改进的测定方法与流程

本申请要求2014年05月15日提交的美国临时申请号61/993,581；2014年06月18日提交的62/013,823；2014年09月10日提交的62/048,489；2014年09月12日提交的62/049,520；和2014年09月25日提交的62/055,093的权益，其全部内容通过引用并入本文。还对USSN14/206,284(公开号US-2014/0272939)；USSN14/208,040(公开号US-2014/0274775)；和USSN14/203,638(公开号US-2014/0256588)进行了引用，其公开也通过引用并入本文。发明领域本发明涉及用于进行免疫测定的改进的方法。所述方法经设计以在免疫测定中放大信号并锚定其中采用的免疫测定复合物。发明背景已经开发了大量关于采用结合反应(例如抗原抗体反应，核酸杂交和受体配体反应)的技术的文献，用于对样品中感兴趣的分析物的灵敏测量。许多生物化学结合系统的高度特异性导致了在各种市场中许多有价值的分析方法和系统，包括基础研究，人用和兽用诊断，环境监控以及工业测试。可以通过在结合反应中直接测量分析物的参与来测量感兴趣的分析物的存在。在一些方法中，可以通过测量附接到一种或多种结合材料的可观察标记物来指示该参与。虽然夹心法免疫测定形式在许多应用中提供了极好的灵敏度和特异性，一些分析物以过低的浓度存在而无法通过传统的免疫测定技术检测。夹心法免疫分析的性能也可能因为检测抗体的非特异性结合以及包含高解离率抗体的夹心法混合物的不稳定性而被限制。然而，修改传统方法来改进灵敏度和特异性的努力通常导致更加复杂，劳动密集的方案，其可能由每一步的低效率而被阻碍，可能极大的影响分析的灵敏度和特异性。例如，在要求多个结合事件和/或反应的复杂分析中，如果任意一个事件或反应不太理想，整体分析的灵敏度和特异性可能受到影响。对于通过改进灵敏度，减少非特异性结合和改进夹心法复合物的稳定性改进夹心法免疫分析表现的新技术有需要。发明概述本发明考虑以下的具体实施方案。本领域的技术人员可以对本文所述的实施方案进行多种修改，增加和改变而不脱离本发明的精神和范围。这些修改，增加和改变意在落入权利要求的范围内。实施方案(1)：检测样品中感兴趣分析物的方法，包含：使分析物结合到：(i)表面上的捕获试剂，所述表面包含用于所述分析物的捕获试剂，和锚定试剂；和(ii)与核酸探针连接的用于所述分析物的检测试剂；从而在所述表面上形成包含所述捕获试剂、分析物和检测试剂的复合物；延伸所述探针以形成包含结合到锚定试剂的锚定区的延伸序列；使所述延伸序列结合到锚定试剂上；以及测量结合到所述表面上的延伸序列的量。在实施方案(1)中，所述捕获试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体(aptamer)。在一个具体的实施方案中，捕获试剂是抗体。检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，且在一个具体的实施方案中，所述检测试剂是抗体。在实施方案(1)的一个具体的实例中，捕获和检测试剂是针对分析物的抗体。锚定试剂可以包括寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位；以及任选地，所述锚定区可以包括适体，且所述锚定试剂可包括适体配体。所述锚定区可包含核酸序列，且锚定试剂可包括DNA-结合蛋白。所述锚定试剂可以包含寡核苷酸序列，且锚定序列可以包括互补寡核苷酸序列。所述锚定区可以包括单链寡核苷酸序列或双链寡核苷酸序列。实施方案(1)的结合步骤可进一步包括在锚定区和锚定试剂间形成三螺旋。所述方法可进一步包含在结合步骤之前变性锚定区以暴露单链序列；在结合步骤前将锚定区暴露于解旋酶活性；和/或在结合步骤之前将所述锚定区暴露于核酸酶处理。在这一实施方案中，所述锚定区可包含一个或多个半抗原修饰的碱基，且锚定试剂可包括一个或多个对所述半抗原特异的抗体；和/或锚定区可以包括一个或多个配体修饰的碱基，且锚定试剂可以包括一个或多个对所述配体特异的受体。所述延伸序列可进一步包含一个或多个检序列，且测量步骤还包括将所述延伸序列与互补于所述一种或多种检测序列的多种标记的探针接触；延伸序列可包括一个或多个修饰的碱基，且测量步骤可包括将延伸序列于多个能够结合一个或多个修饰的碱基的检测部分(moieties)接触；和/或所述延伸序列可包含一个或多个标记的碱基，且所述测量步骤可进一步包括检测一个或多个标记的碱基的存在。在该实施方案中，一个或多个修饰的碱基包含适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位，并且多个可检测部分各自包含一个或多个修饰的碱基的结合伴侣和可检测标记。所述一个或多个修饰的碱基可以包含链霉亲和素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记；和/或所述一个或多个修饰的碱基可以包含生物素，并且所述多个可检测部分各自包含链霉亲和素和可检测标记；和/或一个或多个修饰的碱基可以包含亲和素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记；和/或所述一个或多个修饰的碱基可以包含生物素，并且所述多个可检测部分各自包含亲和素和可检测标记。实施方案(1)的第一步可以包含使分析物以以下顺序结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于所述分析物的检测试剂；或实施方案(1)的第一步可以包含使分析物以以下顺序结合到以下种类：(i)用于所述分析物的检测试剂；和(ii)在所述表面上的捕获试剂；和/或第一个步骤可以包含使分析物同时或基本同时结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于所述分析物的检测试剂。实施方案(1)的延伸步骤可包含将探针结合到模板核酸序列并通过聚合酶链式反应延伸所述探针；和/或将所述探针结合到模板核酸序列，形成环形核酸模板，并通过滚环扩增延伸所述环形模板。在这一实施方案中，延伸的探针可以在探针延伸之后仍位于表面上。因此，复合物可以在延伸步骤之后仍结合到表面上，例如，延伸的探针在所述表面上的复合物位置的10-100μm以内的位置处结合到所述锚定试剂。在一个具体实施方案中，述延伸的探针在所述表面上的复合物位置的小于100μm、小于50μm，或更特别地小于10μm的位置处结合到所述锚定试剂。实施方案(1)的延伸步骤可以包含PCR(聚合酶链式反应)、LCR(连接酶链式反应)、SDA(链置换扩增)、3SR(自动维持合成反应)，或等温扩增方法。在一个实施方案中，延伸步骤可包括等温扩增方法，例如解旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。在实施方案(1)中所指的表面可以包括颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂定位在表面上的两个不同的结合域上。如果所述表面是板的孔，则所述孔可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上；和/或所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的相同的结合域上。在一个实施方案中，孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕获试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。所述表面可以包括电极而测量步骤可以进一步包括向所述电极施加电压波形以产生电化学发光信号，以及任选地，所述方法包括收集电极上的颗粒并向所述电极施加电压波形以产生电化学发光信号。实施方案(1)的测量步骤可以进一步包含使延伸的序列结合到具有可检测标记物的检测探针，测量所述可检测标记物，并将所述测量与样品中分析物的量关联，其中所述检测探针包含与延伸序列的区域互补的核酸序列。可以通过测量光散射，光吸收，荧光，化学发光，电化学发光，生物发光，磷光，放射性，磁场，或其组合测量所述可检测标记物。在实施方案(1)的具体实施例中，所述可检测标记物是ECL标记物而测量步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(2)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕获试剂，和(ii)锚定试剂；和(b)用于分析物的与核酸探针连接的检测试剂。实施方案(2)的锚定试剂可以包含寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位，并且捕获试剂可包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。在一个具体实施方案中，所述捕获试剂可包括抗体，和/或所述检测试剂可包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。在试剂盒的一个具体的实施方案中，所述检测试剂是抗体。实施方案(2)的试剂盒的表面可以包括颗粒和/或多孔板的孔。表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果试剂盒表面是板的孔，则表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上；和/或所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的相同的结合域上。在试剂盒的具体的实施例中，所述表面是孔，并且所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕获试剂和锚定试剂可以在所述表面上的10-100nm内。此外，所述试剂盒的表面可以包含电极。实施方案(3)：检测样品中感兴趣的分析物的方法，包括：(a)使分析物结合到：(i)表面上的捕获试剂，所述表面包含用于分析物的捕获试剂，以及包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；和(ii)与核酸探针连接的用于分析物的检测试剂；从而在所述表面上形成包含所述捕获试剂、分析物和检测试剂的复合物；(b)延伸探针以形成包含与锚定序列互补的锚定序列互补体(complement)的延伸序列；(c)将锚定序列与锚定序列互补体杂交；和(d)测量结合到表面的延伸序列的量。在实施方案(3)中，所述捕获试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，且在具体实施例中，所述捕获试剂是抗体。同样，所述检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，且在实施方案(3)的具体实施例中，所述检测试剂是抗体。在实施方案(3)的一个实例中，所述捕获试剂和检测试剂是针对分析物的抗体。所述锚定寡核苷酸序列可以包含单链寡核苷酸序列或双链寡核苷酸序列。所述延伸序列可以进一步包括一个或多个检测序列，且所述测量步骤还包括将所述延伸序列与互补于所述一个或多个检测序列的多种经标记探针接触；或者或另外，所述延伸序列还可以包括一个或多个修饰的碱基，并且所述测量步骤还可以包括使延伸序列与能够结合一个或多个修饰的碱基的多个可检测部分接触。在一个具体的实施例中，延伸序列还可以包括一个或多个标记的碱基，并且测量步骤还可以包括检测一个或多个标记的碱基的存在。所述一个或多个修饰的碱基包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位，并且多个可检测部分各自包含一个或多个修饰的碱基的结合伴侣和可检测标记。所述一个或多个修饰的碱基可以包含链霉亲和素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记；所述一个或多个经修饰的碱基包含生物素，且所述多个可检测部分各自包含链霉亲和素和可检测标记；所述一个或多个修饰的碱基包含亲和素，并且所述多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记；和/或所述一个或多个修饰的碱基包含生物素，并且所述多个可检测部分各自包含亲和素和可检测标记。实施方案(3)的步骤(a)可以包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。或者，步骤(a)可包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)用于分析物的检测试剂；和(ii)表面上的捕获试剂。在另一个实施例中，步骤(a)可以包含同时或基本上同时将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。实施方案(3)的延伸步骤可以包括将探针结合到模板核酸序列并通过聚合酶链式反应延伸探针。或者，延伸步骤可以包括将探针结合到模板核酸序列，形成环形核酸模板，并通过滚环扩增延伸环形模板。延伸的探针可以在探针延伸之后仍定位于表面上。例如，在延伸步骤后，复合物仍结合到表面上。在一个实施例中，延伸的探针在所述表面上的复合物位置的10-100um内的位置处结合到所述锚定试剂。在一个具体实施方案中，述延伸的探针在所述表面上的复合物位置的小于100um、小于50um，或更特别地小于10um的位置处结合到所述锚定试剂。在这一特定实施方案中，所述延伸步骤可包括PCR(聚合酶链式反应)、LCR(连接酶链式反应)、SDA(单链置换扩增)、3SR(自动维持合成反应)，或等温扩增方法。例如，所述延伸步骤可包括等温扩增方法，如解旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。实施方案(3)的表面可以包含颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果所述表面是板的孔，则其可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的相同的结合域上。如果所述表面是孔，则其可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同的结合域上。捕获试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。在具体的实施例中，表面可以包括电极，并且测量步骤还可以包括向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。所述方法还可以包括在电极上收集颗粒并向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤还可包括将延伸序列结合到具有可检测标记的检测探针，测量可检测标记，并将测量与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包含与延伸序列的区域互补的核酸序列。在该实施方案中，通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合的测量来测量可检测标记。例如，可检测标记是ECL标记，且测量步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(4)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕获试剂，和(ii)包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；和(b)连接到核酸探针的用于分析物的检测试剂。实施方案(4)的试剂盒包括包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体的捕获试剂。在具体的实施例中，所述捕获试剂可以包括抗体。同样，检测试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，并且具体地，所述检测试剂可以包括抗体。实施方案(4)的试剂盒包括表面，其可以包含颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上相同的结合域上，例如，如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。例如，所述捕获试剂和锚定试剂可以在所述表面上的10-100nm内。实施方案(4)的表面可以包括电极。实施方案(5)：检测样品中感兴趣的分析物的方法，包括：(a)将分析物结合到：(i)表面上的捕获试剂，所述表面包含用于分析物的捕获试剂，和包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；(ii)连接到第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；和(iii)连接到第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂；从而在表面上形成复合物，所述表面包含结合试剂、分析物以及第一和第二检测试剂；(b)使用需要第一和第二近端探针接近的延伸过程，延伸第二探针以形成包含与锚定序列互补的锚定序列互补体的延伸序列；(c)将锚定序列与锚定序列互补体杂交；和(d)测量结合到表面的延伸序列的量。实施方案(5)的捕获试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体。在一个具体的实施例中，捕获试剂是抗体。同样，第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，且在一个具体的实施例中，第一检测试剂是抗体。第二检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，且在一个具体实施例中，第二检测试剂是抗体。更具体地，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。在实施方案(5)中，锚定寡核苷酸序列可以包括单链寡核苷酸序列或双链寡核苷酸序列。在这一实施方案中，延伸序列进一步可以包括一个或多个检测序列，并且测量步骤还可以包括使延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的标记探针接触。延伸序列还可以包括一个或多个修饰碱基，且所述测量步骤还包括将所述延伸序列与多个能够与所述一个或多个修饰的碱基结合的可检测部分。延伸序列可以进一步包含一个或多个标记的碱基，并且测量步骤还可以包括检测一个或多个标记的碱基的存在。一个或多个修饰的碱基可以包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位，或模拟表位，并且所述多个可检测的部分每一个包含所述一个或多个修饰的碱基的结合伴侣以及可检测标记物。例如，一个或多个修饰的碱基包含链霉亲和素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记；所述一个或多个修饰的碱基包含生物素，且所述多个可检测部分各自包含链霉亲和素和可检测标记；所述一个或多个修饰的碱基包含亲和素，并且所述多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记；和/或所述一个或多个修饰的碱基包含生物素，并且所述多个可检测部分各自包含亲和素和可检测标记。实施方案(5)的步骤(a)可以包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。或者，步骤(a)可包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)用于分析物的检测试剂；和(ii)表面上的捕获试剂；或步骤(a)可以包括同时或基本上同时将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。实施方案(5)的延伸步骤可以包括将探针结合到模板核酸序列并通过聚合酶链式反应延伸探针。延伸步骤还可以包括将探针结合到模板核酸序列，形成环形核酸模板，并通过滚环扩增延伸环形模板。所述延伸的探针可以在探针延伸之后仍定位于表面上，例如，在延伸步骤后复合物仍结合到表面上。所述延伸的探针在所述表面上的复合物位置的10-100um内的位置处结合到所述锚定试剂。在一个具体实施方案中，所述延伸的探针在所述表面上的复合物位置的小于100um、小于50um，或更特别地小于10um的位置处结合到所述锚定试剂。延伸步骤可包括PCR(聚合酶链式反应)、LCR(连接酶链式反应)、SDA(单链置换扩增)、3SR(自动维持合成反应)，或等温扩增方法。在一个具体的实施例中，所述延伸步骤可包括等温扩增方法，例如为解旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。实施方案(5)的延伸过程可包括使步骤(a)中形成的复合物与连接子(connector)序列接触，所述连接子序列包含(i)与第二探针互补的内部序列和(ii)与第一探针的非重叠区互补的双末端序列。所述方法还可以包括连接所述连接子寡核苷酸的双末端序列以形成与第一和第二探针两者杂交的环形靶序列。或者，延伸过程可包括将实施方案(5)的步骤(a)中形成的复合物与第一连接子寡核苷酸序列和第二连接子寡核苷酸序列接触，所述第一连接寡核苷酸序列包含互补于所述第一探针的第一区域和所述第二探针上的第一区域的第一连接探针序列，所述第二连接寡核苷酸包含互补于所述第一探针的第二非重叠性区域和所述第二探针的第二非重叠性区域的第二探针序列；并且任选地，连接第一和第二连接子寡核苷酸以形成与第一和第二探针两者杂交的环形靶序列。实施方案(5)的表面可以包括颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是板的孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面还可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上相同的结合域上。如果表面是板的孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕获试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。在一个具体的实施例中，所述表面可以包括电极，且所述测量步骤还可包括向电极施加电压波形以产生电化学发光信号，并且任选地，实施方式(5)的方法还包括在电极上收集颗粒并向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。实施方案(5)的测量步骤还可包括将延伸序列与具有可检测标记的检测探针结合，测量可检测标记，并将测量与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包含与延伸序列的区域互补的核酸序列。可通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合的测量来测量可检测标记。在一个具体的实施例中，所述可检测标记是ECL标记，且测量步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(6)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕获试剂，和(ii)包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；(b)连接到第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；和(c)连接到第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂。