一种基于计算机图像分析的青菜叶片叶绿素定量检测方法与流程

本发明涉及一种青菜叶片中叶绿素含量定量检测方法，属于农作物生理指标测试方法。

背景技术：

目前叶绿素含量测定常用的方法是分光光度计法，即将叶片称重剪碎，用大量有机溶剂如丙酮、乙醇长时间提取叶片叶绿素，然后用分光光度计测定提取液在645nm和663nm的光密度值，然后利用Arnon公式计算叶绿素含量。

还有一种方法是用叶绿素计测定叶片直接读取叶片叶绿素含量的值。用的最多的是日本美能达公司产的SPAR‐502，它是根据叶片叶绿素在可见光区域特定波长位置有吸收谷和反射峰的特点，通过制作的仪器来发射一束已知强度的光照射在需测定的叶片部位，检测被测试叶片特定波长吸收率与反射率来推算叶片叶绿素含量。采用传统的分光光度计测定叶绿素含量需用有机溶剂提取，不仅破坏被测样品，而且过程繁琐，比较费时。叶绿素计价格昂贵，不适用一些基层研究和生产单位对园艺产品叶绿素的测定。

由于植物叶色是叶片中叶绿素含量的外在表现，利用植物的颜色参数通过构建数学模型计算叶绿素含量成为一种新的方法。已报道的文献有以下几个特点:a.采用色差计进行颜色参数测定。由于色差计对样品的大小、形状、色泽均匀度、表面平整度有一定的要求，且色差计体积较大、仪器价格昂贵，适用于科学研究但不适用于基层研究和生产单位使用。b.目前叶绿素含量检测模型多基于RGB等颜色系统，预测精度不高。c.文献报道的利用计算机图像建立叶绿素含量多基于检测模型棉花等作物建立，因为青菜在株型、叶片形态、表面结构等方面均与上述作物存在较大差异，所以已有叶绿素含量的预测模型并不适用于青菜叶片叶绿素含量的测定。

技术实现要素：

本发明要克服现有技术中存在的问题，提供一种基于颜色参数值的快速、无损的青菜叶片叶绿素含量测定方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：根据青菜叶片叶绿素含量变化引起叶片颜色变化，采用数码相机或扫描仪获取青菜叶片图像，用计算机图像技术获取图像中叶片的颜色参数值(L*、a*、b*、ΔE)，CIE‐LAB表色系是国际标准制表色系统。它用空间坐标L﹑a﹑b值表示。原点坐标为L＝50,a＝0,b＝0。L*代表亮度(0‐100)0为黑色、100为白色。坐标a*表示红色(+)和绿色(‐)，b*表示黄色(+)和蓝色(‐)，ΔE＝(ΔL*²+Δa*²+Δb*²)^1/2，集中体现了颜色体系三要素，能够更全面地反映颜色三维空间的变化。并采用传统的分光光度计法测定对应叶片的叶绿素含量，通过采用不同的函数模型对叶片的颜色参数值与叶绿素含量之间的关系进行拟合，从而构建出基于颜色参数值的叶绿素含量预测模型，即只要获取叶片的颜色值，输入模型，即可实现对叶片叶绿素含量的测定。

下面对本发明方法的具体实施步骤作进一步详细描述:

1.叶片图像获取。通过扫描仪或数码相机获取叶片数字图像，用Canon PowerShotA610数码相机拍摄青菜叶正面图像时，以平整的白纸作为背景，镜头垂直向下，镜头离目标物体距离为20cm左右，将数码机闪光灯设置于关闭状态，像素为500万，设置相机在M模式下，拍摄参数为1/400，F8.0，ISO100。白平衡自动，调整镜头焦距为20cm。采用JPG格式存储图像并传入计算机。

2.叶片图像颜色参数测定。将获取的叶片数字图像用图像处理软件(如Photoshop CS6等)提取整个叶片的颜色值，应用Adobe Photoshop CS6图像处理软件中魔术棒工具做青菜叶片选区(不包含菜叶上的茎脉部分)，设置笔尖大小为8像素。然后执行滤镜工具中的模糊平均命令，将叶片选区内的所有像素参数值平均化，使用吸管工具读取信息窗口中的L*、a*、b*值，并色差ΔE＝(ΔL*²+Δa*²+Δb*²)^1/2。

3.叶片叶绿素含量的实验室测定。在获取青菜叶片图像之后，立即将样品剪碎，分别在电子天平上称取0.20g，然后放入盛有25ml混合液(丙酮、无水乙醇按体积比1:1配制)的具塞试管中，置于黑暗条件下直接浸提至叶片组织完全变白时，用紫外可见光分光光度计在600—700nm范围内对不同叶绿素提取液进行扫描，波长精度为0.2nm。在645nm和663nm处测量并记录其光密度值，并作平行样，求其平均值。

