-H.,Liu,Y.-H.,Wu,Y.-J.,and Chen,C.-C.2014.Metabolomic studies using high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry to discover quality markers for Oriental Beauty(dongfang meiren)tea.Food Nutr.Sci.5:823-834)利用无特定标的化学分析法来区分不同等级的茶叶；Lee等人(Lee,J.E.,Lee,B.J.,Chung,J.O.,Kim,H.N.,Kim,E.H.,Jung,S.,Lee,H.,Lee,S.J.,and Hong,Y.S. 2015.Metabolomic unveiling of a diverse range of green tea(Camellia sinensis)metabolites dependent on geography.Food Chem.174:452-459)则利用无特定标的化学分析法得知不同地域来源的茶叶会有化学组成的差异；Xie等人(Xie,G.,Ye,M.,Wang,Y.,Ni,Y.,Su,M.,Huang,H.,Qiu,M.,Zhao,A.,Zheng,X.,Chen,T.,and Jia,W.2009.Characterization of pu-erh tea using chemical and metabolic profiling approaches.J.Agric.Food Chem.57:3046-3054)以无特定标的化学分析法来鉴别不同普洱茶。

对于样品进行全然且无偏见的化学分析，在目前的技艺是使用超高分辨率的质谱设备(mass spectrometer)(飞行时间式质谱或傅立叶变换式质谱)或核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)设备。这两种均是价格昂贵且一般消费者或检验管理机关不易拥有的设备，使得要利用无特定标的化学分析法来分辨不同来源、处理或加工方式等的样品，有其执行上的困难。同时，无特定标的化学分析法针对样品进行的全然且无偏见的化学分析，常常会得到许多对分辨两组样品的解析能力不足的化学因子，这些化学因子可以被视为在分辨两组样品上是作用轻微且累赘的。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种可以使用较为便宜简单的分析设备进行两不同产地的同一种茶叶产品的快速区别方法，例如：HPLC搭配分光亮度法或HPLC搭配串联质谱检测法等。HPLC代表高效液相层析法的缩写。

本发明的另一目的在于提供一种区别越南金萱茶与台湾金萱茶的方法。

本发明的又另一目的在于提供用于区别越南金萱茶与台湾金萱茶的一组选定的化学成分。

本发明的又另一目的在于提供以质谱分析来区别越南金萱茶与台湾金萱茶的一组选定的质荷比。

依本发明所完成的一种区别两不同产地的同一种茶叶产品的方法包含下列步骤，其中该同一种茶叶产品系指以同种的茶树及相同的制程所生产者：

a)对两个待测的同一种茶叶产品进行萃取，得到对应的两个萃取液；

b)对该两个萃取液分别针对一组选定的化学成分进行含量分析，于是获得该两个萃取液在该组选定的化学成分的含量数据；

c)对所得到的该两个萃取液的含量数据进行比较，由比较的结果判定该两个待测的同一种茶叶产品是否来自相同产地。

优选的，该含量分析为液相层析法搭配分光亮度法。

优选的，其中该含量分析为液相层析法串联质谱检测法，该含量数据为质荷比的信号 强度数据。

优选的，该同一种茶叶产品是指从金萱茶茶树所制作者。

优选的，该两个待测的同一种茶叶产品中的一个为从台湾地区的金萱茶茶树所制作者。更优选的，该两个待测的同一种茶叶产品中的另一个为从越南地区的金萱茶茶树所制作者。最优选的，该组选定的化学成分以包括195.08746、459.09152、307.08102及473.10748的一组质荷比代替；或者以包括准确到前述质荷比的小数点以下第4位、第3位、第2位、第1位或整数字的一组质荷比代替。或者，该组选定的化学成分以包括选自下列群组的四个或四个以上的一组质荷比代替，该群组由123.04414、139.03874、151.03879、151.03885、181.12222、195.08746、273.07553、287.05487、319.04459、419.15247、359.07605、411.10733、419.09705、459.09152、465.10284、481.09732、595.14410、595.16559、595.16553、611.16028、139.03880、151.03886、153.05457、167.03398、167.03374、181.04922、227.12781、247.00400、247.13293、247.13281、275.09137、289.07047,、289.07031、307.08102、331.15366、397.16443、473.10748和487.12326所组成；或者以选出的该组质荷比但只准确到它们的小数点以下第4位、第3位、第2位、第1位或整数字的一组质荷比代替。