实施方案(6)的捕获试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，且在具体的实施例中，捕获试剂可以包括抗体。同样，第一检测试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，在具体的实施例中，第一检测试剂可以包括抗体。类似地，第二检测试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，且在具体的实施例中，第二检测试剂可以包括抗体。实施方案(6)的表面可以包含颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果所述表面是孔，则该孔可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的相同的结合域上；和/或如果所述表面是孔，则该孔可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同的结合域上。捕获试剂和锚定试剂可以在表面上的10-100nm内。在具体的实施例中，表面可以包括电极。实施方案(7)：检测样品中感兴趣的分析物的方法，包括：(a)将分析物结合到：(i)表面上的用于分析物的捕获试剂，所述表面包含捕获试剂和锚定试剂；(ii)包含第一近端探针的用于分析物的第一检测试剂，和(iii)包含第二近端探针的用于分析物的第二检测试剂；从而在表面上形成检测复合物，所述检测复合物包含捕获试剂、分析物以及第一和第二检测试剂；(b)将在(c)中形成的检测复合物与连接子序列接触，所述连接子序列包含(i)与第二近端探针互补的内部序列和(ii)与第一近端探针的非重叠区域互补的双末端序列；(c)将连接子序列与第一和第二近端探针杂交；(d)连接连接子寡核苷酸的双末端序列以形成与第一和第二近端探针的两者杂交的环形靶序列；(e)通过靶序列的滚环扩增来延伸第二近端探针以产生包含结合锚定试剂的结合域的扩增子；(f)将扩增子结合到锚定试剂；和(g)测量表面上的扩增子的量。实施方案(8)：检测样品中感兴趣的分析物的方法，包括：(a)将分析物结合到：(i)表面上的用于分析物的捕获试剂，所述表面包含捕获试剂和锚定试剂；(ii)包含第一近端探针的用于分析物的第一检测试剂，和(iii)包含第二近端探针的用于分析物的第二检测试剂；从而在表面上形成检测复合物，所述检测复合物包含捕获试剂、分析物以及第一和第二检测试剂；(b)将在(c)中形成的检测复合物与第一连接子寡核苷酸和第二连接子寡核苷酸接触，其中(i)第一连接子的第一末端和第二连接子的第一末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补，且(ii)第一连接子的第二末端和第二连接子的第二末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补；(c)将第一和第二连接子寡核苷酸与第一和第二近端探针杂交；(d)连接第一和第二连接子寡核苷酸以形成与第一和第二近端探针两者杂交的环形靶序列；(e)通过靶序列的滚环扩增来延伸第二近端探针以产生包含结合锚定试剂的结合域的扩增子；(f)将扩增子结合到锚定试剂；和(g)测量表面上的扩增子的量。实施方案(7)和(8)的捕获试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，且在一个具体实施例中，捕获试剂是抗体。相似地，第一检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，第一检测试剂是抗体。另外，第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，第二检测试剂是抗体。在实施方案(7)和(8)的一个具体的实施例中，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(7)和(8)的锚定试剂可以包括寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位。在一个实施例中，结合域可以包括适体，且锚定试剂可以包括适体配体。结合域可以包括核酸序列，且锚定试剂可以包括DNA结合蛋白；和/或锚定试剂可以包括寡核苷酸序列，且扩增子可以包括互补寡核苷酸序列。实施方案(7)和(8)的扩增子可进一步包含一个或多个检测序列，且所述测量步骤可以进一步包括将所述延伸序列与互补于所述一个或多个检测序列的多种经标记探针接触。此外，扩增子可以进一步包含一个或多个修饰的碱基，并且测量步骤还可以包括使延伸序列与能够结合一个或多个修饰的碱基的多个可检测部分接触。另外，扩增子可以进一步包括一个或多个标记的碱基，并且测量步骤还可以包括检测一个或多个标记的碱基的存在。所述一个或多个修饰的碱基可以包含适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位且多个可检测部分各自包含一个或多个修饰的碱基的结合伴侣和可检测的标记。所述一个或多个修饰的碱基可以包含链霉亲和素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测的标记；所述一个或多个修饰的碱基可以包含生物素，并且所述多个可检测部分各自包含链霉亲和素和可检测标记；所述一个或多个修饰的碱基可以包含亲和素，并且所述多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记；和/或所述一个或多个修饰的碱基可以包含生物素，并且所述多个可检测部分各自包含亲和素和可检测标记。实施方案(7)和(8)的步骤(a)可包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。或者，步骤(a)可包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)用于分析物的第一和第二检测试剂；和(ii)表面上的捕获试剂。另外，步骤(a)可以包括同时或基本上同时将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。实施方案(7)和(8)的扩增子可以在探针延伸之后仍定位于表面上。复合物可以在延伸步骤后仍结合在表面上。例如，所述延伸的探针在所述表面上的复合物位置的10-100um内的位置处结合到所述锚定试剂。在一个具体实施方案中，所述延伸的探针在距离位于表面上复合物位置小于100um、小于50um，或更特别地小于10um的位置处结合至锚定试剂。实施方案(7)和(8)的表面可以包含颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是板的孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上相同的结合域上。如果表面是板的孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。在一个具体的实施例中，捕获试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。另外，表面可以包括电极，并且测量步骤可以包括将电压波形施加到电极以产生电化学发光信号。在这些实施方案((7)和(8))中，该方法还可以包括在电极上收集颗粒并向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤可以包括将扩增子结合到具有可检测标记的检测探针，测量可检测标记，并将测量与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包含与扩增子区域互补的核酸序列。通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量可检测标记。例如，可检测标记是ECL标记，且测量步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(9)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕获试剂，和(ii)锚定试剂；(b)包含第一近端探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)包含第二近端探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)连接子序列，包含(i)与第二近端探针互补的内部序列和(ii)与第一近端探针的非重叠区域互补的双末端序列。实施方案(10)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕获试剂，和(ii)锚定试剂；和(b)包含第一近端探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)包含第二近端探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)(i)第一连接子寡核苷酸和(ii)第二连接子寡核苷酸，其中(x)第一连接子的第一末端和第二连接子的第一末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补，和(y)第一连接子的第二末端和第二连接子的第二末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补。实施方案(9)和(10)的捕获试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体。在一个具体的实施例中，捕获试剂可以包括抗体。第一检测试剂可包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，且在一个具体的实施例中，第一检测试剂可包括抗体。第二检测试剂可包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，且在一个具体的实施例中，第二检测试剂可包括抗体。实施方案(9)和(10)的表面可以包括颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是板的孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上相同的结合域上。如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。在一个特定的实施例中，捕获试剂和锚定试剂可以在所述表面上的10-100nm内。实施方案(9)和(10)的表面可以包括电极。实施方案(11)：检测样品中感兴趣分析物的方法，包括：(a)将分析物结合到：(i)表面上的用于分析物的捕获试剂，所述表面包含捕获试剂和包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；(ii)包含第一近端探针的用于分析物的第一检测试剂；和(iii)包含第二近端探针的用于分析物的第二检测试剂；从而在表面上形成检测复合物，所述检测复合物包含捕获试剂、分析物以及第一和第二检测试剂；(b)将在(c)中形成的检测复合物与连接子序列相接触，所述连接子序列包含(i)与第二近端探针互补的内部序列，(ii)与第一近端探针的非重叠区互补的双末端序列，和(iii)与锚定序列配对的序列；(c)将连接子序列与第一和第二近端探针杂交；(d)连接所述连接子寡核苷酸的双末端序列以形成与第一和第二近端探针的两者杂交的环形靶序列；(e)通过靶序列的滚环扩增来延伸第二近端探针以产生包含与锚定序列互补的多个锚定序列互补体的扩增子；(f)将所述锚定序列与所述锚定序列互补体之一杂交；和(g)测量表面上的扩增子的量。实施方案(12)：检测样品中感兴趣分析物的方法，包括：(a)将分析物结合到：(i)表面上的用于分析物的捕获试剂，所述表面包含捕获试剂和包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；(ii)包含第一近端探针的用于分析物的第一检测试剂；和(iii)包含第二近端探针的用于分析物的第二检测试剂；从而在表面上形成检测复合物，所述检测复合物包含捕获试剂、分析物以及第一和第二检测试剂；(b)将在(a)中形成的检测复合物与第一连接子寡核苷酸和第二连接子寡核苷酸接触，其中(i)第一连接子的第一末端和第二连接子的第一末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补，(ii)第一连接子的第二末端和第二连接子的第二末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补，且(iii)第一和/或第二连接子还包含与锚定序列配对的序列；(c)将第一和第二连接子寡核苷酸与第一和第二近端探针杂交；(d)连接第一和第二连接子寡核苷酸以形成与第一和第二近端探针的两者杂交的环形靶序列；(e)通过靶序列的滚环扩增来延伸第二近端探针以产生包含多个与锚定序列互补锚定序列互补体的扩增子；(f)将锚定序列与锚定序列互补体之一杂交；和(g)测量表面上的扩增子的量。实施方案(11)和(12)的捕获试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体。在一个具体的实施例中，捕获试剂是抗体。第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，并且在一个具体的实施例中，第一检测试剂是抗体。同样，第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，在一个具体的实施例中，第二检测试剂是抗体。在一个实施例中，第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(11)和(12)的扩增子可以进一步包含一个或多个检测序列，且所述测量步骤可以进一步包括将所述延伸序列与互补于所述一个或多个检测序列的多种经标记探针接触。此外，扩增子还可以包含一个或多个修饰的碱基，并且测量步骤可以包括将延伸序列与能够结合一个或多个修饰的碱基的多个可检测部分接触。扩增子另外包括一个或多个标记的碱基，并且测量步骤可以包括检测一个或多个标记的碱基的存在。所述一个或多个修饰的碱基包含适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位，并且多个可检测部分各自包含一个或多个修饰的碱基的结合伴侣和可检测标记。所述一种或多种修饰的碱基可以包含链霉亲和素，并且所述多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记；所述一种或多种修饰的碱基可以包含生物素，并且所述多个可检测部分各自包含链霉亲和素和可检测标记；所述一个或多个修饰的碱基可以包含亲和素，并且所述多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记；和/或一个或多个修饰的碱基可以包括生物素，并且多个可检测部分各自包含亲和素和可检测标记。实施方案(11)和(12)的步骤(a)可包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。或者，步骤(a)可包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)用于分析物的第一和第二检测试剂；和(ii)表面上的捕获试剂。另外，步骤(a)可以包括同时或基本上同时将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。实施方案(11)和(12)的扩增子可以在探针延伸之后仍定位于表面上，且任选地，复合物在延伸步骤后仍结合在表面上。例如，扩增子在所述表面上的复合物位置的10-100um内的位置处结合到所述锚定试剂。在一个具体实施方案中，所述延伸的探针在所述表面上的复合物位置的小于100um、小于50um，或更特别地小于10um的位置处结合到所述锚定试剂。实施方案(11)和(12)的表面可以包括颗粒和/或多孔板的孔。任选地，所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上相同的结合域上。如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕获试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。实施方案(11)和(12)的表面可以包括电极，并且测量步骤还可以包括向电极施加电压波形以产生电化学发光信号，任选地，实施方案(11)和(12)进一步包含收集电极上的颗粒并且向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤还可以包括将扩增子与具有可检测标记的检测探针结合，测量可检测标记，并将测量与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包含与扩增子的区域互补的核酸序列。可通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量可检测标记。在一个实施例中，可检测标记是ECL标记，且测量步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(11)和(12)的样品可以包含一种或多种分析物分子，并且表面可以包括用于一种或多种分析物分子的多种捕获试剂，所述捕获试剂分布在位于表面上的多个可分辨的结合区域上，且所述方法可以包括：(x)将所述一种或多种分析物分子结合到所述表面上的一种或多种捕获试剂；(y)确定每个结合区域中分析物分子的存在或不存在；和(z)鉴定含有分析物分子的结合区域的数目和/或不含分析物分子的分析物结合域的数目。测量步骤可以包括对来自表面的光信号成像以生成包括多个像素的图像，并且每个可分辨的结合区域映射(map)到图像中的一个或多个像素上。可分辨的结合区域可以是阵列的元件和/或可分辨的结合区域被配置为分离单个颗粒。每个可分辨的结合区域可以是具有体积＜100nL的单个纳米孔，如，其中至少99％的结合区域含有零个或一个分析物分子，其中至少约95％的结合区域包含零个或一个分析物分子，其中至少约80％的结合区域包含零个或一个分析物分子，和/或其中至少约50％的结合区域包含零个或一个分析物分子。可以至少部分地使用校正曲线、泊松分布分析和/或包含至少一个或一个分析物分子的结合区域数目的高斯分布分析来确定实施方案(11)和(12)中样品中分析物分子的浓度。在实施方案(11)和(12)中，样品可以包含一种或多种分析物分子，表面可以包括多个颗粒，每个颗粒包括用于分析物分子的多种结合试剂，其中多个颗粒分布在多个可分辨结合区中，并且所述方法可以包括：(i)将一种或多种分析物分子结合到所述表面上的一种或多种结合试剂，和(ii)将所述多种颗粒分布在可分辨结合区域阵列上；和(iii)确定每个可分辨结合区域中分析物分子的存在或不存在，以便鉴定含有分析物分子的结合区域的数目和/或鉴定不含分析物分子的结合区域的数目。实施方案(13)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕获试剂，和(ii)包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；和(b)包含第一近端探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)包含第二近端探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)连接子序列，包含(i)与第二近端探针互补的内部序列和(ii)与第一近端探针的非重叠区域互补的双末端序列。实施方案(14)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器，或隔室中包含：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕获试剂，和(ii)包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；和(b)包含第一近端探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)包含第二近端探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)(i)第一连接子寡核苷酸和(ii)第二连接寡核苷酸，其中(x)第一连接子的第一末端和第二连接子的第一末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补，且(y)第一连接子的第二末端和第二连接子的第二末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补。实施方案(13)和(14)的捕获试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，捕获试剂可以包括抗体。同样，第一检测试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，例如，第一检测试剂可以包括抗体。类似地，第二检测试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，例如，第二检测试剂可以包括抗体。实施方案(13)和(14)的表面可以包括颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上相同的结合域上。如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕获试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内，且任选地，所述表面可以包括电极。实施方案(15)：检测样品中分析物的方法，其中所述方法可包括：(a)将分析物结合到第一和第二检测试剂以形成检测复合物，每个检测复合物包含分析物、第一检测试剂和第二检测试剂，其中第一检测试剂具有第一可检测标记，且第二检测试剂具有第二可检测标记，(b)在多个反应容器间分隔分析物，使得大多数反应容器包含一个或更少的分析物；和(c)通过计数含有第一和第二可检测标记的反应容器的数量来检测分析物分子的数量。在该实施方案(15)中，所述第一检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第一检测试剂是抗体。同样，第二检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或配体，例如第二检测试剂是抗体。在一个具体的实施例中，第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(15)的步骤(a)可以进一步包含形成包含所述分析物和所述检测试剂的溶液，并且步骤(b)可以包含在多个反应容器间分隔溶液，从而在同一容器中找到未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性小于10分之1。