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：：中药配方颗粒是对传统中药饮片汤剂进行剂型改革的一类新产品，枸杞子配方颗粒是其中的一种。枸杞子是中药汤剂常用的中药饮片，因此枸杞子配方颗粒自然是一种常用的中药配方颗粒。目前尚无枸杞子配方颗粒的含量测定方法，无益于枸杞子配方颗粒的临床应用与管理。为保证枸杞子配方颗粒的临床应用的安全性与有效性，制定可控、可行的含量测定方法势在必行。中国药典2010年版一部枸杞子药材项下以甜菜碱为对照品，采用薄层色谱双波长扫描法测定其含量，该方法操作复杂，重现性不好，精确性差，现已很少采用。也有文献报道，采用HPLC法测定枸杞子药材中的甜菜碱含量，但对供试品溶液的处理多采用离子交换树脂方法，操作烦杂，误差较大，重现性不好。目前枸杞子药材中甜菜碱的含量测定方法对建立枸杞子配方颗粒中甜菜碱含量测定的方法参考价值不大。技术实现要素：：本发明采用HPLC法测定枸杞子配方颗粒中甜菜碱的含量，首先对色谱条件与系统适用性试验进行了研究，考察了不同的色谱柱和流动相，最后确定的色谱条件与系统适用性试验：以氨基键合硅胶为填充剂；以乙腈－水（85:15）为流动相；检测波长为200nm。理论板数按甜菜碱峰计算不低于3000。在确定了色谱条件及系统适用性试验之后，重点考察了供试品溶液的处理方法。由于甜菜碱的理化性质，在上述色谱条件下，枸杞子配方颗粒中的其它成分对其测定影响较大，因此提纯除杂是供试品溶液处理方法的关键，本发明考察了多种提纯除杂的方法，最后确定采用碱性氧化铝柱层析的方法，具体试验研究如下：取供试品适量，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇50ml，超声处理30min，放冷，滤过，并用少量甲醇洗涤容器和残渣，洗液并入滤液中，回收甲醇至小体积，加入碱性氧化铝2g，拌样，加入到已装好的碱性氧化铝柱（8g，用1,2-二氯乙烷湿法装柱）上，以50ml为1组分，依次按表1顺序洗脱，分别收集各组分，蒸干，残渣加水溶解并转移至25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按确定的色谱条件测定，计算每组分中含甜菜碱的量。结果见表1。表1不同洗脱溶媒的测定结果编号洗脱溶媒甜菜碱的量（mg）11,2-二氯乙烷021,2-二氯乙烷－甲醇（95:5）031,2-二氯乙烷－甲醇（90:10）041,2-二氯乙烷－甲醇（85:15）051,2-二氯乙烷－甲醇（80:20）0.038661,2-二氯乙烷－甲醇（70:30）0.315371,2-二氯乙烷－甲醇（60:40）0.413281,2-二氯乙烷－甲醇（50:50）0.516391,2-二氯乙烷－甲醇（40:60）0.0871101,2-二氯乙烷－甲醇（30:70）0.1195111,2-二氯乙烷－甲醇（20:80）——121,2-二氯乙烷－甲醇（10:90）——13甲醇——结果表明：甜菜碱在1,2-二氯乙烷－甲醇（80:20）时，开始洗脱下来，在1,2-二氯乙烷－甲醇（30:70）时，开始出现杂质峰，干扰测定，1,2-二氯乙烷－甲醇（70:30）到（50:50）时洗脱的最多，故洗脱溶媒选择1,2-二氯乙烷－甲醇（50:50）；经过试验验证，以1,2-二氯乙烷－甲醇（50:50）为提取溶媒与甲醇的提取效果相当，且操作简便，故提取溶媒也选择1,2-二氯乙烷－甲醇（50:50）。供试品溶液处理方法中各参数的考察试验内容如下：（1）提取时间的选择：取供试品适量，研细，称取约400mg，精密称定，共4份，置具塞锥形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，分别超声处理10min、20min、30min、40min，放冷，滤过，并用少量混合液洗涤容器及药渣，洗液并入滤液中，滤液通过碱性氧化铝柱（内径1.5cm，10g，干法装柱），用150ml混合液洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按确定色谱条件测定，计算每相当于1g饮片的配方颗粒中含甜菜碱的量。结果表明：超声30min提取的甜菜碱的量与40min时相比，其含量基本一致，故提取时间选择30min。结果见表2。表2不同提取时间的测定结果提取时间（min）10203040含量（mg/g）1.80561.91082.08042.0892（2）提取溶媒量的选择：取供试品适量，研细，称取约400mg，精密称定，共3份，置具塞锥形瓶中，分别加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）25ml、50ml、100ml，超声处理30min，放冷，滤过，并用少量混合液洗涤容器及药渣，洗液并入滤液中，滤液通过碱性氧化铝柱（内径1.5cm，10g，干法装柱），用150ml混合液洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按确定色谱条件测定，计算每相当于1g饮片的配方颗粒中含甜菜碱的量。结果表明：50ml混合液提取的甜菜碱的量与100ml时相比，其含量基本一致，故提取溶媒的量选择50ml。结果见表3。表3不同提取溶媒用量的测定结果溶媒用量（ml）2550100含量（mg/g）1.93442.08242.0792（3）碱性氧化铝用量的选择：取供试品适量，研细，称取约400mg，精密称定，共4份，置具塞锥形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，超声处理30min，放冷，滤过，并用少量混合液洗涤容器及药渣，洗液并入滤液中，滤液分别通过碱性氧化铝柱（内径1.5cm，4g、6g、8g、10g，干法装柱），用150ml混合液洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按确定色谱条件测定，计算每相当于1g饮片的配方颗粒中含甜菜碱的量。结果表明：碱性氧化铝的用量对甜菜碱的量影响不大，但用量为4g时，其杂质与6g、8g和10g时相比较多，故碱性氧化铝用量选择6~10g。结果见表4。