优选的，该萃取依欧盟QuEChERS方法进行。

优选的，该比较为多变方统计分析。

附图说明

图1为台湾金萱茶(T，n＝5)与越南金萱茶(V，n＝5)进行液相层析串联质谱仪扫描分析，以表2所列的全部质荷比(m/z)的信号强度的多变方统计分析评价图。

图2为以表2所列的全部质荷比(m/z)的信号强度的负载图。

图3为台湾金萱茶(T，n＝5)与越南金萱茶(V，n＝5)进行液相层析串联质谱仪扫描分析，以挑选出来的四个化学成分(质荷比(m/z))的组合所得到的质荷比(m/z)信号强度的多变方统计分析评价图。

图4为台湾金萱茶(T，n＝5)、越南金萱茶(V，n＝5)、与台湾金萱茶/越南金萱茶1:1混合(M，n＝5)进行液相层析串联质谱仪扫描分析，以挑选出来的四个化学成分(质荷比(m/z))的组合所得到的质荷比(m/z)信号强度的多变方统计分析评价图。

具体实施方式

本发明提供一种区别越南金萱茶与台湾金萱茶的方法，包含下列步骤：

a)对一个待测的金萱茶产品进行萃取，得到一个萃取液；

b)对该萃取液针对一组选定的化学成分进行含量分析，于是获得该萃取液在该组选 定的化学成分的含量数据；

c)对所得到的该萃取液的含量数据与预先依相同于前述步骤a)及b)的萃取及分析方法测得的台湾金萱茶的该组选定的化学成分的含量数据进行比较，由比较的结果判定该待测的金萱茶产品为越南金萱茶或台湾金萱茶，或越南金萱茶和台湾金萱茶的混合。

优选的，该含量分析为液相层析法搭配分光亮度法。

优选的，该含量分析为液相层析法串联质谱检测法。

优选的，该组选定的化学成分以包括195.08746、459.09152、307.08102及473.10748的一组质荷比代替；或者以包括准确到前述质荷比的小数点以下第4位、第3位、第2位、第1位或整数字的一组质荷比代替。

优选的，该组选定的化学成分以包括选自下列群组的四个或四个以上的一组质荷比代替，该群组由123.04414、139.03874、151.03879、151.03885、181.12222、195.08746、273.07553、287.05487、319.04459、419.15247、359.07605、411.10733、419.09705、459.09152、465.10284、481.09732、595.14410、595.16559、595.16553、611.16028、139.03880、151.03886、153.05457、167.03398、167.03374、181.04922、227.12781、247.00400、247.13293、247.13281、275.09137、289.07047、289.07031、307.08102、331.15366、397.16443、473.10748和487.12326所组成；或者以选出的该组质荷比但只准确到它们的小数点以下第4位、第3位、第2位、第1位或整数字的一组质荷比代替。

优选的，该萃取依欧盟QuEChERS方法进行。

优选的，该比较为多变方统计分析。

于本发明的优选实施例中利用傅立叶变换式质谱，针对台湾金萱茶与越南金萱茶分别进行全然且无偏见的化学分析，再经由统计分析后，挑选一组足够区分台湾金萱茶与越南金萱茶的化学成分(质荷比)，可以提供使用较为便宜简单的分析设备进行有特定标的的快速检测，以达到分辨台湾金萱茶与越南金萱茶的目的。

本发明是依照无特定标的化学分析方法流程来进行，首先取得具有代表性的台湾金萱与越南金萱茶叶样品，先以欧盟标准的QuEChERs萃取方法进行茶叶的萃取，之后再分别将萃取物以液相层析仪串联Q Exactive^TM Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪进行全然且无偏见的化学组成扫描分析，所得结果经统计分析后，从中挑选具有标准分析波峰型态的质谱质荷比(mass charge ratio，m/z)分析信号，且此m/z信号在台湾金萱与越南金萱茶叶两组样品间的差异至少达10％以上者，于各种化学物质数据库中查询这些m/z信号所代表的化学成分，则此化学成分的组合即为可以区别台湾金萱与越南金萱的化学因子组合。

实施例1

步骤1.金萱茶叶的萃取

茶叶先行使用食物研磨机(Cuisinart SG-10TW，Conair Co.，East Windsor，NJ，USA)研磨1分钟，而后采用标准的欧盟QuEChERS方法进行萃取。详细流程是秤取0.5g粉碎的茶叶样品，置于50mL离心管中，加入9.5mL的H₂O，剧烈振荡1min后静置30min。而后加入10mL的乙腈(acetonitrile)(含1％醋酸)剧烈振荡1min，再加入QuEChERS萃取包(含4g MgSO₄、1g NaCl、1g柠檬酸钠盐(Na Citrate)、0.5g柠檬酸二钠盐倍半水合物(disodium citrate sesquihydrate))及陶瓷均质石，剧烈振荡20sec后以4000rpm离心5min。从中取出6mL乙腈萃取液置于15mL的QuEChERS吸附管中，加入QuEChERS吸附包粉末(含900mg MgSO₄及150mg PSA)及陶瓷均质石剧烈振荡1min后，以4000rpm离心5min。取1mL澄清离心液，以氮气吹干，再加入1mL的乙腈/H₂O(1/9，v/v)溶解，即得金萱茶叶的萃取物。