或者，实施方案(15)的步骤(a)可以进一步包括形成包含所述分析物和所述检测试剂的溶液，并且步骤(b)可以包含在多个反应容器间分隔溶液，从而在同一容器中找到未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性小于100分之1。此外，实施方案(15)的步骤(a)可以进一步包括形成包含所述分析物和所述检测试剂的溶液，并且步骤(b)可以包含在多个反应容器间分隔溶液，从而在同一容器中找到未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性小于1000分之1。此外，实施方案(15)的步骤(a)可以进一步包括形成包含所述分析物和所述检测试剂的溶液，并且步骤(b)可以包含在多个反应容器间分隔溶液，从而在同一容器中找到未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性小于10000之1。实施方案(16)：检测样品中分析物的方法，所述方法包括：(a)将分析物结合到捕获试剂以及第一和第二检测试剂以形成检测复合物，每个检测复合物包含捕获试剂、分析物、第一检测试剂和第二检测试剂，其中(i)第一检测试剂具有第一可检测标记，且第二检测试剂具有第二可检测标记，(ii)捕获试剂在表面上；(b)在多个反应容器间分隔分析物，使得多个反应容器包含一个或更少的分析物；和(c)通过计数含有第一和第二可检测标记的反应容器的数量来检测分析物分子的数量。在该实施方案中，捕获试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，捕获试剂是抗体。同样，第一检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，第一检测试剂是抗体。此外，第二检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，第二检测试剂是抗体。例如，捕获试剂、第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(16)的步骤(b)可以进一步包括在多个反应容器间分隔溶液，从而在同一容器中找到未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性小于10分之1。此外，实施方案(16)的步骤(b)可以进一步包括在多个反应容器间分隔溶液，从而在同一容器中找到未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性小于100之1。实施方案(16)的步骤(b)可以进一步包括在多个反应容器间分隔溶液，从而在同一容器中找到未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性小于1000之1。此外，实施方案(16)的步骤(b)可以进一步包括在多个反应容器间分隔溶液，从而在同一容器中找到未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性小于10000分之1。实施方案(16)的检测复合物中的捕获试剂可以在将捕获试剂结合到分析物之前在表面上；或者在将捕获试剂固定在表面上之前，将检测复合物中的捕获试剂结合到分析物。在一个实施例中，检测试剂可以包括靶向部分，而且所述表面可以包括靶向部分互补体。靶向部分和靶向剂结合伴侣选自以下的结合对：亲和素-生物素、链霉亲和素-生物素、受体-配体、抗体-抗原、核酸-核酸互补体。实施方案(16)的表面是颗粒，并且任选地，捕获试剂被固定在多个颗粒上，并且通过将分析物结合到捕获试剂并将颗粒分配到多个反应容器中来实现分析物的分配。捕获试剂可以被固定在多个颗粒上，并且通过将颗粒分配到多个反应容器中然后将分析物结合到捕获试剂来实现分析物的分配。实施方案(16)可以进一步包括将多个颗粒分隔到多个反应容器中，其中多个颗粒包含靶向部分，捕获试剂包括靶向部分互补体，并且通过使靶向模块互补体结合靶向部分实现分析物的分隔。实施方案(16)还可以包括在分隔步骤之前和/或分隔步骤之后洗涤颗粒。实施方案(16)的表面可以是反应容器之一内的位置。在该实施方案中，捕获试剂可以被固定在多个反应容器的表面，并且通过将分析物结合到捕获试剂来实现分析物的分隔。任选地，反应容器具有其上固定有靶向部分的表面，捕获试剂包括靶向部分互补体，并且通过将靶向部分互补体结合到靶向部分来实现分析物的分配。在该具体的实施例中，该方法可以进一步包括在检测步骤之前洗涤反应容器。实施方案(16)的多个反应容器可以包括纳米孔阵列。多个反应容器可以包括至少10,000个反应容器。在一个实施方案中，反应容器具有小于100nL的体积。任选地，在检测时小于50％的反应容器含有分析物，在检测时小于10％的反应容器含有分析物，在检测时小于1％的反应容器含有分析物，和/或在检测时小于0.1％的反应容器含有分析物。在实施方案(16)的一个方面，第一可检测标记是偶联酶反应系统的第一酶，并且第二可检测标记是偶联酶反应系统的第二酶，并且步骤(d)可以包括添加一个或多个反应系统的底物，产生酶反应系统的产物并计数含有所述产物的反应容器。在此实施方案中，可以仅在第一酶和第二酶极其接近(例如，第一和第二酶在彼此的200nM内，或者第一和第二酶在彼此的50nM内)时产生产物。例如，第一酶是氧化酶，第二酶是过氧化酶，并且底物包含氧化酶底物和经标记的AmplexRed或鲁米诺衍生物。在此实施方案中，氧化酶可以是葡萄糖氧化酶，并且氧化酶底物是葡萄糖。在一个实施方案中，由检测复合物中的第一和第二酶催化的反应导致经标记的AmplexRed或鲁米诺在表面上的固定化，并且任选地，该方法可以包含测量表面上的经标记的AmplexRed或鲁米诺。经标记的AmplexRed或鲁米诺是任选地生物素-AmplexRed或鲁米诺，并且该方法可以包含添加经标记的链霉亲合素并测量链霉亲合素上的标记。实施方案(16)的步骤(d)可以包含测量在第一和第二可检测标记物与相同分析物分子结合时产生的接近依赖性信号(proximitydependentsignal)，并计算产生接近依赖性信号的反应容器的数目，例如，通过PLA-RCA产生接近依赖性信号。例如，第一可检测标记物可以是FRET供体，并且可检测标记物是FRET受体，并且通过激发FRET供体和测量从FRET受体的发射测量接近依赖性信号。在一个实例中，可以独立测量第一和第二可检测标记物。任选地，第一和第二可检测标记物是就光谱特性而言彼此不同的发光标记物。在一个实例中，第一可检测标记物是与第一底物起反应以产生第一信号的第一酶，并且第二可检测标记物是与第二底物起反应以产生第二信号的第二酶，并且实施方案(16)的步骤(d)可以包含添加第一酶底物和第二酶底物，并且计算产生第一和第二信号的反应容器的数目。第一和第二信号可以是具有不同光谱特性的光学吸光度的变化。任选地，第一和第二信号是具有不同光谱特性的发光信号。第一和第二酶可以是水解酶，例如选自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、或其组合，并且第一和第二底物选自磷酸盐、硫酸盐、半乳糖苷和葡糖苷酸修饰的稳定化二氧杂环丁烷(dioxetane)、4-甲基伞形基(4-methylumbelliferyl)、荧光素或其组合。在一个具体的例子中，第一和第二酶选自辣根过氧化酶、beta-半乳糖苷酶、和碱性磷酸酶。实施方案(16)的检测步骤可以包括经由光散射、光吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、发光、放射性、磁场或其组合的检测。实施方案(17)：用于检测样品中分析物的试剂盒，所述试剂盒在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含第一可检测标记的第一检测试剂；(b)包含第二可检测标记的第二检测试剂；(c)配置为含有一个或更少的分析物分子的多个反应容器。实施方案(18)：用于检测样品中分析物的试剂盒，所述试剂盒在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含第一可检测标记的第一检测试剂；(b)包含第二可检测标记的第二检测试剂；(c)包含捕获试剂的表面；和(d)配置为含有一个或更少的分析物分子的多个反应容器。实施方案(17)和(18)的第一和第二检测试剂可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位、适体，或其组合。在一个实例中，第一和第二检测试剂包括抗体。捕获抗体可以包含抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位、或适体，例如，捕获抗体可以包括抗体。在一个实施例中，捕获试剂可以包括靶向部分且表面可以包括靶向部分互补体，例如靶向部分和靶向剂结合伴侣选自以下结合对：亲和素-生物素、链霉亲和素-生物素、受体-配体、抗体-抗原、核酸-核酸互补体。实施方案(17)和(18)的表面可以是颗粒，且例如，捕获试剂固定在多个颗粒上。或者，该表面是反应容器之一内的位置，例如，捕获试剂固定在多个反应容器的表面上。或者，表面是反应容器之一内的位置，并且例如，捕获试剂被固定在多个反应容器的表面上。任选地，反应容器具有其上固定有靶向部分的表面，并且捕获试剂包含靶向部分互补体。多个反应容器可以包含纳米孔阵列或油包水乳剂中分散的水液滴。多个反应容器可以包含至少10,000个反应容器，并且任选地，所述多个中的反应容器具有小于100nL的体积。实施方案(17)和(18)的试剂盒中，第一可检测标记可以是偶联酶反应系统的第一酶，且第二可检测标记是偶联酶反应系统的第二酶，并且试剂盒可以在一个或多个额外的小瓶，容器或隔室中包括，反应系统的一个或多个底物。例如，第一酶是氧化酶，第二酶是过氧化物酶，底物包括氧化酶底物和标记的AmplexRed或鲁米诺衍生物。在一个具体的实施方案中，氧化酶是葡萄糖氧化酶，且氧化酶底物是葡萄糖。第一和第二可检测标记可以是接近-依赖性系统的组分，例如，第一可检测标记是FRET供体，且可检测标记是FRET受体。可以独立测量第一和第二可检测标记。任选地，第一和第二可检测标记是就光谱特性而言彼此不同的发光标记。实施方案(17)和(18)的试剂盒中，第一可检测标记是与第一底物反应产生第一信号的第一酶，且第二可检测标记是与第二底物反应产生不同的第二信号的第二酶，并且试剂盒可以在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括，第一酶底物和第二酶底物。任选地，第一和第二信号是具有不同光谱特性的光吸收的变化。在一个实施例中，第一和第二信号是具有不同光谱特性的发光信号。第一和第二酶可以是水解酶。在一个实施例中，第一和第二酶选自磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶，或其组合。第一和第二底物可以选自磷酸盐、硫酸盐、半乳糖苷和葡糖苷酸修饰的稳定的二氧杂环丁烷、4-甲基伞形酮、荧光素，或其组合。任选地，第一和第二酶选自辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。实施方案(19)：检测样品中目的分析物的方法，包括：(a)将分析物结合至捕获试剂、具有第一可检测标记的第一检测试剂和具有第二可检测标记的第二检测试剂并形成复合物，其中所述复合物中的捕获试剂在表面上固定化；(b)交联第一和第二检测试剂以形成交联产物；(c)将所述交联产物从所述表面释放到洗脱液中；(d)计算包含第一和第二可检测标记物两者的洗脱液中的个别交联产物。在该实施例(19)中，捕获试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，且在一个具体的实施例中，捕获试剂是抗体。同样，第一检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，且在一个具体的实施例中，第一检测试剂是抗体。此外，第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适配体，且具体地，第二检测试剂可以是抗体。在一个具体的实施例中，捕获试剂和第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(19)可进一步包括加入交联剂以交联第一和第二检测试剂，例如，第一和第二检测试剂包含反应性部分，且交联剂是连接到反应性部分的多官能交联剂。例如，反应性部分包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、点击化学试剂(clickchemistryreagent)，及其组合。交联剂可以包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺，点击化学试剂，及其组合。第一和第二检测试剂可以包括结合部分，并且交联剂是结合部分的多价结合伴侣。在一个实施例中，第一和第二检测试剂是动物物种的抗体，并且交联剂是靶向动物物种的抗体的多价抗物种抗体。第一和第二检测试剂可以包括生物素，并且交联剂是链霉亲和素；第一和第二检测试剂包括链霉亲和素，并且交联剂是生物素；第一和第二检测试剂与链霉亲和素连接，并且交联剂是包含多个生物素分子的聚合物；和/或第一和第二检测试剂分别包含第一和第二核酸探针，并且交联剂是寡核苷酸，其可以包含与第一核酸探针互补的序列和与第二核酸探针互补的不同序列。实施方案(19)的表面可以包括颗粒、反应容器，例如管或安瓿瓶，和/或表面可以包括多孔板的孔。实施方案(19)的方法可以进一步包括收集颗粒和洗涤颗粒以除去杂质，且任选地，通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量第一和第二可检测标记。在一个具体的实施例中，第一和第二可检测标记包括ECL标记，并且计数步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(20)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含固定的捕获试剂的表面；(b)具有第一可检测标记的第一检测试剂；(c)具有第二可检测标记的第二检测试剂；和(d)与第一和第二检测试剂反应的交联剂。实施方案(20)的第一和第二检测试剂可以包含反应性部分，并且交联剂是连接到反应性部分的多官能交联剂。反应性部分可包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、点击化学试剂，及其组合；并且交联剂可以包括胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、点击化学试剂及其组合。实施方案(20)的第一和第二检测试剂可以包含结合部分，并且交联剂是结合部分的多价结合伴侣，例如，第一和第二检测试剂是动物物种的抗体，并且交联试剂是靶向动物物种的抗体的多价抗物种抗体；所述第一和第二检测试剂包括生物素，并且交联剂是链霉亲和素；第一和第二检测试剂包括链霉亲和素，并且交联剂是生物素；第一和第二检测试剂与链霉亲和素连接，并且交联剂是包含多个生物素分子的聚合物；和/或第一和第二检测试剂分别包含第一和第二核酸探针，并且交联剂是可以包括与第一核酸探针互补的序列以及与第二核酸探针互补的不同的序列的寡核苷酸。实施方案(20)的表面可以包括颗粒、多孔板的孔，或反应容器，例如管或安瓿瓶。另外，所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于表面上不同的结合域上。如果表面是孔，则孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于孔内的不同结合域上。所述表面还可以包括电极。实施方案(21)：检测样品中感兴趣的分析物的方法，包括：(a)将分析物结合到捕获试剂、第一和第二检测试剂以形成检测复合物，其中第一检测试剂可以包括第一可检测标记和第一核酸探针，第二检测试剂可以包括第二可检测标记和第二核酸探针，并且复合物中的捕获试剂被固定在表面上；(b)如下交联第一和第二检测试剂：(i)将第一探针与第二探针杂交，(ii)将第一和第二探针与具有与第一和第二探针互补的区域的第三核酸杂交，或(iii)连接所述第一和第二探针；(c)将所述交联产物从所述表面释放到洗脱液中；(d)计数包含第一和第二可检测标记的洗脱液中的个别交联产物。实施方案(21)的捕获试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，捕获试剂是抗体。同样，第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第一检测试剂是抗体；第二检测试剂可以是抗体，抗原，配体，受体，寡核苷酸，半抗原，表位，模板或适体，例如第二检测试剂是抗体。在一个具体的实施例中，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(21)的表面可以包括颗粒、反应容器，例如管或安瓿瓶，或多孔板的孔。实施方式(21)的方法可进一步包括收集颗粒并洗涤颗粒以除去杂质。可以通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量第一和第二可检测标记。在一个具体的实施例中，第一和第二可检测标记包括ECL标记，并且计数步骤可以包括测量ECL信号实施方案(22)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包含：(a)包含固定化捕获试剂的表面；(b)具有第一可检测标记和第一核酸探针的第一检测试剂；(c)具有第二可检测标记和第二核酸探针的第二检测试剂；和(d)具有与所述第一和第二核酸探针互补的区域的第三核酸。实施方案(22)的表面可以包括颗粒、多孔板的孔或反应容器，例如管或安瓿瓶。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于表面上不同的结合域上。如果表面是孔，则孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于孔内的不同结合域上。表面任选地可以包括电极。实施方案(23)：检测样品中感兴趣的分析物的方法，其包括：(a)将分析物结合至捕获试剂、第一检测试剂和第二检测试剂以形成复合物，其中第一检测试剂可包括第一核酸探针，第二检测试剂可以包括第二核酸探针，并且复合物中的捕获试剂固定在表面上；(b)延伸所述第二核酸探针以形成包含可检测标记的延伸序列，该延伸依赖于所述复合物中第一和第二核酸探针的共定位；(c)将所述延伸序列从所述表面释放到洗脱液中；和(d)计数洗脱液中的个别延伸序列。在该实施方案中，捕获试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体。在一个具体实例中，捕获试剂是抗体。同样，第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，且在一个具体的实施例中，第一检测试剂是抗体。第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，且具体地，第二检测试剂是抗体。在一个具体的实施例中，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(23)的表面可以包括颗粒、反应容器，例如管或安瓿瓶；或多孔板的孔。实施方案(23)的方法可进一步包含收集并洗涤颗粒以除去杂质。实施方案(23)的标记可以通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量。在一个具体的实施例中，所述标记可以包括ECL标记，并且计数步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(23)的延伸步骤可以包括将探针与模板核酸序列结合，并通过聚合酶链式反应延伸探针。延伸步骤还可以包括将第一探针结合到模板核酸序列，形成环形核酸模板，并通过滚环扩增延伸环形模板。延伸步骤可以包括将第一探针结合到模板核酸序列，将第二探针结合到模板序列，以及连接第一和第二探针。任选地，所述标记是荧光标记，并且个别延伸序列的计数可以包括单分子荧光检测，例如可以包括荧光关联光谱和/或荧光交叉关联光谱。单分子荧光检测可包括使洗脱液流过毛细管，将光源聚焦在毛细管内的体积上以产生探询区，并用光检测器观察探询区以检测经过探询区的荧光分子的通过。单分子荧光检测还可包括使洗脱液流过毛细管，将光源聚焦在毛细管内的体积上以产生探询区，并用光检测器观察探询区以检测经过探询区的荧光分子的通过。实施方案(24)：检测样品中感兴趣的分析物的方法，包括：(a)将分析物结合到捕获试剂、具有第一可检测标记的第一检测试剂和具有第二可检测标记的第二检测试剂，并形成复合物，其中所述复合物中的捕获试剂被固定在表面上；(b)通过将固定化的捕获试剂从表面解离进入洗脱液，从表面释放形成的复合物；和(c)计数洗脱液中包含第一和第二可检测标记两者的个别产物。在该实施方案中，捕获试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，捕获试剂是抗体；第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第一检测试剂是抗体；第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第二检测试剂是抗体；并且在一个具体的实施例中，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(24)的表面可以包括颗粒、反应容器，例如管或安瓿瓶，和/或多孔板的孔。实施方式(24)的方法可以包括收集颗粒并洗涤颗粒以除去杂质。可以通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量第一和第二可检测标记，且在一个具体的实施方案中，第一和第二可检测标记包括ECL标记，并且计数步骤可以包括测量ECL信号实施方案(25)：检测样品中感兴趣的分析物的方法，包括：(a)将分析物结合到：(i)包含针对分析物的捕获试剂的表面上的捕获试剂；(ii)与第一核酸探针连接的用于分析物的第一检测试剂；和(iii)与第二核酸探针连接的用于分析物的第二检测试剂；从而在表面上形成复合物，所述复合物包含结合试剂、分析物以及第一和第二检测试剂；(b)使用要求第一和第二探针接近的延伸过程，延伸第二探针以形成延伸序列；和(c)测量结合到表面的延伸序列的量。在该实施方案中，捕获试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，捕获试剂是抗体；第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第一检测试剂是抗体；第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第二检测试剂是抗体；并且在一个具体的实施例中，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(25)的延伸序列可以包含一个或多个检测序列，并且测量步骤可以包含使延伸序列与与一个或多个检测序列互补的多个标记的探针接触；延伸序列可以包含一种或多种经修饰的碱基，并且测量步骤可以包含使延伸序列与能够结合一种或多种经修饰的碱基的多个可检测部分接触；和/或延伸序列可以包含一种或多种标记的碱基，并且测量步骤可以包含检测一种或多种标记的碱基的存在。一种或多种修饰的碱基包含适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位、或模拟位，并且多个可检测部分各自包含一种或多种修饰的碱基的结合伴侣和可检测标记物。