表4不同碱性氧化铝用量的测定结果碱性氧化铝用量（g）46810含量（mg/g）2.14042.12242.10882.0932（4）洗脱量的选择：取供试品适量，研细，称取约400mg，精密称定，共4份，置具塞锥形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，超声处理30min，放冷，滤过，并用少量混合液洗涤容器及药渣，洗液并入滤液中，滤液通过碱性氧化铝柱（内径1.5cm，8g，干法装柱），分别用50ml、100ml、150ml、200ml混合液洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按确定色谱条件测定，计算每相当于1g饮片的配方颗粒中含甜菜碱的量。结果表明：洗脱量为100ml时甜菜碱的量与150ml和200ml时比较，其含量基本一致，故选择洗脱量为100ml，结果见表5。表5不同洗脱量的测定结果洗脱量（ml）50100150200含量（mg/g）1.96922.09802.10242.0912最终确定供试品溶液处理方法：取装量差异项下的本品，研细，取适量（相当于1.0g饮片），精密称定，置具塞锥形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，并用少量混合液洗涤容器及药渣，洗液并入滤液中，滤液通过碱性氧化铝柱（内径1.5cm，8g，干法装柱），用100ml混合液洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。方法学研究：（1）线性关系试验：精密称取甜菜碱对照品10.64mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀（浓溶液），分别精密量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置10ml量瓶中，以流动相稀释至刻度，摇匀，分别取上述溶液20μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。结果见表6。表6线性关系测定结果（2）精密度试验：取线性关系项下浓度为127.68μg/ml的溶液，连续进针6次，峰面积值见表7。结果符合要求。表7精密度试验结果测定次数123456平均值RSD(%)峰面积值1443761424881429231460931443661454971442910.97（3）稳定性试验：将供试品溶液放置24小时，于0、2、4、6、8、24小时测定，放置前峰面积值为138140，放置后峰面积值为138409，说明测定溶液24小时之内测定稳定。结果见表8。表8稳定性试验结果测定时间（h）0246824峰面积值138140137050138268139057137572138409（4）重现性试验：取供试品适量，研细，称取约300mg，精密称定，6份，按含量测定的方法进行测定，计算枸杞子配方颗粒中含甜菜碱的量。结果见表9。结果符合要求。表9重现性试验结果测定次数123456平均值RSD(%)含量（％）0.40220.39880.40930.40020.40760.39980.40301.09（5）回收率试验：取供试品适量，研细，称取约150mg，精密称定，6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液（浓度为0.1222mg/ml），补加1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）至50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，并用少量混合液洗涤容器及药渣，洗液并入滤液中，滤液通过碱性氧化铝柱（内径1.5cm，8g，干法装柱），用100ml混合液洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为测定回收率溶液。分别取上述溶液20μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以线性关系项下127.68μg/ml的溶液为对照，计算回收率。结果见表10。表10回收率测定结果平均值为99.87％（n＝6）,RSD=1.77%,符合要求。样品的含量测定：按上述色谱条件对各厂家生产的枸杞子配方颗粒进行测定，计算每相当于1g饮片的配方颗粒含甜菜碱的量，并与药典饮片含量比较，计算转移率。结果见表11。表11含量测定结果药典规定每g饮片含甜菜碱（C5H11NO2）不得少于3.0mg，上述9批样品每相当于1克饮片的配方颗粒平均甜菜碱的含量为1.5220mg。界定每相当于1克饮片的配方颗粒含甜菜碱（C5H11NO2）不得少于1.20mg（与药典药材含量限度比较转移率为40%）。实施实例：（1）对照品溶液的制备：精密称取甜菜碱对照品10.64mg，置25ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓溶液，精密量取3.0ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。（2）供试品溶液的制备：取本品，研细，取适量（相当于1.0g饮片的配方颗粒），精密称定，置具塞锥形瓶中，加入1,2-二氯乙烷-甲醇的混合液（50:50）50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，并用少量混合液洗涤容器及药渣，洗液并入滤液中，滤液通过碱性氧化铝柱（内径1.5cm，8g，干法装柱），用100ml混合液洗脱，收集流出液及洗脱液，蒸干，残渣加流动相溶解并转移至10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。（3）色谱条件：色谱柱：KromasilNH2（4.6×250mm，5μ）流动相：乙腈－水（85:15）流速：1.0ml/min检测波长：200nm柱温：30℃进样：20ul（4）测定：计算每相当于1g饮片的配方颗粒含甜菜碱的量，并计算转移率。结果见表12。表12测定结果当前第1页1 2 3