步骤2.金萱茶叶萃取物的液相层析串联质谱仪扫描分析

金萱茶叶的萃取物在分析前先以乙腈/H₂O(1/9，v/v)稀释成1/10，经0.22μm滤膜过滤后即可直接以液相层析仪串联Q Exactive^TM Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪分析。分析条件为使用phenyl-hexyl官能基的液相层析管柱(3μm Phenyl-Hexyl150×2mm)，冲提液流速为0.2mL/min，其中冲提液的梯度变化使用冲提液A(H₂O，含0.1％甲酸)及冲提液B(乙腈，含0.1％甲酸)进行调整，如表1所示。质谱仪的分析条件为扫描m/z 50至1000的正离子，并同时撷取二次质谱的信号。

步骤3.金萱茶叶萃取物的液相层析串联质谱仪扫描数据处理

由液相层析串联质谱仪分析所得的台湾金萱与越南金萱茶叶两组样品间的m/z数据，以SIEVE软件进行数据的比对(alignment)处理，而后进行台湾金萱与越南金萱茶叶两组样品分析数据m/z信号强度的统计分析，由分析所得结果，挑出在台湾金萱与越南金萱两组样品间差异至少10％的m/z值(表2)，这些挑选出来的m/z值的质谱分析信号，即为可以区别台湾金萱与越南金萱的质谱信号。

表1、液相层析串联质谱仪扫描分析的冲提液梯度变化

步骤4.质谱信号的化学身分确认

以挑选出来的m/z值质谱分析信号，进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库的搜寻比对，以找出特定m/z值质谱信号的化学身分(chemical identity)，并辅以二次质谱分析结果来判断。结果每一个m/z值所对应的化学身分如表2的化学因子所示，即为可以区别台湾金萱与越南金萱的化学因子(m/z值)组合。

表2、可区别台湾金萱与越南金萱茶叶的化学因子组合

步骤5.以表2的化学成分区分台湾金萱与越南金萱

针对台湾金萱与越南金萱两组样品，各进行五个样品的分析，以表2中所列的全部化学因子质谱m/z数值进行液相层析仪串联Q Exactive^TM Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪分析，将其分析所得的信号强度进行两组样品间的多变方统计分析(多变方统计分析是采用Statistica 6.0软件包的Factor Analysis模块(StatSoft Inc.,Tulsa,OK,USA)，结果如图1的评价图(score plot)所示。从图1可以观测到台湾金萱与越南金萱样品区分成两组，显示表2中所列的全部化学因子的质谱m/z数值，可以怍为区分台湾金萱与越南金萱的用。

实施例2

以挑选出来的化学成分组合辨别越南金萱茶叶与台湾金萱茶叶

以表2中所列的全部化学因子质谱m/z数值所得的信号强度进行负载图(loading plot)分析(采用Statistica 6.0软件包的Factor Analysis模块(StatSoft Inc.,Tulsa,OK,USA)，结果如图2的负载图(loading plot)所示。如图2所示，其中195.08746、307.08102、459.09152与473.10748等四个化学因子明显偏离原点，显示这四个化学因子对于区别台湾金萱与越南金萱的差异有较大的贡献。

重复实施例1的步骤5的方法进行台湾金萱与越南金萱的区分，但仅针对95.08746、307.08102、459.09152与473.10748等四个化学因子的m/z值信号强度，进行多变方的主成分统计分析，结果如图3的评价图(score plot)所示。图3的评价图类似于图1的评价图，从其中可以观测到台湾金萱与越南金萱样品区分成两组，显示这一组挑选出来的化学因子组合，可以做为区分台湾金萱与越南金萱之用。这些挑选出来的化学成分也可经由其 它习知的分析技术来获得浓度，例如：HPLC搭配分光亮度法或HPLC搭配串联质谱检测法等。

实施例3

以挑选出来的化学成分组合辨别掺有越南金萱茶叶的台湾金萱茶叶

将台湾金萱茶叶与越南金萱茶叶以1:1(w/w)混合后，依照实施例2的步骤进行1辨别，结果如图4所示。从图4可以发现1:1混合的金萱茶在主成分分析的评价图上，明显和台湾金萱茶区分开来，显示若台湾金萱茶混有越南金萱茶，可以利用本案的化学成分组合来加以区别。