一种或多种修饰的碱基可以包含链霉亲合素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记物；一种或多种修饰的碱基包含生物素，并且多个可检测部分各自包含链霉亲合素和可检测标记物；一种或多种修饰的碱基包含亲合素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记物；和/或一种或多种修饰的碱基包含生物素，并且多个可检测部分各自包含亲合素和可检测标记物。实施方案(25)的步骤(a)可包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂；以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)用于分析物的检测试剂；和(ii)表面上的捕获试剂；或将分析物同时或基本上同时结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的检测试剂。延伸步骤可以包括将探针结合到模板核酸序列，并通过聚合酶链式反应延伸探针；或将探针结合到模板核酸序列，形成环形核酸模板，并通过滚环扩增延伸环形模板。在该实施方案中，所述延伸的探针在探针延伸后可仍位于表面上，例如，所述复合物在延伸步骤后仍结合到表面。延伸步骤可包括PCR(聚合酶链式反应)、LCR(连接酶链式反应)、SDA(单链置换扩增)、3SR(自动维持合成反应)，或等温扩增方法。在一个具体的实施例中，所述延伸步骤可包括等温扩增方法，如解旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。实施方案(25)的延伸过程可包括将步骤(a)中形成的复合物与连接子序列接触，所述连接子序列包含(i)与第二探针互补的内部序列和(ii)与第一探针的非重叠区互补的双末端序列。该过程可以进一步包括连接连接子寡核苷酸的双末端序列以形成与第一和第二探针杂交的环形靶序列。实施方案(25)的延伸过程还可以包括将在步骤(a)中形成的复合物与第一连接子寡核苷酸序列和第二连接子寡核苷酸序列接触，所述第一连接子寡核苷酸序列包含互补于所述第一探针的第一区域和所述第二探针的第一区域的第一连接子探针序列，所述第二连接子寡核苷酸包含互补于所述第一探针的第二非重叠性区域和所述第二探针的第二非重叠性区域的第二连接子探针序列。该过程还可以包括连接第一和第二连接子寡核苷酸以形成与第一和第二探针两者杂交的环形靶序列。实施方案(25)的表面可以包括颗粒或多孔板的孔。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂位于表面上相同的结合域上，并且如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于孔内的相同结合域上。所述表面可以包括电极，并且测量步骤可以包括将电压波形施加到电极以产生电化学发光信号。该方法任选地包括在电极上收集颗粒并向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤可进一步包括将延伸序列结合到具有可检测标记的检测探针，测量可检测标记，并将测量与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包含与延伸序列的区域互补的核酸序列。可通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量可检测标记。在一个具体的实施例中，可检测标记是ECL标记，并且测量步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(26)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)包含用于分析物的捕获试剂的表面；(b)连接到第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；和(c)连接到第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂。实施方案(26)的捕获试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如捕获试剂可以包括抗体；第一检测试剂可包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第一检测试剂可包括抗体；第二检测试剂可包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第二检测试剂可包括抗体；并且表面可以包括颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于表面上的两个不同的结合域上；并且如果表面是孔，则孔可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂位于孔内的两个不同的结合域上。任选地，表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于表面上的相同结合域上，并且如果表面是孔，则孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂位于孔内的相同结合域上。所述表面可以包括电极。实施方案1-26的表面可以包括测定容器(例如试管、比色皿、流动池、FACS细胞分选仪、筒(cartridge)或多孔板的孔)的内表面。所述表面还可以包括载玻片、测定芯片，或测定阵列；针、探针、珠，或过滤介质；侧向流介质，例如过滤膜。实施方案(27)：检测包含一种或多种分析物分子的样品中的感兴趣的分析物的方法，所述方法包括：(a)将样品与包含位于表面上的多个可分辨结合区域的表面接触，每个可分辨结合区域包含用于样品中一种或多种分析物分子的多种捕获试剂；(b)将一种或多种分析物分子结合到(i)表面上的一种或多种捕获试剂；(ii)包含第一可检测标记的用于分析物的第一检测试剂，和(iii)包含第二可检测标记的用于分析物的第二检测试剂；从而在表面上的可分辨的结合域上形成检测复合物，所述检测复合物包括捕获试剂、分析物以及第一和第二检测试剂，其中所述第一和第二可检测标记是不同的标记化合物；(c)确定每个结合区域中分析物分子的存在或不存在；和(d)鉴定含有分析物分子的结合区域的数目和/或鉴定不含分析物分子的结合区域的数目。鉴定步骤可以包括对来自表面的光学信号进行成像以生成包括多个像素的图像，并且每个可分辨的结合区域映射到图像中的一个或多个像素。可分辨的结合区域可以是阵列的元件和/或被配置为分离个别颗粒。每个可分辨的结合区域可以是具有体积＜100nL的单个纳米孔和/或至少99％的结合区域包含零个或一个分析物分子；至少约95％的结合区域包含零个或一个分析物分子；其中至少约80％的结合区域包含零个或一个分析物分子；或至少约50％的结合区域包含零个或一个分析物分子。可以至少部分地使用包含至少一个或一个分析物分子的结合区域数目的校正曲线、泊松分布分析和/或高斯分布分析来确定样品中分析物分子的浓度。实施方案(27)的表面可以包括多个颗粒，每个颗粒包括用于分析物分子的多种捕获试剂，其中多个颗粒分布在多个可分辨结合区中，并且所述方法可以包括：(i)将一种或多种分析物分子结合到所述表面上的一种或多种结合试剂，和用于所述一种或多种分析物分子中的每一种的第一和第二检测试剂，其中所述第一和第二检测试剂分别包括第一和第二可检测标记；(ii)在可粪便结合区的阵列间分布多个颗粒；和(iii)确定每个可分辨结合区域中分析物分子的存在或不存在，以便鉴定含有分析物分子的结合区域的数目和/或鉴定不含分析物分子的结合区域的数目，其中任选地，每个可分辨的结合区域可以是具有体积＜100nL的单个纳米孔，和/或至少99％的结合区域包含零个或一个分析物分子；至少约95％的结合区域包含零个或一个分析物分子；其中至少约80％的结合区域包含零个或一个分析物分子；或至少约50％的结合区域包含零个或一个分析物分子。实施方案(27)中的捕获试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，捕获试剂是抗体；第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，第一检测试剂是抗体；第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位或适体，例如第二检测试剂是抗体。在一个具体的实施例中，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(27)的步骤(a)可以包括以下列顺序将分析物结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂；按以下顺序将分析物结合到以下种类：(i)用于分析物的第一和第二检测试剂；和(ii)表面上的捕获试剂；或将分析物同时或基本上同时结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于分析物的第一和第二检测试剂。实施方案(27)的表面可以包括颗粒或多孔板的孔。在一个具体的实施例中，所述表面可以包括电极，且所述鉴定步骤可以包括向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。实施方案(27)的方法可以进一步包括在电极上收集颗粒并向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量第一可检测标记；和/或第二可检测标记通过光散射、光学吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量。所述第一和第二可检测标记可以独立地测量，并且在一个实例中，第一和第二可检测标记是相对于光谱特性彼此不同的发光标记。实施方案(27)的表面可以包括测定容器(例如试管、比色皿、流动池、FACS细胞分选仪、筒，或多孔板的孔)的内表面。所述表面还可以包括载玻片、测定芯片，或测定阵列；针、探针、珠，或过滤介质；侧向流介质，例如过滤膜。实施方案(28)：用于检测包含一种或多种分析物分子的样品中的感兴趣的分析物的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)包含位于表面上的多个可分辨结合区域的表面，每个可分辨结合区域包含用于样品中一种或多种分析物分子的多种捕获试剂；(b)包含第一可检测标记的用于所述分析物的第一检测试剂，和(c)包含第二可检测标记的用于分析物的第二检测试剂；其中所述第一和第二可检测标记是不同的标记化合物。实施方案(28)的可分辨结合区域可以是阵列的元件和/或被配置为分离的个别的颗粒。任选地，每个可分辨的结合区域任选地是体积＜100nL的个别纳米孔。所述表面可以包括多个颗粒，每个颗粒包括用于分析物分子的多种捕获试剂，其中所述多个颗粒分布在多个可分辨的结合区域上，并且所述试剂盒可以包括：用于所述一种或多种分析物分子中的每一种的第一和第二检测试剂，其中所述第一和第二检测试剂分别包括第一和第二可检测标记。实施方案(28)中的捕获试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，捕获试剂是抗体；第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如，第一检测试剂是抗体；第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第二检测试剂是抗体。在一个具体实施例中，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是对分析物的抗体。实施方案(28)的表面可以包括颗粒或多孔板的孔。在一个具体的实施例中，表面可以包括电极，并且鉴定步骤可以包括将电压波形施加到电极以产生电化学发光信号。通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量第一可检测标记；和/或通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量第二可检测标记。第一和第二可检测标记可以独立地测量，并且在一个实施例中，第一和第二可检测标记是相对于光谱特性彼此不同的发光标记。实施方案(28)的表面可以包括测定容器(例如试管、比色皿、流动池、FACS细胞分选仪、筒，或多孔板的孔)的内表面。所述表面还可以包括载玻片、测定芯片，或测定阵列；针、探针、珠，或过滤介质；侧向流介质，例如过滤膜。实施方案(29)：检测样品中的HIVp24的方法，包括：(a)将HIVp24结合到：(i)表面上的捕获试剂，所述表面包含用于HIVp24的捕获试剂，和包含锚定寡核苷酸的锚定试剂；(ii)连接到第一核酸探针的用于HIVp24的第一检测试剂；和(iii)连接到第二核酸探针的用于HIVp24的第二检测试剂；从而在表面上形成复合物，所述复合物包含结合试剂、HIVp24以及第一和第二检测试剂；(b)使用需要第一和第二探针接近的延伸过程，延伸第二探针以形成包含与锚定序列互补的锚定序列互补体的延伸序列；(c)将锚定序列与锚定序列互补体杂交；和(d)测量结合到表面的延伸序列的量。实施方案(29)的捕获试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体。在一个具体的实施例中，捕获试剂是抗体。同样，第一检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，在一个具体的实施例中，第一检测试剂是抗体。第二检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，且在一个具体的实例中，第二检测试剂是抗体。更具体地，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是HIVp24的抗体。在实施方案(29)中，锚定寡核苷酸序列可以包括单链寡核苷酸序列或双链寡核苷酸序列。在该实施方案中，延伸序列可以包括一个或多个检测序列，且测量步骤可以包括将延伸序列与多个与一个或多个检测序列互补的标记探针接触。延伸序列还可以包括一个或多个修饰的碱基，并且测量步骤可以包括将延伸序列与能够结合一个或多个修饰的碱基的多个可检测部分接触。延伸序列可以进一步包含一种或多种经标记的碱基，并且测量步骤可以包括检测一种或多种标记的碱基的存在。一种或多种修饰的碱基可以包括适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位，或模拟表位，并且多个可检测部分各自包含一种或多种修饰的碱基的结合伴侣和可检测标记。例如，一种或多种修饰的碱基包含链霉亲合素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记物；一种或多种修饰的碱基包含生物素，并且多个可检测部分各自包含链霉亲合素和可检测标记物；或者一种或多种修饰的碱基包含亲合素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记物；和/或一种或多种修饰的碱基包含生物素，并且多个可检测部分各自包含亲合素和可检测标记。实施方案(29)的步骤(a)可以包括按以下顺序将HIVp24结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于HIVp24的检测试剂。或者，步骤(a)可包括以下列顺序将HIVp24结合到以下种类：(i)用于HIVp24的检测试剂；和(ii)表面上的捕获试剂；或步骤(a)可以包括同时或基本上同时将HIVp24结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于HIVp24的检测试剂。实施方案(29)的延伸步骤可以包括将探针结合到模板核酸序列，并通过聚合酶链式反应延伸探针。延伸步骤可以进一步包括将探针结合到模板核酸序列，形成环形核酸模板，并通过滚环扩增延伸环形模板。在探针延伸之后延伸的探针可以仍位于表面上，例如在延伸步骤后复合物仍结合到表面上。所述延伸的探针在所述表面上的复合物位置的10-100um内的位置处结合到所述锚定试剂。在一个具体实施方案中，所述延伸的探针在所述表面上的复合物位置的小于100um、小于50um，或更特别地小于10um的位置处结合到所述锚定试剂。延伸步骤可包括PCR(聚合酶链式反应)、LCR(连接酶链式反应)、SDA(单链置换扩增)、3SR(自动维持合成反应)，或等温扩增方法。在一个具体的实施例中，所述延伸步骤可包括等温扩增方法，例如为解旋酶依赖性扩增或滚环扩增(RCA)。实施方案(29)的延伸过程可包括将步骤(a)中形成的复合物与连接序列子接触，所述连接子序列包含(i)与第二探针互补的内部序列和(ii)与第一探针的非重叠区互补的双末端序列。该方法可以进一步包括连接寡核苷酸的双末端序列以形成与第一和第二探针两者杂交的环形靶序列。或者，延伸过程可包括将实施方案(29)的步骤(a)中形成的复合物与第一连接子寡核苷酸序列和第二连接子寡核苷酸序列接触，所述第一连接子寡核苷酸序列包括与第一探针上的第一区域和第二探针上的第一区域互补的第一连接子探针序列，所述第二连接子寡核苷酸序列包含与第一探针的第二非重叠区和第二探针的第二非重叠区互补的第二探针序列；并且任选地，连接第一和第二连接子寡核苷酸以形成与第一和第二探针两者杂交的环形靶序列。实施方案(29)的表面可以包括颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是板的孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面还可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上相同的结合域上。如果表面是板的孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕获试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。在一个具体的实施例中，所述表面可以包括电极，且所述测量步骤还可包括向电极施加电压波形以产生电化学发光信号，并且任选地，实施方式(29)的方法进一步包括在电极上收集颗粒并向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。实施方案(29)的测量步骤可以包括将延伸序列与具有可检测标记的检测探针结合，测量可检测标记，并将该测量与样品中p24的量相关联，其中检测探针包含与延伸序列的区域互补的核酸序列。可通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场或其组合的测量来测量可检测标记。在一个具体的实施例中，所述可检测标记是ECL标记，且测量步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(30)：用于检测样品中的HIVp24的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)表面，包含(i)用于HIVp24的捕获试剂，和(ii)包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；(b)与第一核酸探针连接的用于HIVp24的第一检测试剂；和(c)与第二核酸探针连接的用于HIVp24的第二检测试剂。实施方案(30)的捕获试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，在一个具体的实施例中，捕获试剂可以包括抗体。同样，第一检测试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，在一个具体的实施例中，第一检测试剂可以包括抗体。类似地，第二检测试剂可以包括抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位，模拟表位，或适体，且在一个具体的实施例中，第二检测试剂可以包括抗体。实施方案(30)的表面可以包括颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面还可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上相同的结合域上；和/或如果表面是孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。捕获试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。在一个具体的实施例中，所述表面可以包括电极。实施方案(31)：检测样品中的HIVp24的方法，包括：(a)将HIVp24结合到：(i)在表面上的用于HIVp24的捕获试剂，所述表面包含捕获试剂和锚定试剂；(ii)包含第一近端探针的用于HIVp24的第一检测试剂，和(iii)包含第二近端探针的用于HIVp24的第二检测试剂；从而在表面上形成检测复合物，所述检测复合物包含捕获试剂、HIVp24以及第一和第二检测试剂；(b)将在(c)中形成的检测复合物与连接子序列相接触，所述连接子序列包含(i)与第二近端探针互补的内部序列和(ii)与第一近端探针的非重叠区域互补的双末端序列；(c)将连接子序列与第一和第二近端探针杂交；(d)连接连接子寡核苷酸的双末端序列以形成与第一和第二近端探针的两者杂交的环形靶序列；(e)通过靶序列的滚环扩增来延伸第二近端探针以产生包含结合锚定试剂的结合域的扩增子；(f)将扩增子结合到锚定试剂；和(g)测量表面上的扩增子的量。实施方案(32)：检测样品中的HIVp24的方法，包括：(a)将HIVp24结合到：(i)在表面上的用于HIVp24的捕获试剂，所述表面包含捕获试剂和锚定试剂；(ii)包含第一近端探针的用于HIVp24的第一检测试剂，和(iii)包含第二近端探针的用于HIVp24的第二检测试剂；从而在表面上形成检测复合物，所述检测复合物包含捕获试剂、HIVp24以及第一和第二检测试剂；(b)将在(c)中形成的检测复合物与第一连接子寡核苷酸和第二连接子寡核苷酸相接触，其中(i)第一连接子的第一末端和第二连接子的第一末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补，且(ii)第一连接子的第二末端和第二连接子的第二末端与第一近端探针的两个非重叠区域互补；(c)将第一和第二连接子寡核苷酸与第一和第二近端探针杂交；(d)连接第一和第二连接子寡核苷酸以形成与第一和第二近端探针的两者杂交的环形靶序列；(e)通过靶序列的滚环扩增来延伸第二近端探针以产生包含结合锚定试剂的结合域的扩增子；(f)将扩增子结合到锚定试剂；和(g)测量表面上的扩增子的量。实施方案(31)和(32)的捕获试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，且在一个具体实施例中，捕获试剂是抗体。类似地，第一检测试剂可以是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第一检测试剂是抗体。另外，第二检测试剂是抗体、抗原、配体、受体、寡核苷酸、半抗原、表位、模拟表位，或适体，例如第二检测试剂是抗体。在实施方案(31)和(32)的一个具体的实施例中，捕获试剂以及第一和第二检测试剂是对HIVp24的抗体。实施方案(31)和(32)的锚定试剂可以包括寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位或模拟表位。