叶绿素含量计算利用Arnon公式式中:V是浸提液的最终体积；W为叶片鲜重，D645、D663为645nm和663nm的光密度值。

4.叶绿素含量预测模型的构建。采用不同函数模型y＝Ax+B、y＝A/x+B、y＝Alnx+B和ln(lny)＝Alnx+B，A、B为拟合模型的系数，分别对步骤2中测定叶片各颜色参数(x)(a*、b*、ΔE)与步骤3中测定叶绿素含量(y)之间的关系通过origin8.0软件进行拟合分析，通过比较拟合方程的决定系数R²，构建2个预测模型如下:

ln(lnC chl)＝-4.0547 ln b*+12.6085(n＝10，R²＝0.9925**)---------(1)

C chl＝-0.1412ΔE+3.4516(n＝10，R²＝0.9940)——————————(2)

其中C chl为叶绿素含量(mg/g)，n为样本量，R²决定系数，**表示拟合模型具有极显著的相关性。

5.待测样品叶绿素含量的测定。按照上述步骤1-2描述方法测定叶片图像颜色参数b*、ΔE，将颜色参数b*或ΔE分别代入步骤4中构建的叶绿素含量预测模型，即可输出叶绿素含量。

本发明的优点是：1.快速、简便，省时，省力，操作灵活简单，不需要破坏样品，对叶片无损伤，不需化学试剂，节约成本。2.本发明提出的方法，对一张叶片只需拍摄一张完整叶片的图像既可获得叶片局部叶绿素含量，也可获得整个叶片叶绿素含量，降低因点测量引起的测量精度低的问题；减少因操作人员测定点选取不同而造成的测定误差，精度较高。

附图说明

图1为本发明的基于b*叶绿素含量预测模型的构建示意图。

图2为本发明的基于ΔE叶绿素含量预测模型的构建示意图。

图3为实施例1中预测模型的检验示意图

图4为实施例2中预测模型的检验示意图

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1

2015年10月10日10:30，取10组在浙江省杭州市下城区德胜路农贸市场购买的青菜叶片样本，青菜品种为“五月慢(WYM，上海地方品种)”，利用Canon PowerShotA610数码相机拍摄青菜叶正面图像时，把待测青菜叶置于暗箱内以白纸作为背景，数码相机置于暗箱上方的观测孔上，打开暗箱标准灯源(D65)将数码机闪光灯设置于关闭状态，像素为500万，设置相机在M模式下，拍摄参数为1/400，F8.0，ISO100。白平衡自动，调整镜头焦距为20cm。拍照时在晴朗无云的天气条件下进行，相机垂直于叶片拍摄，且叶片上无阴影。采用JPG格式存储图像并传入计算机，将获取的叶片数字图像用Adobe Photoshop CS6图像处理软件中魔术棒工具做青菜叶片选区(不包含菜叶上的茎脉部分)，设置笔尖大小为8像素。然后执行滤镜工具中的模糊平均命令，将叶片选区内的所有像素参数值平均化，使用吸管工具读取颜色信息窗口中的b值。

输入所建模型：

ln(lnC chl)＝-4.0547ln b*+12.6085(n＝10，R²＝0.9925**)

分别得出10组青菜叶片样本叶绿素含量预测值为3.45、2.92、2.57、2.07、1.57、3.49、2.77、2.16、1.78、1.63mg/g；利用分光光度计法得到10组青菜叶片样本叶绿素含量实测值为3.48、2.89、2.54、2.11、1.59、3.6、2.66、2.19、1.78、1.63mg/g。

实施例2

2015年10月15日10:30，取10组青菜叶片样本，青菜品种为“矮抗青”，利用Canon PowerShotA610数码相机拍摄青菜叶正面图像时，把待测青菜叶置于暗箱内以白纸作为背景，数码相机置于暗箱上方的观测孔上，打开暗箱标准灯源(D65)，将数码机闪光灯设置于关闭状态，像素为500万，设置相机在M模式下，拍摄参数为1/400，F8.0，ISO100。白平衡自动，调整镜头焦距为20cm。拍照时在晴朗无云的天气条件下进行，相机垂直于叶片拍摄，且叶片上无阴影。采用JPG格式存储图像并传入计算机，将获取的叶片数字图像用Adobe Photoshop CS6图像处理软件中魔术棒工具做青菜叶片选区(不包含菜叶上的茎脉部分)，设置笔尖大小为8像素。然后执行滤镜工具中的模糊平均命令，将叶片选区内的所有像素参数值平均化，使用吸管工具读取颜色信息窗口中的L*、a*、b*值，并色差ΔE。

输入所建模型：

C chl＝-0.1412ΔE+3.4516(n＝10，R2＝0.9940)

分别得出10组青菜叶片样本叶绿素含量预测值为2.34、2.78、2.36、3.56、1.34、2.67、1.67、4.54、3.11、2.49mg/g；而利用分光光度计法得到10组青菜叶片样本叶绿素含量实测值为2.45、2.72、2.5、3.47、1.36、2.70、1.81、4.6、3.15、2.61mg/g。