在一个实施例中，结合表位可以包括适体，且锚定试剂可以包括适体配体。结合域可以包括核酸序列，且锚定试剂可以包括DNA结合蛋白；和/或锚定试剂可以包括寡核苷酸序列，且扩增子可以包括互补寡核苷酸序列。实施方案(31)和(32)的扩增子可以包含一个或多个检测序列，并且测量步骤可以包含使延伸序列接触与一个或多个检测序列互补的多个经标记的探针。此外，扩增子可以进一步包含一种或多种经修饰的碱基，并且测量步骤可以包含使延伸序列接触能够结合一种或多种经修饰的碱基的多个可检测部分。此外，扩增子可以进一步包含一种或多种经标记的碱基，并且测量步骤可以包含检测一种或多种经标记的碱基的存在。一种或多种经修饰的碱基可以包含适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位、或模拟位，并且多个可检测部分各自包含一种或多种经修饰的碱基的结合伴侣和可检测标记物。一种或多种经修饰的碱基可以包含链霉亲合素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记物；一种或多种经修饰的碱基可以包含生物素，并且多个可检测部分各自包含链霉亲合素和可检测标记物；一种或多种经修饰的碱基可以包含亲合素，并且多个可检测部分各自包含生物素和可检测标记物；和/或一种或多种经修饰的碱基可以包含生物素，并且多个可检测部分各自包含亲合素和可检测标记物。实施方案(31)和(32)的步骤(a)可包括以下列顺序将HIVp24结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于HIVp24的第一和第二检测试剂。或者，步骤(a)可包括以下列顺序将HIVp24结合到以下种类：(i)用于HIVp24的第一和第二检测试剂；和(ii)表面上的捕获试剂。另外，步骤(a)可以包括同时或基本上同时将HIVp24结合到以下种类：(i)表面上的捕获试剂；和(ii)用于HIVp24的第一和第二检测试剂。实施方案(31)和(32)的扩增子可以在探针延伸之后仍位于表面上。复合物可以在延伸步骤后仍结合在表面上。例如，扩增子在表面上的复合物的位置的10-100um内的位置处与锚定试剂结合。在一个具体实施方案中，所述延伸的探针在所述表面上的复合物位置的小于100um、小于50um，或更特别地小于10um的位置处结合到所述锚定试剂。实施方案(31)和(32)的表面可以包含颗粒和/或多孔板的孔。所述表面可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上的两个不同的结合域上。如果表面是板的孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的两个不同的结合域上。所述表面可以包含多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于表面上相同的结合域上。如果表面是板的孔，则所述孔可以包括多个不同的结合域，并且捕获试剂和锚定试剂位于孔内的相同结合域上。在一个具体的实施例中，捕获试剂和锚定试剂在表面上的10-100nm内。另外，表面可以包括电极，并且测量步骤可以包括将电压波形施加到电极以产生电化学发光信号。在这些实施方案((31)和(32))中，该方法还可以包括在电极上收集颗粒并向电极施加电压波形以产生电化学发光信号。测量步骤可以包括将扩增子结合到具有可检测标记的检测探针，测量可检测标记，并将测量与样品中分析物的量相关联，其中检测探针包含与扩增子区域互补的核酸序列。可检测标记通过光散射、光吸收、荧光、化学发光、电化学发光、生物发光、磷光、放射性、磁场，或其组合的测量来测量。例如，可检测标记是ECL标记，且测量步骤可以包括测量ECL信号。实施方案(33)：检测样品中感兴趣的分析物的方法，包括：(a)在足以形成包含结合至第一检测试剂的分析物的分析物复合物的条件下浓缩样品，其中所述第一检测试剂连接至第一核酸探针；(b)将步骤(a)中形成的分析物复合物结合到：(i)表面上的捕获试剂，所述表面包含用于分析物的捕获试剂，和包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；和(ii)与第二核酸探针连接的用于分析物的第二检测试剂；从而在表面上形成包含捕获试剂、分析物以及第一和第二检测试剂的复合物；(c)使用需要第一和第二探针接近的延伸过程，延伸第二探针以形成包含锚定序列互补体的延伸序列，所述互补体与锚定序列互补；(d)将锚定序列与锚定序列互补体杂交；和(e)测量结合到表面的延伸序列的量。浓缩步骤(a)可进一步包括(i)将包含分析物的样品与固相接触，所述固相连接至与第一核酸探针的至少一部分互补的靶向剂，从而形成包含通过所述第一核酸探针和靶向剂之间的结合反应结合到固相的分析物的浓缩复合物；(ii)收集所述浓缩复合物；(iii)从所述浓缩复合物中分离样品的未结合的组分；和(iv)释放所述浓缩复合物以将固相从所述分析物分离，以形成分析物复合物。实施方案(34)：用于检测样品中感兴趣的分析物的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)表面，包含(i)用于分析物的捕获试剂，和(ii)包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；(b)连接到第一核酸探针的用于分析物的第一检测试剂；(c)连接到第二核酸探针的用于分析物的第二检测试剂；和(d)固相，其包含与第一核酸探针的至少一部分互补的靶向剂。实施方案(35)：检测样品中的外来体(exosome)的方法，包括：(a)将外来体结合到：(i)表面上的捕获试剂，所述表面包含用于外来体的捕获试剂，和包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；(ii)连接到第一核酸探针的用于外来体的第一检测试剂；和(iii)连接到第二核酸探针的用于外来体的第二检测试剂；从而在表面上形成复合体，所述复合体包含结合试剂、外来体以及第一和第二检测试剂；(b)使用需要第一和第二探针接近的延伸过程，延伸第二探针以形成包含锚定序列互补体的延伸序列，所述互补体与锚定序列互补；(c)将锚定序列与锚定序列互补体杂交；和(d)测量结合到表面的延伸序列的量。实施方案(36)：用于检测样品中感兴趣的外来体的试剂盒，其在一个或多个小瓶、容器或隔室中包括：(a)表面，包含(i)用于外来体的捕获试剂，和(ii)包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；(b)连接到第一核酸探针的用于外来体的第一检测试剂；和(c)连接到第二核酸探针的用于外来体的第二检测试剂。附图简述图1(a)-(c)例示了免疫测定中锚定试剂的使用。图1(a)显示了使用锚定试剂结合和稳定化检测复合物，所述检测复合物包含捕获试剂、感兴趣的分析物和包含核酸探针的检测试剂。延伸核酸探针以结合锚定试剂。在图1(b)中，锚定试剂包含以下寡核苷酸序列，其包含与检测试剂上形成的延伸序列的一部分互补的区域。图1(c)显示了在具体的实施方案中，使用两种检测试剂以结合分析物，每种检测试剂包括核酸探针。对检测试剂上的探针进行扩增过程，所述过程使得一种延伸的探针与锚定寡核苷酸序列杂交。图2(a)显示一个具体的实施方案，其中对带有锚定试剂的表面上形成的免疫复合物进行PLA-RCA过程以在附接于免疫复合物的延伸序列中掺入多种可检测的种类。图2(b)和2(c)是连接寡核苷酸的两种备选的配置，其可以在本发明的方法中采用。图3显示将寡核苷酸附接于蛋白质的方法。图4(a)例示了本发明的一个优选的实施方案，其中在捕获试剂、分析物和两种检测试剂之间形成表面结合复合物，其中所述两种检测试剂各自分别附接第一和第二近端探针，其(ligated)到连接子探针以形成环形DNA模板，其通过滚环扩增来扩增。图4(a)还包括扩增试剂，其包括与随着测定方法进展形成的扩增子的序列互补的锚定寡核苷酸序列。图4(b)显示了第一环形DNA模板Circ-1、检测寡核苷酸序列，扩增子的无活性区(inertregion)和被设计为与第二近端探针杂交的部分PP2的示例性序列。在图4(c)中描绘了替代实施方案。图5和图6(a)-(b)例示了生成可通过滚环扩增来扩增的扩增子的备选方法。图7例示了一个备选的实施方案，其中夹心复合物中的每个近端探针的一部分由杂交于各区段的RNA短链暂时保护。酶法除去那些链以允许近端探针彼此杂交和与要延伸的链杂交。图8显示了进一步的实施方案，其中近端探针附接于捕获试剂和检测试剂，且每个近端探针的一部分由与其杂交的RNA短链暂时保护，如上文关于图8描述的。图9显示使用实施例1中描述的方法进行的IL-10测定法的校正曲线。图10(a)-(b)显示了使用(a)和不使用(b)锚定试剂的荧光显微图像。图11(a)显示了包括连接位点1或2的单个线性连接子寡核苷酸序列的配置，以及在本发明的测定中这些连接子的使用。图11(b)显示了使用Circ-1和Circ-2的组合相对于(vs.)包括连接位点1的单个线性连接寡核苷酸序列或包括连接位点2的单个线性连接寡核苷酸序列的测定的比较性能数据。图12显示使用实施例1和6中描述的方法进行的HIVp24测定法的校正曲线。图13显示使用实施例1和6中描述的方法对血清转化组(seroconversionpanel)的分析的结果。图14(a)-(c)显示包括分析物浓缩步骤的用于HIVp24的测定结果。图15显示包括分析物浓缩步骤的用于HIVp24测定的校正曲线。图16是如本文所述的包括分析物浓缩步骤的测定方法的示意图。图17是如本文所述的测定方法的示意图，其中在通过捕获试剂和/或锚定试剂结合到表面之前在溶液中形成扩增子。图18是结合使用多个U形序列(staplesequences)以附着于扩增子，从而在表面上形成更紧凑结构的测定方法的示意图。图19是结合3ABPLA-RCA技术和使用靶向部分及其互补体以将捕获试剂结合到表面的桥接免疫测定形式(bridgingimmunoassayformat)的示意图。图20(a)-(b)是用于模板形成的生物合成方法的示意图。图21是样品多重化(multiplexing)的示意图。图22是使用本文所述方法检测脂蛋白复合物的示意图。发明详述除非本文中另外定义，关于本发明中使用的技术和科学术语应具有与本领域中的普通技术人员普遍理解的相同的含义。此外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。冠词“一个”和“一种”用于本文指一个/种或超过一个/种(即至少一个/种)的该冠词的语法对象。例如，“一个/种要素”意指一个/种要素或超过一个/种要素。本发明包括改进的免疫测定方法，其包括(i)锚定靶分析物和测定法中使用的一种或多种分析物结合试剂之间形成的检测复合物；和/或(ii)从经标记的检测复合物扩增信号。锚定可用于稳定化牵涉低结合亲和力相互作用和/或一种或多种高分子量标记物或标记位点的复合物。信号扩增可通过将延伸的探针附接于含有多个标记物或检测标记位点的结合复合物，由此对于每个检测复合物扩增可检测信号来实现。在一个优选的实施方案中，所述方法包括将包含多个标记物或检测标记位点的延伸探针附接于检测复合物，并将该复合物锚定至表面以确保复合物保留在表面上。这种经改良的测定方法可用于检测极低数目的结合事件，甚至单个的分析物-结合试剂复合物。该基础办法不限于免疫测定且可用于实施使用其他结合试剂类别的结合测定法。可用于改进结合测定法的一种方法是使用表面结合的锚定试剂以将包含目的分析物的检测复合物粘附至表面并稳定化该检测复合物。该办法可用于克服形成检测复合物的试剂之间的低结合亲和力和/或预防复合物在随后处理之前从表面解离。锚定试剂在结合测定法中的使用例示于图1(a)。表面(101)包含结合分析物A的捕捉试剂(102)和锚定试剂(103)。在一个或多个步骤中，分析物结合捕捉试剂且检测试剂(104)也结合分析物,，其中所述检测试剂连接于核酸探针(105)。分析物可同时或基本同时地结合捕捉和检测试剂，或分析物可以序贯结合捕捉和检测试剂的每一种(以任一次序)。因此，在表面上形成复合物(106)，其包含捕捉试剂、分析物和检测试剂。探针延伸以形成延伸序列(107)，其包含结合锚定试剂的锚定区域。延伸序列结合锚定试剂，并测量结合于表面的延伸序列的量。结合测定领域的熟练技术人员将容易地理解可用于所述方法的捕捉试剂和陪伴结合伴侣的范围。这类对的非限制性例子包括(以任一次序)受体/配体对、抗体/抗原、天然或合成受体/配体对、半抗原/抗体对、抗原/抗体对、表位/抗体对、模拟位/抗体对、适体/靶分子对、杂交伴侣、和嵌入物/靶分子对。在一个实施方案中，结合测定法采用抗体或其他受体蛋白质作为目的分析物的捕捉和/或检测试剂。术语“抗体”包括完整的抗体分子(包括通过抗体亚基的体外重联合组装的杂合抗体)、包含抗体的抗原结合域的抗体片段和重组蛋白质构建体(如记载于例如Porter,R.R.和Weir,R.C.J.CellPhysiol.,67(Suppl)；51-64(1966)和Hochman,1.Inbar,D.andGivol,D.Biochemistry12:1130(1973))、以及已经过化学修饰(例如通过引入可检测的标记)的抗体构建体。类似地，锚定试剂和相应的锚定成员或区域可包含任何适宜的结合对，例如受体/配体对、抗体/抗原、天然或合成受体/配体对、半抗原/抗体对、抗原/抗体对、表位/抗体对、模拟位/抗体对、适体/靶分子对、杂交伴侣、和嵌入物/靶分子对，和使用通过静电电荷结合的表面和锚定试剂。例如，锚定试剂可以是寡核苷酸序列、适体、适体配体、抗体、抗原、配体、受体、半抗原、表位、或模拟位，且相应的锚定区域分别包含互补的寡核苷酸序列、适体配体、适体、抗原、抗体、受体、配体、或抗体。在一个具体的实施方案中，锚定区域是寡核苷酸序列且锚定试剂包含DNA结合蛋白质。或者，如果锚定区域是双链寡核苷酸序列，则锚定试剂可包含嵌入剂。在一个另外的实施方案中，锚定区域可包含一个或多个经修饰的寡核苷酸碱基且相应的锚定试剂包含结合锚定区域上经修饰的碱基的一个或多个模块。例如，所述经修饰的碱基可包含半抗原或配体，而相应的锚定试剂包含分别特异于该半抗原或配体的一种或多种抗体或配体。而且，锚定区域可包含多个经标记的核苷酸碱基，其可用于检测检测复合物。在图1(b)中绘出的一个具体的实施方案中，结合表面的锚定试剂包含用于将检测复合物锚定至表面的寡核苷酸。锚定寡核苷酸序列结合附接于检测复合物的互补性寡核苷酸序列。在该实施方案中，表面(108)包含结合分析物A的捕捉试剂(109)，和包含锚定寡核苷酸序列(111)的锚定试剂(110)。在一个或多个步骤中，分析物结合于捕捉试剂和也结合分析物的检测试剂(112)，其中所述检测试剂连接于核酸探针(113)。如上文对于图1(a)描述的，分析物可以同时或基本同时地结合捕捉和检测试剂，或分析物可以序贯结合捕捉和检测试剂的每一种(以任一次序)。因此，在表面上形成复合物(114)，其包含结合试剂、分析物和检测试剂。探针延伸以形成延伸序列(115)，其包含互补于锚定序列的锚定序列互补体。锚定序列杂交于锚定序列互补体，并测量结合于表面的延伸序列的量。所述检测复合物可包含一种或多种检测试剂，例如以增强测定对分析物的特异性。使用多种检测试剂能增强测定的特异性，如果例如测定设计为当每种检测试剂在分析物附近时发出可检测信号，或者来自结合于分析物的单一检测试剂的信号能与从结合于分析物的多种检测试剂发出的信号区分的话。这类测定的一个实施方案显示于图1(c)。表面(116)包含结合分析物A的捕捉试剂(117)和包含锚定寡核苷酸序列(119)的锚定试剂(118)。在一个或多个步骤中，分析物结合于捕捉试剂和结合分析物的两种(或更多种)检测试剂的每一种(分别为120和121)，其中所述第一和第二检测试剂的每一种连接于核酸探针(122和123，分别为第一和第二核酸探针)。分析物可以同时或基本同时，或以序贯、逐步的方式结合捕捉和检测试剂。因此，在表面上形成复合物(124)，其包含捕捉试剂、分析物和一和第二检测试剂。使用需要第一和第二探针彼此接近的延伸过程，第一探针延伸以形成延伸序列(125)，其包含互补于锚定序列的锚定序列互补体。在倒数第二步中，锚定序列杂交于锚定序列互补体，并测量结合于表面的延伸序列的量。图1(c)中绘出的方法的一个具体的实施方案显示于图2(a)，其中锚定试剂用于将检测复合物粘附于表面且附接于检测复合物的探针延伸以生成结合锚定试剂的延伸区域。在该实施方案中，使用结合于近端探针的两种检测试剂检测复合物。该方法还包括将检测试剂与连接体序列联合，其然后连接以形成环状靶序列，并进行滚环扩增以生成结合锚定试剂的扩增子。表面(201)包含捕捉试剂(202)和锚定试剂(203)。在一个或多个步骤中，分析物结合于捕捉试剂，包含第一近端探针(205)的第一检测试剂(204)，和包含第二近端探针(207)的第二检测试剂(206)，由此在表面上形成检测复合物(208)。使该检测复合物与两种连接体序列(209a和209b)接触，其各自包含与所述第一近端探针的非重叠性区域互补的端序列和与所述第二近端探针的非重叠性区域互补的端序列。连接体序列与第一和第二近端探针杂交，且连接体寡核苷酸的端序列连接以形成环状靶序列(210)，其与第一和第二近端探针两者杂交。第二近端探针通过滚环杂交延伸以生成包含结合锚定试剂的结合试剂的扩增子，并测量结合于表面的扩增子的量。第一近端探针可以加帽或有其他修饰以防止第一探针的延伸。(在一个备选的实施方案中，第一近端探针延伸而第二近端探针可以加帽或有其他修饰以防止延伸)。在图2(a)绘出的实施方案中，扩增子还包含两个或更多个互补于经标记的检测探针的检测序列，所述检测探针与扩增子杂交，用于测量结合于表面的扩增子的量。在一个备选的实施方案中(未在图2(a)绘出)，延伸过程将经标记的核苷酸碱基掺入扩增子，其用于直接检测表面上的扩增子而不用添加与扩增子互补的一种或多种经标记的探针。图2(b)是连接体序列组成的示意图，其显示第一和第二连接体寡核苷酸(分别为209a和209b)，其中第一连接体的第一端(C1(E1))和第二连接体的第一端(C2(E1))互补于第一近端探针的两个非重叠性区域，且第一连接体的第二端(C1(E2))和第二连接体的第二端(C2(E2))互补于第二近端探针的两个非重叠性区域。所述第一和第二连接体与第一和第二近端探针杂交且第一和第二连接体连接以形成环状靶序列，其与第一和第二近端探针两者杂交。图2(c)显示了连接体的一个备选实施方案。连接体序列211包含互补于第二近端探针的内部序列(CIS)和互补于第一近端探针的非重叠性区域的两个端序列(分别为CE1和CE2)。在该实施方案中，仅需要一个连接事件来形成环状靶序列用于滚环扩增(即与第一近端探针杂交的端CE1和CE2的连接)，然而，由于引发/延伸来自第二近端探针，仍需要两种近端探针接近。优选地，第一近端探针加帽或有其他修饰以防止第一探针的延伸。其后，第二近端探针通过环状靶序列的滚环扩增延伸以生成扩增子，其包含结合锚定试剂的结合区，并测量结合于表面的扩增子的量。第一和第二近端探针的序列可通过本领域技术人员已知的方法设计。例如，每种探针长度为约20-50个碱基，优选长为25-40个碱基，最优选长为约30-35个碱基。第一和第二近端探针还包含与如本文中描述的过程中使用的一种或多种连接体序列或其部分互补的序列。在一个实施方案中，使检测复合物与两种连接体序列(209a和209b)接触，其各自包含互补于第一近端探针的非重叠性区域的端序列和互补于第二近端探针的非重叠性区域的端序列。因此，在该实施方案中，第一和第二近端探针各自包含互补于连接体的端序列的非重叠性区域。或者，可使用仅一种连接体且该连接体序列(211)包含互补于第二近端探针的内部序列(CIS)和互补于第一近端探针的非重叠性区域的两个端序列(分别为CE1和CE2)。因此，在该实施方案中，第一近端探针包含分别互补于连接体的两个端序列CE1和CE2的非重叠性区域，而第二近端探针包含互补于连接体的内部序列(CIS)的序列。第一近端探针可以加帽或有其他修饰以防止第一探针的延伸。(在一个备选的实施方案中，第一近端探针延伸而第二近端探针可以加帽或有其他修饰以防止延伸。)因此，示于图1-2图1-2中例示的实施方案显示可改良结合测定法以纳入锚定试剂和/或可以扩增来自检测复合物的信号。在一个优选的实施方案中，在结合测定法中采用锚定试剂和信号扩增方法。在包括使用锚定试剂的实施方式中，存在于表面的锚定试剂的浓度为0.2-200ug/mL，特别是，1.0-50ug/mL，且更特别是3.0-10ug/mL。或者，仅一种或另一种方法可以用于实现增强的结合测定。本发明因此包括具有如图1-2中描述的信号扩增方法的测定法，省去了锚定试剂。在其中锚定试剂包含直接或间接结合于表面(例如经由结合反应)的锚定序列的那些实施方案中，可以采用本领域中建立的用于固定化寡核苷酸的方法来生成锚定试剂，包括共价和非共价附接方法。在一个实施方案中，所述锚定试剂包含连接或以其他方式结合于锚定序列的蛋白质。在该实施方案中，可以使用能固定化在表面上(共价或非共价)并通过锚定寡核苷酸修饰的任意蛋白质。非限制性例子包括链霉亲合素、亲合素或牛血清清蛋白(BSA)。在一个优选的实施方案中，锚定试剂包含BSA。蛋白质可由锚定寡核苷酸修饰并使用已知的方法附接于表面，例如如图3中例示的，使用磺基琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(Sulfo-SMCC)，一种确立的异双功能交联剂。SMCC的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团与牛血清清蛋白(BSA)的反应将BSA标记有硫醇反应性马来酰亚胺基团。马来酰亚胺基团相应地与硫醇修饰的寡核苷酸反应以形成BSA-寡核苷酸缀合物，其经由稳定的硫醚键连接。在一个具体的例子中，通过将一系列BSA-寡核苷酸缀合物打印到石墨碳表面(优选丝网印刷的碳墨电极(screenprintedcarboninkelectrode))上来形成阵列。或者，如果蛋白质是亲合素或链霉亲合素，则锚定序列可连接于生物素并经由生物素-亲合素或生物素-链霉亲合素相互作用联合至固定化的亲合素或链霉亲合素。附接于锚定试剂的锚定寡核苷酸可以是将与在延伸过程期间形成的延伸序列(或扩增子)杂交的任意序列。锚定寡核苷酸还可以包含非互补性区域(例如聚(A)序列)，其用作表面和互补性(杂交)区域之间的接头序列以将互补性区域伸至离开表面。在一个实施方案中，杂交序列选择为与结合近端或检测探针无关的扩增子区域(“无活性”区域)。在一个更具体的实施方案中，单独或与聚(A)臂(例如长度多达30个核苷酸)组合地纳入互补于扩增子的全长无活性区域的杂交序列(优选长度约25个核苷酸)。优选地，锚定寡核苷酸选自：(i)(扩增子无活性区域的全长互补体，长度25个核苷酸)-(20个核苷酸聚(A)臂)；或(ii)(扩增子无活性区域一部分的互补体，长度15个核苷酸)-(30个核苷酸聚(A)臂)。在一个实施方案中，实施近端连接扩增(PLA)来延伸第二近端探针。如上文对图2(a)-(c)描述的，使包含两种近端探针的复合物与一种或多种连接体寡核苷酸(209a-209b或211)接触，且杂交的连接体序列的连接形成环状寡核苷酸，其然后用于通过环的滚环扩增(RCA)延伸第二近端探针。适宜的探针设计和近端连接扩增的扩增条件是本领域中确立的。本发明的一个独特方面是在连接体之一中纳入与锚定试剂中使用的相同序列。由此在第二近端探针的延伸期间，延伸的区域包含锚定序列的互补体，其与锚定试剂杂交，从而稳定化夹心复合物和防止第二近端探针的解离。延伸的第二近端探针可含有可检测的标记(例如通过在RCA延伸反应期间纳入经标记的核苷酸)，可测量该标记来测定表面上分析物的量。或者，添加包含可检测的标记的多种经标记的探针且与延伸的第二近端探针杂交，并测量结合于表面上的分析物的量。可以使用任何适宜的扩增技术来生成延伸序列(或扩增子)，包括但不限于，PCR(聚合酶链式反应)，LCR(连接酶链式反应)，SDA(链置换扩增)，3SR(自维持合成反应)，和等温扩增方法，例如螺旋酶依赖性扩增和滚环扩增(RCA)。在一个优选的实施方案中，使用RCA因为其就灵敏性、多重性、动态范围和可扩缩性而言具有显著优势。RCA的技术是本领域中已知的(参见例如Baner等,NucleicAcidsResearch,26:50735078,1998；Lizardi等,NatureGenetics19:226,1998；Schweitzer等Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:10113119,2000；Faruqi等,BMCGenomics2:4,2000；Nallur等,Nucl.AcidsRes.29:e118,2001；Dean等GenomeRes.11:10951099,2001；Schweitzer等,NatureBiotech.20:359365,2002；U.S.Pat.Nos.6,054,274,6,291,187,6,323,009,6,344,329和6,368,801)。已知RCA的几种不同的变型，包括线性RCA(LRCA)和指数性RCA(ERCA)。RCA生成数以千计的环状模板的拷贝，拷贝的链附接于初始靶DNA，从而允许靶物的空间分辨和信号的快速扩增。RCA促进(i)单一靶分子的检测；(ii)来自蛋白质以及DNA和RNA的信号的扩增；(iii)鉴定已扩增的分子在固体表面上的位置；(iv)同时测量许多不同的靶物；和(v)分析溶液中或固相中的一种或多种靶物。在基于阵列或颗粒的形式中进行多重结合测定法时，RCA产物与检测复合物的空间定位是尤为有利的。本发明的一个具体实施方案描述在图4(a)中，其中使用锚定试剂和信号扩增过程两者。在表面(401)上形成捕获试剂(402)、分析物(403)和两种检测试剂(304和305)之间的复合物，每种检测试剂分别包括第一和第二近端探针(406和407)。分别添加图4(a)中第一和第二连接子寡核苷酸Circ-1(408)和Circ-2(409)，当两种近端探针均存在于复合物中时，每个杂交并桥连两个近端探针。结合的连接子探针分别在连接位点1和2(410和411)处连接以形成环形DNA模板(412)。通过滚环扩增来扩增环形DNA模板以延伸第二近端探针，从而产生包含一个或多个检测序列(413)和锚定寡核苷酸序列互补体(414)的扩增子(包括部分锚定序列互补体(415))。锚定寡核苷酸序列(416)(附接于捕获部分(417))和其互补体杂交，多个检测探针与多个检测探针序列杂交，并且测量结合到表面的分析物的量(未显示，但例示于图1(a))。图4(b)显示了第一环形DNA模板Circ-1(408)(其设计为与第一近端探针(PP1)杂交)、检测寡核苷酸序列、扩增子的无活性区域(其可全部或部分使用以结合锚定寡核苷酸序列)和部分PP2(其设计为与第二近端探针杂交)。另外的实施方案如图4(c)所示，其中通过滚环扩增来扩增环形DNA模板以产生包含多个检测序列(分别为418和419)的扩增子。在进一步实施方案中，附接于捕获部分417的锚定寡核苷酸序列(416)可以作为具有游离3'末端的引物。在该实施方案中，第二近端探针包括与检测序列(413)互补的序列。在一个实施方案中，本文所述的测定形式利用与检测序列的5'末端偶联的检测试剂，其中3'端暴露以促进与连接子探针的连接以形成环形DNA模板，其然后通过滚环扩增以延伸第二近端探针(PP2)。在该实施方案中，PP1潜在地独立地可用于通过聚合酶的延伸，但是这个问题可以通过添加修饰的碱基以防止聚合酶引发(priming)来解决。或者，连接模板PP1可以通过其3'末端直接偶联到检测试剂，防止该寡核苷酸作为DNA聚合酶的引物参与，即使它被降解。生成通过RCA或任何适宜的扩增方法扩增的靶序列的另一种办法例示于图5中。在该实施方案中，每种近端探针能折叠成环状发夹结构。这些发夹结构的形成生成单链环和双链部分，其含有重组信号。添加重组酶以驱动两个发夹结构的重组从而形成环状DNA模板，其随后进行如上文描述的RCA。标记扩增子且任选地锚定于锚定试剂，并检测分析物。该实施方案的关键要素是重组酶催化含有序列特异性重组位点的DNA的位点特异性重组的能力。例如，来自噬菌体P1的Cre重组酶在含有loxP位点的位点处催化重组，且其他非限制性例子包括但不限于翻转酶(Flippase)(flp，来自Yeast)，Hin(Salmonella)和Tre，Cre的工程化(进化)型式。这种备选的办法不需要添加另外的组分如寡核苷酸模板、ATP和dNTP。在该实施方案中，loxP(重组)位点优选修饰为非对称的，从而产生朝向期望的重组产物形成的正常平衡中的迁移。这在图5中例示，重组位点具有浅/深色阴影。而且，图6(a)又例示了另一种生成靶序列的方法，其通过RCA或任何适宜的扩增方法扩增。附接于检测试剂的每种近端探针包含loxP位点，其使得两个寡核苷酸之间通过Cre重组酶能进行位点特异性重组，导致新寡核苷酸序列的形成，该新寡核苷酸序列包含侧接loxP位点的一种近端探针的5’部分和另一种近端探针的3’部分。新创建的靶序列随后可通过任何适宜的方法扩增、标记、任选地锚定和如上文描述的检测。图6(a)例示了该实施方案，使用T7RNA聚合酶启动子作为用于扩增的可操作元件。还应理解其他RNA聚合酶位点如在近端探针的3或5’部分的任一处连接的T3和SP6也同样适用于该方法。在该实施方案中，loxP(重组)位点优选修饰为非对称的，从而产生朝向期望的重组产物形成的正常平衡中的迁移。如图6(b)中显示的，该方法还可用于生成可在RCA中使用的环状DNA模板。本发明包括用于检测分析物的方法，包括使分析物结合表面上的捕捉试剂和两种检测试剂以形成检测复合物。该方法包括测量检测复合物，其中相对于仅包含两种检测试剂之一的复合物，测量方法优先测量包含两种检测试剂的复合物。在一个实施方案中，该方法包括形成复合物，然后交联检测试剂并检测交联的试剂。可以使用任何适宜的交联化学来连接检测复合物的组分。例如，第一和第二检测试剂可以包含反应模块，其通过添加连接反应模块的多功能交联剂反应和连接。在该实施方案中，反应模块和交联剂可包含胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺(iodoacetamide)、马来酰亚胺、点击化学试剂及其组合。在另一个实施方案中，第一和第二检测试剂可以包含结合模块且交联剂是该结合模块的多价结合伴侣。该实施方案的几个非限制性例子包括：(a)第一和第二检测试剂是动物物种的抗体且交联剂是靶向该动物物种抗体的多价抗物种抗体；(b)第一和第二检测试剂包含生物素且交联剂是链霉亲合素(或反之)；(c)第一和第二检测试剂连接于链霉亲合素且交联剂是包含多个生物素分子的聚合物(或反之)；或(d)第一和第二检测试剂分别包含第一和第二核酸探针且交联剂是寡核苷酸，其包含互补于第一核酸探针的序列和互补于第二核酸探针的另一个序列。在一个具体的实施方案中，可通过使分析物结合固定化的捕捉试剂、第一检测试剂和第二检测试剂以形成复合物来检测样品中的目的分析物，其中所述第一检测试剂包含第一可检测的标记和第一核酸探针，和第二检测试剂包含第二可检测的标记和第二核酸探针。在该实施方案中，第一和第二检测试剂通过以下交联：(i)将第一探针杂交于第二探针，(ii)将第一和第二探针杂交于具有互补于第一和第二探针的区域的第三核酸，或(iii)连接第一和第二探针。一旦交联的产物结合表面就可检测该产物，或任选地，交联的产物可从表面释放到洗脱物中并检测。在此方面，仅计算洗脱物中包含第一和第二可检测的标记两者的那些各个交联的产物。可以采用任何适宜的检测方法来检测洗脱物中标记物的存在。在一个优选的实施方案中，标记物是荧光分子且通过单分子荧光检测，例如荧光相关光谱和/或荧光交互相关光谱，来计算存在于洗脱物中的经标记的交联产物。在该实施方案中，单分子荧光检测包括使洗脱物流经毛细管，将光源聚焦在毛细管内的某体积上以创建探询带(interrogationzone)，并用光检测器观察探询带以检测荧光分子经由探询带的通过。该检测方法可进一步包括检测与第一标记物有关的第一荧光信号和与第二标记物有关的第二荧光信号，并且当从探询带检测出两种信号时对检测事件计数。或者，一种标记物是荧光共振能量转移(FRET)供体而另一种标记物是FRET接受体，且检测方法可进一步包括激发探询带中的FRET供体并检测来自FRET接受体的荧光信号。在一个具体的实施方案中，可通过使分析物结合固定化的捕捉试剂、第一检测试剂和第二检测试剂以形成复合物来检测样品中的分析物，其中所述第一检测试剂包含第一核酸探针，第二检测试剂包含第二核酸探针；延伸第二核酸探针以形成包含可检测的标记的延伸序列，所述延伸依赖于第一和第二核酸探针在复合物中的共定位；从表面释放延伸序列至洗脱物中；并计算洗脱物中的各个延伸序列。延伸步骤可包括使探针结合模板核酸序列并通过聚合酶链式反应延伸探针。或者，延伸步骤包括使第一探针结合模板核酸序列，形成环状核酸模板，并通过滚环扩增延伸该环状模板。延伸步骤还可以包括使第一探针结合模板核酸序列，使第二探针结合该模板序列，并连接第一和第二探针。在采用捕捉试剂的本发明的方法中，捕捉试剂可以直接固定化于固相上或它们可以经由次级结合试剂如下文描述的靶向性试剂间接固定化。例如，捕捉试剂可以连接于或包含靶向性试剂，其结合固相上固定化的靶向性试剂互补体。靶向性试剂对其互补体的结合可以是直接的(例如，靶向性试剂可为链霉亲合素而互补体可为生物素)，或者是经由桥接试剂为间接的(例如靶向性试剂和互补体可为生物素，而桥接试剂可以是多价生物素结合受体如链霉亲合素)。在一个实施方案中，靶向性试剂及其互补体包括第一寡核苷酸和互补性寡核苷酸、受体-配体对、抗原-抗体对、半抗原-抗体对、表位-抗体对、模拟位-抗体对、适体-靶分子对、杂交配偶、或嵌入剂-靶分子对。测定中使用的靶向性试剂和互补体选择为使得与通过测定测量的一种分析物的捕捉或检测试剂联合的靶向性试剂和互补体与通过测定测量的其他分析物的捕捉或检测试剂联合的靶向性试剂和互补体基本是非交叉反应性的。例如，结合试剂对其联合的结合域的结合(经由其联合的靶向性试剂和靶向性试剂互补体)应实质性大于其对与其他分析物联合的结合域(且呈现不同的靶向性试剂互补体)的结合。优选地，一种分析物的捕捉或检测试剂对与其他分析物有关的结合域的结合相对于对正确结合域的结合的交叉反应性为<1％，更优选<0.1％且更优选<0.01％。在一个优选的实施方案中，所述靶向性试剂/靶向性试剂互补体包含包括互补性序列的一对寡核苷酸且靶向性试剂及其互补体在足以使靶向性试剂杂交于其互补体的条件下接触。当使用靶向性试剂时，就何时将测定法中使用的捕捉试剂固定化于固相上而言有一定灵活性。在一个实施方案中，对使用者提供经由靶向性试剂–靶向性试剂互补体相互作用预固定化于固相上的捕捉试剂。在另一个实施方案中，以分开的组分提供连接于靶向性试剂的捕捉试剂和支持固定化的靶向性试剂互补体的固相。因此，测定方法进一步包括通过使靶向性试剂结合其互补体(直接或经由桥接剂的使用)将捕捉试剂固定化于固相上的步骤。该步骤与形成检测复合物有关的步骤可在前、同时或在后实施。在一个具体实施方案中，多功能靶向剂可用于本文所述的测定方法和组分中。多功能靶向剂可以包括(a)设计成通过第一区段互补体与捕获试剂结合的第一区段(即，捕获试剂包括靶向剂互补体，该互补体与多功能靶向剂的第一区段互补)，和(b)设计成结合扩增子的第二区段(即，多功能靶向剂的第二区段，其用作表面上的锚定试剂)。因此，在该实施方案中，表面包括多功能靶向剂，其与通过第一区段和第一区段互补体之间的连接结合到靶向剂的捕获试剂接触。3-ABRCA/PLA测定如本文所述进行，并且在测量步骤之前扩增子结合多功能靶向剂的锚定区段。该方法可用于确保在测定方法中使用1:1比例的捕获剂与锚定试剂。很多种表面适用于本发明的方法，包括结合测定领域中的常规表面。表面可从多种不同材料制备，包括聚合物(例如聚苯乙烯和聚丙烯)、陶瓷、玻璃、复合材料(例如碳聚合物复合材料如基于碳的墨)。合适的表面包括肉眼可见(macroscopic)物体的表面如测定容器(例如试管、小池、流动池、FACS细胞分选器、筒(cartridge)、多孔板中的孔等)的内部表面，载玻片，测定芯片(如在基因或蛋白质芯片测量中使用的那些)、针(pin)或探针、珠、过滤介质、侧向流动介质(例如侧向流动测试条中使用的过滤膜)等。适宜的表面还包括通常用于基于颗粒的其他类型测定法中的颗粒(包括但不限于胶体或珠)，例如磁性、聚丙烯和胶乳颗粒，通常用于固相合成中的材料例如聚苯乙烯和聚丙烯酰胺颗粒，和通常用于层析应用中的材料例如硅土、铝、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯。材料还可以是纤维如碳纤丝。微颗粒可以是无生命的或者，可以包含有生命的生物实体如细胞、病毒、细菌等。用于所述方法的颗粒可由适用于附接一种或多种捕捉或检测试剂的任意材料构成，且其可经由例如离心、重力、过滤或磁性收集来收集。可附接于捕捉或检测试剂的很多种不同类型的颗粒是商品化的以用于结合测定法中。这些包括非磁性颗粒以及包含可磁化材料的颗粒，其允许用磁场收集颗粒。在一个实施方案中，颗粒由电导性和/或半导体材料构成，例如胶体金颗粒。微颗粒可以具有很多种大小和形状。例如且不限于，微颗粒可以为5纳米至100纳米。优选地，微颗粒具有20nm至10微米的材料。颗粒可以是球形、长方形、杆状等，或者其可以是形状不规则的。用于所述方法的颗粒可以是带编码的，以允许在颗粒混合物中鉴定特定颗粒或颗粒子群体。这类编码颗粒的使用已被用于实现采用颗粒作为固相支持物进行结合测定的测定法的多重化(multiplexing)。在一个办法中，制造颗粒以纳入一种或多种荧光染料并基于在一个或多个波长处荧光发射的强度和/或相对强度来鉴定特定的颗粒群体。该办法已用在LuminexxMAP系统(参见例如美国专利No.6,939,720)和BectonDickinsonCytometricBeadArray系统中。或者，颗粒可经由其他物理特性如大小、形状、包埋的光学模式等中的差异编码。通过颗粒光学特性、大小、形状、包埋的光学模式等，可以编码混合物或颗粒集合中提供的一种或多种颗粒以与混合物中的其他颗粒区分。在一个具体的实施方案中，本发明的方法可用在多重形式中，其通过使多种不同的分析物结合多种针对那些分析物的捕捉试剂，捕捉分析物固定化于编码的珠上，从而使得该编码鉴定特定珠的捕捉试剂(和分析物靶物)。该方法进一步包括对具有结合的分析物的珠的数目计数(使用本文中描述的检测办法)。或者/另外，检测复合物和/或捕捉试剂可以直接或间接结合一种或多种固相上的不同的离散的结合域，例如如在结合阵列中，其中所述结合域是各个阵列元件，或者在一组珠中，其中所述结合域是各个珠，从而使得在每个结合域上生成并从其测量离散的测定信号。如果针对不同分析物的捕捉试剂固定化于不同的结合域中，则可以独立测量结合那些域的不同分析物。在这类实施方案的一个例子中，通过在一种或多种表面上固定化结合目的分析物的捕捉试剂的离散域来制备结合域。任选地，所述一种或多种表面可以部分限定保持样品或样品经由其通过的容器(例如流动池、孔、小池等)的一个或多个边界。在一个优选的实施方案中，在电极上形成各个结合域用于电化学或电化学发光测定法中。使用电化学发光在包含多个结合域的表面上对分析物的多重测量已用在MesoScaleDiagnostics,LLC,MULTI-和Imager产品线(参见例如美国专利Nos.7,842,246和6,977,722，其公开内容通过提述完整并入本文)。更进一步地，检测复合物和/或捕捉试剂可直接或间接结合于电极表面，其任选地包含如上文描述的不同的离散的结合域。电极表面可以是多孔壁和/或流动池的组分。电极可包含电导材料，例如金属如金、银、铂、镍、钢、铱、铜、铝、允许导电物(conductiveallow)，等等。它们还可以包含涂布氧化物的金属，例如氧化铝涂布的铝。电极可包括工作电极和对应电极，其可从相同或不同材料制备，例如金属对应电极和碳工作电极。在一个具体的实施方案中，电极包含基于碳的材料如碳、碳黑、石墨碳、碳纳米管、碳纤丝、石墨、石墨烯、碳纤维和其混合物。在一个实施方案中，电极包含元素碳，例如石墨、碳黑、碳纳米管等。有利的是，它们可以包含导电性碳聚合物复合材料、分散在基质中的导电颗粒(例如碳墨、碳胶、金属墨、石墨烯墨(grapheneink))，和/或导电性聚合物。本发明的一个具体的实施方案是测定模块，优选为多孔板，其具有包含碳的电极(例如工作和/或对应电极)，例如碳层和/或丝网印刷的碳墨层。本发明包括用于检测和计算各个检测复合物的方法。在一个具体的实施方案中，表面可包含针对存在于样品中的一种或多种分析物的多种捕捉试剂，且多种捕捉试剂分布跨越在位于表面上的多个可解析的结合区域中。在用于实施和分析测量的条件下，“可解析的结合区域”是与单个结合事件有关的最小表面区域，其能够被解析和与发生另外的单个结合事件的另一区域区分开来。因此，所述方法包括使一种或多种分析物分子与表面上的一种或多种捕捉试剂结合，测定分析物分子在表面上的多个可解析结合区域中的存在或缺乏，并鉴定含有分析物分子的可解析结合区域的数目和/或不含分析物分子的分析物域的数目。可解析结合区域可以全部或部分地进行光学探询，即每个可解析结合区域可分别地光学探询和/或包含多个可解析结合区域的整个表面可以成像且可将该图像内的一个或多个像素或像素分组图谱定位(mapped)到各个可解析结合区域。可解析结合区域还可以是多个微颗粒内的微颗粒。可以通过常规的光学检测系统来鉴定在其光学签名(signature)中显示变化的可解析结合区域。根据检测的种类(例如荧光实体的类型等)和操作波长，可以采用设计用于特定波长的光纤来进行可解析结合区域的光学探询。在其中使用光学探询的实施方案中，系统可包含超过一种光源和/或多种光纤以调整波长和/或光源的强度。在一些实施方案中，使用CCD照相机捕捉来自多个可解析结合区域的光信号。可用于捕捉图像的照相机成像系统的其他非限制性例子包括，电荷注入器件(CID)、互补金属氧化物半导体(CMOS)器件、科学CMOS(sCMOS)器件和延时探询(timedelayintegration)(TDI)器件，如本领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，可将与光电二极管或光电倍增管(PMT)偶联的扫描镜像系统用于成像。所述方法的测量步骤可包括对来自表面(或其部分)的光信号成像以生成由多个像素组成的图像，其中每个可解析结合区域图谱定位至图像中的一个或多个像素或像素组。可以使用本领域认可的方法完成图像分析以鉴定具有指示结合事件(检测复合物)的信号的像素或像素集合，所述方法例如存在的大量图像分析算法和软件以鉴定和计算荧光显微镜图像中经标记的生物结构。在一个实施方案中，在过滤图像以除去大规模信号梯度后，使用分割阈值将图像转化为二进制图像。通过鉴定具有高于阈值强度的连续区域来发现可解析结合区域。如果结合域满足大小和强度要求，则将其归类为结合事件。在一个实施方案中，可解析结合区域是阵列的元件。在一个优选的实施方案中，阵列是微孔或纳米孔的阵列，例如具有单一基底的各个凹坑或孔(individualdepressionsorwellsofaunitarysubstrate)。优选地，孔的体积低于100nL，优选低于50nL。在一个实施方案中，孔体积的范围为约10aL–100pL。任选地，孔可以配置为存放微颗粒。在一个实施方案中，位于基底上且在测定期间寻址的可解析结合区域的至少50％含有0或1个分析物分子。优选地，至少80％，更优选至少95％，且最优选至少99％的可解析结合区域含有0或更多分析物分子。样品中分析物分子的浓度至少部分使用校正曲线测定，泊松分布分析和/或高斯分布分析含有至少0或1个分析物分子的结合区域的数目。在一个具体的实施方案中，表面包含多个颗粒，其各自包含针对分析物分子的多种捕捉试剂，且多种颗粒分布跨越在多个可解析结合区域(例如微孔或纳米孔的阵列)。因此，所述方法包括：(i)使一种或多种分析物分子与表面上的一种或多种捕捉试剂结合，(ii)将多种颗粒分布跨越在可解析结合区域的阵列上；和(iii)测定每个可解析结合区域中分析物分子的存在或缺乏，从而鉴定含有分析物分子的结合域的数目和/或不含有分析物分子的结合域的数目。使用本发明的一种或多种方法检测在受限体积中的分析物也可以是有利的。在这些实施方案中，样品中的分析物分子结合一对检测试剂，其各自携带可区分的标记物，且分析物在基底(例如板、皿、芯片、光纤，网格等)上的多个位置，例如孔或反应容器(本文中称为“反应容器”)上划分开，从而大多数反应容器含有一个或更少的分析物。该方法允许使用者通过对含有附接于分析物的每种可区分标记物的反应容器的数目计数来检测分析物分子。在一些情况中，寻址(address)的多个反应容器是可能含有至少1个分析物分子(比如与至少一个分析物分子联合或不与任何分析物分子联合)的反应容器总量的一部分或基本全部。提及以下公布的美国专利申请：美国专利申请No.20070259448；美国专利申请No.20070259385；美国专利申请No.20070259381；和国际专利申请No.PCT/US07/019184；和国际专利申请No.PCT/US09/005428。通过提述将这些公布内容的每一个并入本文。至少一部分的反应容器可以寻址且可以进行指示含有至少一个分析物分子或颗粒的反应容器的数目/百分比的测量。在一些情况中，基于数目/百分比，可以测定流体样品中分析物分子浓度的量度。在实现受限体积中分析物分子检测的一个具体的实施方案，可通过使分析物结合第一和第二检测试剂以形成检测复合物来检测样品中的分析物。每种检测复合物包含分析物、第一检测试剂和第二检测试剂，且第一检测试剂和第二检测试剂分别具有第一和第二可检测的标记。检测复合物可以同时、基本同时或序贯形成。检测复合物跨多个反应容器划分从而使得多数反应容器含有一个或更少的检测复合物，且通过计算含有第一和第二可检测的标记的每种的反应容器的数目来检测分析物分子的数目。优选地，检测复合物跨多个反应容器划分，从而使得在同一容器中检测未结合的第一检测试剂和未结合的第二检测试剂的可能性低于约十分之一，优选低于约百分之一，更优选低于约千分之一，且最优选低于约万分之一。检测复合物跨多个反应容器划分，即分成或分到部分中，例如通过在多个反应容器中等分检测复合物的部分手动分开，和/或通过使包含检测复合物的溶液流过多个反应容器，从而使得检测复合物分到支持物上的各反应容器中。在一个别的实施方案中，可通过以下检测样品中的分析物：(a)使分析物结合表面结合的捕捉试剂和第一和第二检测试剂以形成检测复合物，其中(i)每种检测复合物包含捕捉试剂、分析物、第一检测试剂和第二检测试剂，和(ii)第一检测试剂具有第一可检测的标记物且第二检测试剂具有第二可检测的标记物。检测复合物可通过以任意次序添加组分形成，例如通过同时或基本同时使组分接近到一起，或序贯添加每种组分以逐步方式建立检测复合物。检测复合物跨多个反应容器划分，从而使得多数反应容器含有一个或更少的分析物，且通过对含有第一和第二可检测的标记物的反应容器的数目计数来检测分析物分子的数目。该方法可在每个步骤后和检测步骤之前有或无清洗的情况下进行。表面可以是颗粒和任选地，多种捕捉试剂固定化于颗粒或多个颗粒上。在该实施方案中，划分步骤可以多种方式进行：(i)捕捉试剂固定化于多个颗粒上且通过使分析物结合捕捉试剂和将颗粒划分到多个反应容器中来实现分析物的划分；或(ii)捕捉试剂固定化于多个颗粒上且通过将颗粒划分到多个反应容器中然后使分析物结合捕捉试剂来实现分析物的划分。多个反应容器还可以包含分散在油包水乳液中的水滴。乳液可制备为具有直径高达100um和体积近1nL的液滴。高负载，即乳液中超过1010个液滴，制备乳液的容易性和其在大范围条件下的高稳定性使得其成为区室化生物化学测定法的理想手段。每个水滴充当独立的反应容器且任选地附接于颗粒的检测复合物可以跨多个水滴划分。或者，例如如果反应容器是板的孔的话，表面位于反应容器之一中，然后表面可以是板孔之一内的域或区域。在该实施方案中，捕捉试剂可固定化于多个反应容器的域或区域上，且划分步骤通过使分析物分子结合捕捉试剂实现。在另一个实施方案中，多个反应容器包含对其固定化有靶向性模块的区域，捕捉试剂包含靶向性模块互补体，且划分步骤通过使靶向性模块互补体结合位于多个反应容器中的靶向模块来实现。在一个另外的或替代的实施方案中，本文中描述的结合测定法还可以包含预浓缩步骤以改进测定性能，例如通过增加样品中分析物的浓度和/或通过降低可能存在于样品中的可能阻碍测定性能的无关材料的浓度。这可以通过(a)使包含目的分析物的样品与连接于结合分析物的第一结合试剂的颗粒接触，由此形成包含结合于所述第一结合试剂的分析物的复合物；(b)收集该复合物；(c)将样品未结合组分从复合物分开；(d)释放该复合物来完成。这种预浓缩方法可在本文中描述的结合测定法之前进行以除去可能阻碍测定性能的杂质。在此方面，提述美国申请公开No.US2010/0261292，其公开内容通过提述并入本文。具体地，浓缩步骤包括使包含分析物的样品经受足以形成分析物复合物的条件，所述分析物复合物包括结合至第一检测试剂的分析物，其中第一检测试剂连接至第一核酸探针。然后，将在浓缩步骤结束时形成的分析物复合物结合到(i)表面上的捕获试剂，所述表面包含用于分析物的捕获试剂，和包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；和(ii)与第二核酸探针连接的用于分析物的第二检测试剂；从而在表面上形成包含捕获试剂、分析物以及第一和第二检测试剂的复合物。使表面结合的复合物进行需要第一和第二探针接近的延伸过程，延伸第二探针以形成包含与锚定序列互补的锚定序列互补体的延伸序列。在一个具体的实施方案中，浓缩步骤进一步包括：(i)将包含所述分析物的样品与连接至靶向剂的固相接触，所述靶向剂与第一核酸探针的至少一部分互补，从而形成浓缩复合物，所述浓缩复合物包含通过第一核酸探针和靶向剂间的结合反应结合到固相的分析物。(ii)收集所述浓缩复合物；(iii)从所述浓缩复合物中分离样品的未结合的组分；和(iv)释放浓缩复合物以将固相与分析物分离以形成分析物复合物。如本文所使用的，收集是指混合物中材料的物理定位。收集包括通过结合反应或吸附的材料的定位。例如，可以通过将材料吸附在固相上或通过将材料与固相上的结合试剂结合，在固相上收集混合物中的材料。然而，收集不限于定位在固相上，并且还可以包括本领域中用于将材料定位在较大流体体积内的位置/体积处的技术，例如通过使用光学镊子(opticaltweezers)(其使用光来操纵小至单个原子的微观对象，其中来自聚焦激光束的辐射压力能够捕获小颗粒)、电场或磁场、聚集流(focusedflow)、密度梯度离心等来定位材料。本发明的某些实施方案包括收集微粒或结合到微粒的材料。合适的收集方法包括实现从悬浮液中定位微粒的基于微粒的测定的领域中已知的许多方法。这些方法包括在重力下或通过离心沉淀，在过滤器或多孔膜上过滤、通过施加磁场定位(可磁化颗粒)、将颗粒结合或吸附到宏观固相、使用光学镊子等。如本文所用，释放是指先前收集的材料的去定位(delocalization)。通过化学键或通过特异性或非特异性结合相互作用保持在定位位置的材料可以允许通过破坏键或相互作用而去定位，使得材料可扩散或混合到周围介质中。存在许多成熟的可裂解化学连接子，其可以用于提供可以在不需要苛刻条件的情况下裂解的共价键。例如，可以使用硫醇或其它还原剂裂解含二硫键的连接子，可以使用高碘酸盐裂解包含顺-二醇的连接子，可以通过改变pH或引入竞争性配体来裂解金属-配体相互作用(例如镍-组氨酸)。类似地，存在可以使用的许多成熟的可逆结合对(包括已经在亲和层析领域中鉴定的那些)。举例来说，许多抗体-配体对的结合可以通过pH的变化、添加蛋白质变性剂或离液剂、添加竞争性配体等来逆转。其他合适的可逆结合对包括互补核酸序列，其杂交可以在多种条件下逆转，包括改变pH、降低盐浓度、增加温度至高于所述对(pair)的解链温度和/或添加核酸变性剂(例如甲酰胺)。此类可逆结合对可以用作靶向剂(如上所述)，例如，可以将第一靶向剂连接到结合分析物的第一结合试剂，第二靶向剂可以连接到固相，且第一和第二靶向剂的结合相互作用可以用于将第一结合试剂可逆地固定化在固相上。释放还包括通过例如混合、震荡、涡旋、对流流体流动、通过施加磁力、电力或光学力混合等的材料的物理去定位。在已经收集微粒或结合到微粒的材料的情况下，可以使用此类物理方法将颗粒重悬在周围基质中。释放可以简单地与先前收集步骤(例如，通过上述任何机制)相反，或者收集和释放可以通过两种不同的机制进行。在一个此类实例中，结合到颗粒的材料(例如分析物或包含分析物的复合物)的收集可以通过颗粒的物理收集来实现。然后通过切割键或逆转将材料保持颗粒上的结合反应来释放材料。在第二个此类实例中，通过与连接到表面的结合试剂的结合相互作用，将材料(例如包含分析物的复合物的分析物)收集在表面上。然后通过破坏键或将结合试剂连接至表面的第二结合相互作用释放材料。收集接着释放可被用于浓缩和/或纯化样品中的分析物。通过在第一体积中收集并释放到第二较小体积中，可以浓缩样品中的分析物。通过浓缩，通常可以显著提高后续测量步骤的灵敏度。通过从样品中收集并除去一些或全部未收集的样品，可以减少或消除样品中的潜在测定干扰物。任选地，未结合的样品的除去可以包括用液体试剂洗涤并将材料释放到限定的液体试剂种(例如，测定或洗涤缓冲液)，以便为随后的测定步骤提供均匀的基质。如US2010/0261292的图3(a)中所示，其通过引用并入本文，该方法包括将包含靶分析物的样品与连接到第一结合试剂的颗粒接触，所述第一结合试剂结合靶分析物，其中所述第一结合试剂连接到第一靶向剂，且所述颗粒连接到第二靶向剂，且第一结合试剂和颗粒通过所述第一和第二靶向剂之间的结合反应连接以形成包含结合到所述第一结合试剂的靶分析物的复合物。然后收集复合物，并将从复合物分离样品中的未结合组分。释放复合物，并将释放的复合物与结合到固相的第二结合试剂接触，其中第二结合试剂结合复合物。该具体的实施方案如图16所示。修饰颗粒(1601)以包括捕获寡核苷酸序列，1602，其与近端探针的序列，1603，至少部分互补，其结合到检测抗体1604。所述颗粒与近端探针混合以将捕获序列与探针序列杂交以形成复合物，1605。然后复合物与包含分析物，1606，且任选地，一种或多种污染物，1607-1608的样品混合。将分析物结合到检测抗体(1609)并去除污染物(1610)。在合适的条件下从包括结合的分析物的复合物中除去颗粒，以形成与近端探针(1611)结合的浓缩的分析物溶液，其可如本文所述在免疫测定中使用，其中另外的近端探针结合到分析物，并将3-抗体复合物进行RCA-PLA以检测样品中分析物的存在(1612)，例如，如图2(a)和所附说明所述。在另一个实施方案中，检测抗体和分析物之间的免疫测定复合物在溶液中形成，之后扩增，且然后扩增产物通过捕获试剂和/或锚定物粘附在颗粒上。任选地，可以过滤扩增的产物和然后通过捕获试剂和/或锚定物将其捕获在颗粒上。这一方法示于图17中。将分析物，A(1701)结合到检测抗体(分别为1702和1703)，其每一个结合到近端探针(分别为1704和1705)和形成包含结合到每个检测抗体的分析物的检测复合物(1706)。将所述检测复合物与两个连接子序列(1707a和1707b)接触，所述连接子序列的每一个包括与第一近端探针的非重叠区互补的末端序列以及与第二近端探针的非重叠区互补的末端序列。将所述连接子序列与第一和第二近端探针杂交，并连接(ligate)连接子寡核苷酸的末端序列以形成与第一和第二近端探针两者杂交的环形靶序列(1708)。通过滚环杂交延伸第二近端探针以产生包含与锚定试剂互补的结合试剂的扩增子。将所述扩增子与包括捕获试剂(1710)和锚定试剂(1711)的表面(1709)接触，且通过使用多个标记的探针(1712)标记来测量结合到表面上的扩增子的量。另外，本文描述的方法可用于寡聚体分析物的检测和定量。如果靶抗原是均一寡聚体(homo-oligomer)，即具有两个或多个相同亚基的抗原，则检测抗体需要用连接模板寡核苷酸(ligationtemplatingoligonucleotide)和引物寡核苷酸两者独立地标记。这可能导致低效率，因为仅具有模板寡核苷酸的两种抗体或仅具有引发(priming)寡核苷酸的两种抗体可以结合，并且这种非生产性(nonproductive)复合物可以降低该方法的灵敏度。当该方法应用于特异性寡聚结构的检测时，这个问题可能加剧，其中使用另外的特异性模板寡核苷酸以允许寡聚体的特异性检测。因此，本文所述的方法可以包括一组检测抗体的预形成，所述检测抗体被配置为有效地结合所需的低聚物分析物以及用于形成滚环模板的模板。这可以使用另外的寡核苷酸序列，例如支架寡核苷酸来实现，所述寡核苷酸序列可以与抗体偶联的寡核苷酸特异性杂交，使得抗体以寡聚体的形式被配制于检测抗体混合物中，与靶抗原寡聚体配对(match)。这一预组织步骤允许检测抗体与靶寡聚体的最佳结合。在检测抗体与寡聚物抗原结合之后，可以通过外切核酸酶降解或另一种合适的化学方法或核酸内切酶处理去除支架寡核苷酸。一旦除去支架寡核苷酸，可如本文所述进行接近连接滚环扩增测定。在另外的实施方案中，本文所述的测定形式还包括一种或多种对照测定。可以在结合域上包括阴性对照，其包括不具有相应检测抗体的捕获抗体，从而为所有样品提供一致的背景信号。高于预设阈值的信号的测量可以指示不适当的测定处理或存在导致标记的检测探针的非特异性结合的样品依赖性基质效应。此外，在人靶抗原(例如分泌的或胞内蛋白质)的测定中也可以包括样品样本，其用于进行多重对照功能。阳性信号将指示存在人类材料，因此测试样品添加和质量。人抗原还可以作为细菌抗原提取的过程对照。例如，可以选择细胞内人分析物作为样本，其也需要裂解和提取以进行检测，例如Akt。低于预定阈值的信号的测量将表明没有添加样品，表明试剂或处理的失败发生，或表明存在干扰扩增或检测的物质。除了内部对照外，外部阳性和阴性对照也可以与方法和/或试剂盒一起使用。阳性对照可包含非感染性细菌提取物的混合物，所述组合物代表通过多重组(multiplexedpanel)所检测的所有特异性靶抗原，提供了测试时所有测定的阳性信号。阴性对照包括不含任何靶蛋白的代表性基质。可通过本发明的方法分析的样品的例子包括但不限于，食物样品(包括食物提取物、食物匀浆物、饮料等)、环境样品(例如油样品、环境淤渣(sludges)、收集的环境浮质(aerosol)、环境拭擦物(wipes)、水过滤物等)、工业样品(例如起始材料、来自工业生产过程的产物或中间物)、人临床样品、兽医样品和其他具有生物起源的样品。可分析的生物样品包括但不限于，粪、粘膜拭样(swab)、生理学样品和/或含有细胞悬液的样品。生物样品的特定例子包括血液、血清、血浆、粪、粘膜拭样、组织抽吸物、组织匀浆物、细胞培养物和细胞培养上清(包括真核和原核细胞的培养物)、尿、唾液、痰和脑脊髓样品。可使用本发明的方法测量的分析物包括但不限于，蛋白质、毒素、核酸、微生物、病毒、细胞、真菌、孢子、糖类、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、药物、激素、类固醇、营养物、代谢物和上述分子的任何经修饰的衍生物，或包含一种或多种上述分子或其组合的任意复合物。样品中目的分析物的水平可以指示疾病或疾病状况，或者其可以简单地指示患者是否暴露于该分析物。在一个具体的实施方案中，感兴趣的分析物是外来体，即，由大多数细胞类型释放的小膜囊泡。外来体的释放和随后的摄取是细胞与细胞间通信的方法并在许多生理和病理过程的调节中具有作用。外来体已经显示含有多种的信号分子，包括但不限于表面结合的和胞质蛋白、脂质、mRNA和miRNA，并且已经表明可以使用每种外来体中这些物质的特性和浓度以推断其细胞起源和功能。因此，患者的总外来体群体的基因组或蛋白质组图谱可以为各种病理状况提供有价值的预后信息，包括癌症、感染性疾病、肾脏和肝脏疾病，以及创伤性脑损伤等。通常在聚集体(aggregate)中测量外来体，其是通过从生物流体中分离大量的聚集体，破碎它们的膜，并通过常规方法，例如western印迹、PCR或测序来测定内含物(contents)的方式测量的。然而，本发明的方法和试剂盒可用于通过在表面上捕获外来体以及随后检测由外来体表达的靶分子来表征外来体。已经鉴定了在大多数外来体中共有的几种蛋白质，例如CD9、CD63、CD81、Hsp70、PDCD6IP、Tsg101，并且在一个实施方案中，可以单个使用或组合使用这些靶标以通过一种或多种捕获试剂与一种或多种共有的外来体靶蛋白之间的结合相互作用来在表面上捕获外来体。在替代的或另外的实施方案中，存在于外来体上或之中的疾病相关标志物被用于通过一种或多种捕获试剂和疾病相关的外来体标志物之间的结合相互作用来在表面上捕获外来体。然后可以使用一种或多种检测试剂探测捕获的外来体，所述检测试剂针对一种或多种共有外来体蛋白质，或存在于外来体的一些部分的表面内或表面上的一种或多种另外的分子靶标。当选择捕获和检测试剂的不同靶标时，将仅检测包含两种靶标的那些外来体，从而在鉴定或定量外来体亚群中具有另外的特异性。在一个具体的实施方案中，使用的样品是纯化的外来体制备物。在一个具体的实施方案中，可以使用一对检测试剂来实现特定的表型不同的外来体亚群的检测，所述检测试剂仅当如本文所述的通过与接近的靶标(proximaltargets)的结合相互作用而接近时才产生信号。在本实施方案中，所述接近的靶标可以是相同分子上的不同表位，它们可以是在单个外来体内部或结合在相同外来体膜中的接近的相同分子种类的不同拷贝，或者它们可以是在单个外来体中或之上的不同的相互作用种类，例如两个相互作用的蛋白(例如四丝氨酸-整联蛋白复合物)、蛋白受体和配体(如EFG和EGFR)，或mRNA分子和RNA结合蛋白(如Argonaute1-4或GW182)。另外，使用本文所述的方法允许分析多达三种不同的靶分子，这些靶分子可以不是功能性相连的，而是通过存在于单个外来体内而连接。可以延长在本文所述的PLA/RCA方法中使用的近端探针，以允许连接和随后扩增在外来体上或其中离得更远的靶分子。在一个实施方案中，使用用于扩增子的特异性荧光探针进行PLA/RCA测定。此后，使用通用的荧光试剂(例如用于外来体中的RNA的吖啶橙)来标记捕获的外来体，并对捕获外来体成像以确定两种荧光标记(fluorescentsignatures)之间的相关性。通用荧光试剂的使用允许基于尺寸和染色强度的从期望的外来体或其子集中选择信号。为了探测内部靶分子(载体蛋白、脂质或RNA分子)，可以在捕获之前或之后但在添加检测试剂之前固定和通透(permeablized)外来体。如果使用本文所述的方法探寻(interrogate)经通透的外来体，则检测试剂的一种或两种可以包含能够结合特定RNA的寡核苷酸探针，使得能够检测mRNA、miRNA和/或蛋白质和RNA之间的相互作用。可使用本文所述方法使用或不适用锚定试剂来测量外来体。如前所述，结合测定中锚定试剂的使用示于图1(a)中，且如果分析物是外来体，则表面(101)包括捕获试剂，如针对共有外来体的靶蛋白的捕获试剂。在一个具体的实施方案中，表面还包括锚定试剂(103)。在一个或多个步骤中，将外来体结合到捕获试剂和检测试剂(104)，所述检测试剂通过相同或不同的外来体靶蛋白也结合外来体，其中检测试剂连接到核酸探针(105)。因此，在表面上形成的包括捕获试剂、外来体和检测试剂的复合物。延伸探针以形成包括结合锚定试剂的锚定区的延伸序列(107)。所述延伸序列结合到锚定试剂，并测量结合到表面的延伸序列的量。同样，示于图1(b)中的方法也可用于外来体的检测。在一个具体的实施方案中，检测复合物可包括一种或多种检测试剂以增强外来体测定的特异性，例如，如图1(c)所示。在一个或多个步骤中，将外来体与捕获试剂和两个(或多个)检测试剂(分别为120和121)的每一个结合，其中所述检测试剂结合外来体表达的靶蛋白，其中第一和第二检测试剂中的每一个与核酸探针(122和123，分别为第一和第二核酸探针)连接。外来体可以同时或基本上同时或以序贯的，逐步的方式与捕获和检测试剂结合。因此，在表面上形成包括捕获试剂、外来体以及第一和第二检测试剂的复合物(124)。使用需要第一和第二探针彼此接近的延伸过程延伸第一探针以形成延伸序列(125)，所述延伸序列包含与锚定序列互补的锚定序列互补体。在倒数第二步中，将锚定序列与锚定序列互补体杂交并测量结合到表面的延伸序列的量。类似地，可以使用示于图2(a)-(c)每一个的方法检测外来体。本发明的测定法可用于测定样品中一种或多种，例如两种或更多种分析物的浓度。如此，可测量同一样品中两种或更多种分析物。可在同一样品中测量的分析物的组包括，例如与疾病状态或生理学状况有关的分析物或活性的测定的组。某些这类组包括细胞因子和/或其受体(例如TNF-alpha、TNF-beta、ILl-alpha、ILl-beta、IL2、IL4、IL6、IL-10、IL-12、IFN-y等的一种或多种)，生长因子和/或其受体(例如EGF、VGF、TGF、VEGF等的一种或多种)、滥用药物，治疗性药物，维生素，病原体特异性抗体，自身抗体(例如针对Sm、RNP、SS-A、SS-alpha、J0-1和Scl-70抗原的一种或多种抗体)，过敏原特异性抗体，肿瘤标志物(例如CEA、PSA、CA-125II、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CYFRA21-1、NSE、AFP等的一种或多种)，心脏病包括充血性心脏病和/或急性心肌梗塞的标志物(例如肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌钙蛋白C、肌红蛋白、CKMB、髓过氧物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、β-利尿钠蛋白(BNP)、alpha-利尿钠蛋白质(ANP)、内皮缩血管肽、醛固酮、C-反应性蛋白(CRP)等的一种或多种)，与止血有关的标志物(例如Fibrin单体、D-二聚体、凝血酶-抗凝血酶复合物、凝血酶原片段1&2、抗因子Xa等的一种或多种)，急性病毒性肝炎感染的标志物(例如针对甲肝病毒的IgM抗体，针对乙肝核心抗原的IgM抗体、乙肝表面抗原、针对丙肝病毒的抗体等的一种或多种)，阿耳茨海默病的标志物(alpha-淀粉样蛋白、beta-淀粉样蛋白、Aβ42、Aβ40、Aβ38、Aβ39、Aβ37、Aβ34、tau-蛋白质等)，骨质疏松症的标志物(例如交联的NorC-端肽(telopeptide)、总脱氧吡啶诺林(deoxypyridinoline)、游离脱氧吡啶诺林、成骨素(osteocalcin)、碱性磷酸酶、I型胶原的C-末端前肽、骨特异性碱性磷酸酶等的一种或多种)，生育状态或生育有关的病症的标志物(例如雌二醇、孕酮、促卵胞激素(FSH)、黄体化激素(LH)、促乳素、hCG、睾酮等的一种或多种)，甲状腺病症的标志物(例如促甲状腺激素(TSH)、总T3、游离T3、总T4、游离T4和逆T3的一种或多种)，和前列腺癌的标志物(例如总PSA、游离PSA、复合PSA、前列腺酸磷酸酶、肌酸激酶等的一种或多种)。本发明的某些实施方案包括测量例如与特定疾病状态或生理学状况有关的一种或多种，两种或更多中，四种或更多种或10种或更多种分析物(例如在组中分组到一起的分析物，如上文列出的那些；例如可用于诊断甲状腺病症的组可以包括例如促甲状腺激素(TSH)、总T3、游离T3、总T4、游离T4和逆T3的一种或多种)。在一个优选的实施方案中，所述组包括传统样品基质中的一种或多种低丰度分析物，例如浓度为低于约100fg/mL，且优选地低于约10fg/mL的分析物。可包括在组中的分析物的非限制性表包含，例如IL-17、IL-21、IL-31、Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Abeta寡聚体、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12/23p40、IL-12p70、INF-g、PSA、PSAc、Tau、磷酸-Tau、TNFa、肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、肌钙蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、清蛋白、CHO-P、大肠杆菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、剩余蛋白(residualprotein)A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、胱天蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-beta、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、beta-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、alpha-2巨球蛋白、D-二聚体、ICAM-1、髓过氧物酶、肌红蛋白、PAI-1、PCSK9、血纤维蛋白溶酶原、肾素/原肾素、tPA、CXCL1/GRO-alpha、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1alpha、CCL4/MIP-1beta、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-alpha、IFN-gamma、IL1alpha、IL-1beta、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL12(p70)、IL13、IL15、IL18、IL-22、IL-23、IL-33、c-MET、脂联素(adiponectin)、FGF21、TSLP、GLP-1、生长激素、IGF1、IGF2、胰岛素、瘦素(leptin)、促乳素、HIVp24、HB-EGF、AKT、磷酸-AKT，及其组合。在一个具体的实施方案中，所述组包含传统样品基质中的一种或多种低丰度分析物，例如浓度为低于约100fg/mL，且优选地低于约10fg/mL的分析物，且所述组包括下述人靶标的一种或多种：G-CDF、GM-CSF、IFNgamma、IL-1beta、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12/23p40、IL12p70、IL-17A、IL21、IL-22、IL-23、IL-31、IL-33、TNFalpha、TSLP、VEGF、复合PSA、游离PSA、Abeta42、Abeta40、Abeta38、tau、心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、HIVp24、C-肽，和/或FGF21。另外，本文中描述的方法和试剂盒可用于免疫测定以检测对抗微生物抗性标志物(PBP2a/mecA(金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性)、TEM1(大肠杆菌，革兰氏阴性)的单生物体敏感性。这些测定可用于在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌两者中的这类分析物。测定中可包括牵涉对万古霉素、beta-内酰胺、碳杂青霉烯(carbapenem)、氨基糖苷、和大环内酯抗生素的抗微生物抗性的一种或多种以下靶蛋白；erm家族、vanA、vanB、aac(6’)-aph(2”)、KPC、NDM、OXA-48、VIM、OXA-23样、OXA-40样、OXA-58样、CTX-M-1和CTX-M-9家族的ESBL基因，及其组合。另外，所述测定中可以包括一种或多种下述蛋白：50S核糖体蛋白L20、30S核糖体蛋白S7、30S核糖体蛋白S2、50S核糖体蛋白L21、50S核糖体蛋白L17、30S核糖体蛋白S4、50S核糖体蛋白L15、30S核糖体蛋白S5、50S核糖体蛋白L16、30S核糖体蛋白S3、50S核糖体蛋白L22、50S核糖体蛋白L4、核糖体蛋白L25、50S核糖体蛋白L5、30S核糖体蛋白S2、核糖体蛋白L30、L31和L32，及其组合。另外，可以单独或与本文鉴别的一种或多种标记物一同评价一种或多种下述靶，如延长分子EF-TU、ACP、酰基载体蛋白、RolL、核糖体蛋白GroS(MoB，65,000)、分子伴侣系统Gro-EL-Gro-ES和GapA的组分、糖酵解中的酶，及其组合。此外，本文所述的方法和试剂盒还可用于免疫测定以检测与健康保健相关的感染(HAI生物体)，包括但不限于克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、肠杆菌属(Enterobacter)物种。每种HAI生物体的抗性标记物提供在下表中：可以在本文所述的免疫测定中评估特定的外膜蛋白：此外，本文所述的方法和试剂盒可用于免疫测定中以检测一种或多种以下类别的生物标志物：细胞因子、循环肿瘤特异性蛋白(circulatingtumor-specificproteins)、与一种或多种感染性疾病相关的蛋白、细胞内标志物等，及其组合。更进一步地，可使用本文所述的方法和试剂盒通过评估以下列出的一种或多种相关抗原的存在或不存在来鉴定以下自身免疫性疾病：在具体的实施方案中，所述组包含传统样品基质中的一种或多种低丰度分析物，例如浓度为低于约100fg/mL，且优选地低于约10fg/mL的分析物。所述组优选地包含一种或多种以下分析物：IL-17、IL-21、IL-31、IL-22、IL-23、IL-33、心肌钙蛋白T、及其组合。在具体的实施方案中，在样品中检出的分析物的浓度在0.01fM至100fM、0.03fM–50fM、或0.03fM–10fM的范围内。在一些实施方案中，可以基本准确测定的样品中分析物分子的浓度是低于约100fM、低于约10fM、低于约3fM、低于约1fM、低于约0.3fM、低于约0.1fM、低于约0.03fM、或更低。样品中分析物分子的浓度可视为基本准确测定的，如果测量的样品中分析物分子的浓度在样品分析物分子的实际浓度的约20％内的话。在某些实施方案中，测量的样品中分析物分子的浓度可在样品分析物分子的实际浓度的约10％，约3％或约1％内。该测定的检测限是产生高于背景信号至少2.5标准差的信号的浓度，且优选地该测定可检测样品中约10-10,000个分子，或样品中100-5,000个分子，或样品中100-1000个分子。在一个别的实施方案中，本文描述的方法可用于检测由于最近暴露和/或感染处于低丰度的分析物。由于现有技术如ELISA的检测限(LOD)高于能指示疾病开始的低丰度蛋白质的循环浓度这一事实，对多种疾病或状况的早期诊断受到限制，所述疾病或状况例如癌症，细菌感染，例如炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)(炭疽)，病毒感染，例如HIV、肝炎、HPV等，毒素暴露，例如蓖麻毒蛋白、肉毒杆菌毒素A、B或E等。所述组可包含传统样品基质中的一种或多种低丰度分析物，例如浓度为低于约100fg/mL，且优选地低于约10fg/mL的分析物。可纳入组中的分析物的非限制性表包括，例如HIVgp41、HIVgp120、HIVgp160、HIVp24、HIVp66、HIVp51、HIVp17、HIVp31、Tat、Nef、Viv、肝炎A、B、C、D、或E抗原、HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和/或82、HPV-E6和E7蛋白、IL-17、IL-21、IL-31、IL-22、IL-23、IL-33、心肌钙蛋白T、及其组合。仍进一步地，该组还可包含一种或多种以下分析物，其由于最近疾病开始、暴露和/或感染可能处于低丰度：Ab-38、Ab-40、Ab-42、Ab-39、Ab-43、Ab-15、Ab-16、Ab-17、Abeta寡聚体、C-肽、IL-13、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、INF-g、PSA、Tau、磷酸-Tau、TNFa、肌钙蛋白I、心肌钙蛋白T、肌钙蛋白C、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、EPO、LC3B、清蛋白、CHO-P、大肠杆菌HCP、IgA、IgE、IgG、IgG1、IgG4、IgM、NSO-P、Per-C6、剩余蛋白A、IgG2、IgG3、IgG4、AFP、CA125、胱天蛋白酶-3活性、CXCL11/I-TAC、ErbB2/HER2、HGFR/o-MET、IFN-beta、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、beta-NGF、TFF3、TIMP1、Kim-1、alpha-2巨球蛋白、D-二聚体、ICAM-1、髓过氧物酶、肌红蛋白、PAI-1、PCSK9、血纤维蛋白溶酶原、肾素/原肾素、tPA、CXCL1/GRO-alpha、CCL2/MCP1、CCL3/MIP-1alpha、CCL4/MIP-1beta、CCL5/Rantes、CRP、CXCL9/MIG、CXCL10/IL-10、G-CSF、GM-CSF、IFN-alpha、IFN-gamma、IL1alpha、IL-1beta、IL-3、IL-7、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-18、c-MET、脂联素、FGF21、GLP-1、生长激素、IGF1、IGF2、胰岛素、瘦素、促乳素、HB-EGF、AKT、磷酸-AKT、及其组合。本发明的方法设计为允许检测很多种生物学和生化试剂，如上文描述的。在一个实施方案中，该方法可用于检测病原性和/或潜在病原性病毒，细菌和毒素，包括在多种相关临床和环境基质中的生物战剂(“BWA”)，包括但不限于，血液、痰、便、过滤物、拭样等。可使用本发明方法分析(单独或组合)的病原体和毒素的非限制性表是炭疽芽孢杆菌(炭疽)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)(瘟疫)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)(霍乱)，Francisellatularensis(兔热病)，布鲁氏菌菌种(布鲁氏菌病(Brucellosis))，伯内特考克斯体(Coxiellaburnetii)(Q热病)，利斯特氏菌(listeria)，沙门氏菌(salmonella)，志贺氏菌(shigella)，V.cholera，沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)，类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderiapseudomallei)，属正痘(orthopox)病毒包括天花病毒(smallpox)，病毒性脑炎，委内瑞拉马脑炎(Venezuelanequineencephalitis)病毒(VEE)，西方马脑炎(westernequineencephalitis)病毒(WEE)，东方马脑炎(easternequineencephalitis)病毒(EEE)，Alpha病毒，病毒性出血热，沙粒病毒科(Arenaviridae)，本雅病毒科(Bunyaviridae)，丝状病毒科(Filoviridae)，黄病毒科(Flaviviridae)，埃博拉(Ebola)病毒，葡萄球菌肠毒素，蓖麻毒蛋白，肉毒杆菌毒素(A，B，E)，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)，真菌毒素，镰孢菌(Fusarium)，Myrotecium，头孢霉菌(Cephalosporium)，木霉菌(Trichoderma)，Verticimonosporium，葡萄穗霉菌(Stachybotrys)，鼻疽病(glanders)，小麦真菌，球形芽孢杆菌(Bacillusglobigii)，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，黄雨(yellowrain)，单端孢霉烯(trichothecene)真菌毒素，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，黄曲霉毒素，Xenopsyllacheopis，Diamanusmontanus，类天花(alastrim)，猴痘，沙粒病毒，汉坦病毒(Hantavirus)，拉沙热(Lassafever)，阿根廷出血热(Argentinehemorrhagicfevers)，玻利维亚出血热(Bolivianhemorrhagicfevers)，里夫特裂谷热(RiftValleyfever)病毒，克里米亚-刚果病毒，汉坦病毒，马尔堡出血热(Marburghemorrhagicfevers)，黄热病毒，登革热病毒，流感(包括人和动物株，包括H5N1禽流感，流感A，流感A，H1特异性，流感A，H3特异性，流感A，H5特异性，流感A，2009-H1N1特异性，流感B)，RSV，人免疫缺陷病毒I和II(HIVI和II)，甲肝，乙肝，丙肝，肝炎(非甲、乙或丙肝)，肠道病毒，Epstein-Barr病毒，巨细胞病毒，单纯疱疹病毒，沙眼衣原体，淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)，阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis)，人乳头状瘤病毒，梅毒螺旋体(Treponemapallidum)，肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)，Borelliaburgdorferi，流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)，肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)，肺炎衣原体(Chlamydophilapneumoniae)，嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，葡萄球菌肠毒素B(SEB)，相思豆毒蛋白，志贺毒素1，志贺毒素2，卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)，酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，艰难梭菌(Clostridiumdifficile)，脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)，克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)，组A链球菌，大肠杆菌O157，冠状病毒，柯萨奇(Coxsackie)A病毒，鼻病毒，副流感病毒，呼吸道合胞病毒(RSV)，偏肺病毒(metapneumovirus)，牛痘和腺病毒。本文中描述的对结合测定法的改进可用于扩展结合测定的动态范围，即可通过系统或方法量化而不需稀释或浓缩样品或改变产生类似结果的测定条件(例如采用的试剂浓度等)的流体样品中分析物分子的浓度范围，且其中可以基本准确地测定分析物分子的测量浓度。流体样品中分析物分子的浓度可视为基本准确测定的，如果测量的流体样品中分析物分子的浓度在流体样品分析物分子的实际(例如真实)浓度的约10％以内的话。在某些实施方案中，测量的流体样品中分析物分子的浓度在实施方案中基本准确地测定，其中测量的浓度在流体样品分析物分子的实际浓度的约5％以内，约4％以内，约3％以内，约2％以内，约1％以内，约0.5％以内，约0.4％以内，约0.3％以内，约0.2％以内，或约0.1％以内。在一些情况中，测定的浓度亮度与真实(例如实际)浓度相差不超过约20％，不超过约15％，不超过约10％，不超过约5％，不超过约4％，不超过约3％，不超过约2％，不超过约1％，或不超过约0.5％。在一些实施方案中，可以确定测定方法的准确度，其通过使用选定的测定方法测定已知浓度的流体样品中分析物分子的浓度并将测量浓度与实际浓度比较。在一些实施方案中，该系统或方法可以能在超过约1000(3log)、约10,000(4log)、约100,000(5log)、约350,000(5.5log)、1,000,000(6log)、约3,500,000(6.5log)、约10,000,000(7log)、约35,000,000(7.5log)、约100,000,000(8log)或更高的动态范围测量流体样品中分析物分子的浓度。在一些实施方案中，可以基本准确测定的流体样品中分析物分子的浓度(例如未知浓度)为低于约5000fM(飞摩)、低于约3000fM、低于约2000fM、低于约1000fM、低于约500fM、低于约300fM、低于约200fM、低于约100fM、低于约50fM、低于约25fM、低于约10fM、低于约5fM、低于约2fM、低于约1fM、低于约500aM(attomolar)、低于约100aM、低于约10aM、低于约5aM、低于约1aM、低于约0.1aM、低于约500zM(zeptomolar)、低于约100zM、低于约10zM、低于约5zM、低于约1zM、低于约0.1zM，或更低。在一些情况中，检测限(例如可在溶液中测定的分析物分子的最低浓度)为约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM、约1fM、约500aM(attomolar)、约100aM、约50aM、约10aM、约5aM、约1aM、约0.1aM、约500zM(zeptomolar)、约100zM、约50zM、约10zM、约5zM、约1zM、约0.1zM，或更低。在一些实施方案中，可以基本准确测定的流体样品中分析物分子或颗粒的浓度为约5000fM至约0.1fM，约3000fM至约0.1fM，约1000fM至约0.1fM，约1000fM至约0.1zM，约100fM至约1zM，约100aM至约0.1zM，或更低。检测上限(例如可在溶液中测定的分析物分子的上限浓度)为至少约100fM、至少约1000fM、至少约10pM(皮摩)、至少约100pM、至少约100pM、至少约10nM(纳摩)、至少约100nM、至少约1000nM、至少约10uM、至少约100uM、至少约1000uM、至少约10mM、至少约100mM、至少约1000mM，或更大。在一些实施方案中，测定的流体样品中分析物分子或颗粒的浓度为低于约50x10-15M、或低于约40x10-15M、或低于约30X10-15M、或低于约20x10-15M、或低于约10x10-15M，或低于约，或低于约1x10-15M。在一些实施方案中，可以基本准确测定的样品中分析物分子的浓度为低于约100fM,低于约10fM,低于约3fM,低于约1fM,低于约0.3fM,低于约0.1fM,低于约0.03fM，或更低。在一些实施方案中，可以基本准确测定的样品中分析物分子的浓度为约5000fM至约0.1fM，约3000fM至约0.1fM，约1000fM至约0.1fM，约1000fM至约1fM，约100fM至约1fM，约100fM至约0.1fM。样品中分析物分子的浓度可视为基本准确测定的，如果测量的样品中分析物分子的浓度在样品分析物分子的实际浓度的约20％以内的话。在某些实施方案中，测量的样品中分析物分子的浓度在样品分析物分子的实际浓度的约10％以内，约3％以内，或约1％以内。在一些实施方案中，可以确定测定方法的准确度，其通过使用选定的测定方法测定已知浓度的样品中分析物分子的浓度。优选地，测定可检测样品中10-10,000个分子，优选地样品中100-5,000个分子，更优选地样品中100-1000个分子。相对于常规的夹心免疫测定技术，如例如使用相同捕捉抗体和两种检测抗体的任一以及相同标记和检测技术测量的，使用本文中描述的测定形式能将检测信号和测定灵敏性改进多达10倍，优选地多达50倍，100倍，或多达1000倍。优选地，使用本文中描述的测定形式能将检测信号和测定灵敏性相对于标准夹心免疫测定法改进多达100倍。本发明方法的一个有利的方面，尤其是当与灵敏光学检测技术偶联时，是信号扩增允许检测单个结合事件为光的亮点。然后，对信号的定量可通过对个体事件计数(其可对低分析物浓度提供更好的灵敏性，通过提供改进的从背景噪音对结合事件区分)或通过对于所有结合事件的信号整合(其可提供测量高分析物浓度的更好的动态范围)来实施。本发明的方法可在多种测定装置和/或形式中使用。测定装置可包含，例如测定模块，如测定板、筒、多孔测定板、反应容器、试管、小池、流动池、测定芯片、测流装置等，具有随测定进展添加的或预加载在测定模块的孔、室或测定区域中的测定试剂(其可包含靶向性试剂或其他结合试剂)。这些装置可采用多种测定形式用于特异性结合测定法，例如免疫测定或免疫层析测定。下文中描述了例示性的测定装置和形式。在某些实施方案中，本发明的方法可采用以干态存储的测定试剂且测定装置/试剂盒可进一步包含或与干燥剂材料一起供应以维持测定试剂处于干态。预加载有测定试剂的测定装置可极大地改进速度和降低测定测量的复杂性，而在存储期间保持极好的稳定性。干燥的测定试剂可以是任何能干燥的测定试剂，然后在测定中使用之前重建。这些包括但不限于，可用于结合测定法的结合试剂，酶，酶底物，指示物染料和其他可用于检测目的分析物的反应性化合物。测定试剂还可以包含不直接牵涉检测机制但在测定中起着辅助作用的物质，包括但不限于，封闭剂，稳定剂，去污剂，盐，pH缓冲剂，防腐剂等。试剂可以以游离形式或在固相，包括测定模块中区室(例如室、通道、流动池、孔等)的表面或胶体、珠或其他微粒支持物的表面上支持而存在。本发明的方法可以与多种用于测量分析物的量，特别是测量结合于固相的分析物的量的方法一起使用。可使用的技术包括但不限于，本领域中已知的技术如基于细胞培养的测定法，结合测定法(包括凝集测试、免疫测定、核酸杂交测定等)，酶测定法，比色测定法等。其他适宜的技术对于本领域普通技术人员来说将是容易明显的。一些测量技术允许通过肉眼检查进行测量，其他技术可能需要或受益于利用仪器来进行测量。用于测量分析物的量的方法包括无标记物技术，其包括但不限于i)测量在分析物结合表面后表面的质量(mass)或折射率的变化的技术(例如表面声波技术、表面等离振子共振传感器、椭圆偏振(ellipsometric)技术等)，ii)质谱技术(包括能测量表面上的分析物的技术如MALDI,SELDI等),iii)层析或电泳技术，iv)荧光技术(其可基于分析物的内在荧光)，等等。用于测量分析物的量的方法还包括经由对可能直接或间接(例如经由使用分析物的经标记的结合伴侣)附接于分析物的标记物的检测来测量分析物的技术。适宜的标记物包括可直接可视化的标记物(例如可肉眼看到的颗粒和生成可测量信号如光散射、光吸光度、荧光、化学发光、电化学发光、放射性、磁场等的标记物)。可使用的标记物还包括酶或其他化学反应性种类，其具有产生可测量信号如光散射、吸光度、荧光等的化学活性。使用酶作为标记物在酶联免疫吸附测定也称为ELISA、酶免疫测定或EIA中是确定的。在ELISA形式中，未知量的抗原被附接于表面，然后特异性抗体从表面清洗通过，从而其可以结合抗原。该抗体连接于酶，且在最终步骤中添加物质从而酶将其转化成提供可检测信号中变化的产物。产物的形成可以是可检测的，例如由于在可测量特性如吸光度、荧光、化学发光、光散射等中相对于底物的差异。可与依照本发明的固相结合方法一起使用的某些(但并非所有)测量方法可能受益于或需要清洗步骤以从固相除去未结合的组分(例如标记物)。因此，本发明的方法可包含这类清洗步骤。在采用一对可检测的标记物的那些实施方案中，基于当一对标记物彼此接近，即各自直接或间接结合检测复合物中的目的分析物时其可被独立检测的能力和/或那些物质协同工作以生成可检测信号的能力来选择那些经标记的物质。在一个实施方案中，第一可检测的标记物是偶联酶反应系统的第一酶且第二可检测的标记是偶联酶反应系统的第二酶，且该方法进一步包括添加该反应系统的一种或多种底物的步骤，由此产生酶反应系统的可检测产物。包含可检测产物的那些反应容器可与不包含的那些反应容器区分。在一个优选的实施方案中，仅当第一酶和第二酶接近(例如低于200nm，理想地低于50nm)时产生可检测的产物。在一个实施方案中，第一酶是氧化酶，例如葡萄糖氧化酶，第二酶是过氧化物酶，且底物包含氧化酶底物例如葡萄糖，和经标记的酪胺(tyramide)、AmplexRed(10-乙酰-3,7-二羟基吩噁嗪(dihydroxyphenoxazine))、或鲁米诺衍生物(本文中统称为经标记的反应性衍生物且在一个优选的实施方案中，经标记的反应性衍生物包含AmplexRed或鲁米诺)。在该实施方案中，第一酶与底物反应以生成产物，其与第二酶反应以生成第二产物，该第二产物与经标记的反应性衍生物反应以生成可检测的种类。优选地，由检测复合物中第一和第二酶催化的反应导致经标记的反应性衍生物在表面上的固定化，可对此测量来测定表面上存在的分析物分子的数目。在一个实施方案中，经标记的反应性衍生物是生物素-酪胺，其该方法进一步包括添加经标记的链霉亲合素和测量链霉亲合素上的标记物。可用于所述方法的又一个近端依赖性标记系统是FRET对，例如第一可检测的标记物是FRET供体而可检测的标记物是FRET接受体。荧光共振能量转移(FRET)是两种染料分子的电子激发态之间的距离依赖性相互作用，其中激发从供体分子转移至接受体分子而不发射光子。FRET的效率依赖于分子间间隔的倒数六次方，使得在与生物大分子尺寸可比的距离中可用。在该标记系统中，近端依赖性信号通过激发FRET供体和测量从FRET接受体的发射来测量。供体和接受体分子优选紧密接近的，例如约10-100埃，接受体的吸收光谱优选与供体的荧光发射光谱重叠，且供体和接受体跃迁偶极(transitiondipole)取向应大致平行。FRET对的非限制性表在下表1中提供。表1.FRET对例子对于光显微术有多种FRET检测方法，例如接受体光漂白、供体光漂白、比率成像、敏化发射和荧光寿命测量。可用在采用一对检测标记物的实施方案中的另一个适宜的标记系统是其中可以独立测量第一和第二可检测的标记物的系统。例如，第一和第二可检测的标记物可以是发光标记物，其彼此的光谱特性不同。或者，第一可检测的标记物是与第一底物反应以产生第一信号的第一酶，而第二可检测的标记物是与第二底物反应以产生不同的第二信号的第二酶，且该方法还包括添加第一酶底物和第二酶底物，并计算其中生成第一和第二信号的反应容器的数目。第一和第二信号可以是光吸光度中的变化和/或具有不同光谱特性的发光信号。如果第一和第二可检测的标记物包含第一和第二酶，则它们各自可为水解酶，例如磷酸酶、硫酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶或其组合，且因此，第一和第二底物选自磷酸、硫酸、半乳糖苷和葡糖苷酸修饰的稳定化的二氧杂环丁烷、4-甲基伞形基、荧光素或其组合。或者，第一和第二酶选自辣根过氧化物酶、beta-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。或者，用于检测分析物分子的标记物可以是可用于单分子荧光检测，例如荧光相关光谱和/或荧光交互相关光谱中的荧光种类。单分子荧光检测包括使包含可检测的种类的洗脱物流过毛细管，将光源聚焦在毛细管内的某体积上以创建探询带，并用光检测器观察探询带以检测荧光分子经由探询带的通过。在一个实施方案中，可使用基于电化学发光的测定形式来测量样品中的一种或多种目的分析物，例如基于电化学发光(ECL)的免疫测定法。ECL的高灵敏性、较广的动态范围和选择性是用于医学诊断的重要因素。商品化的ECL仪器已显示出优越的性能，且由于其极好的灵敏性、动态范围、精度和对复合物样品基质的容忍性其已被广泛使用。可诱导以发出ECL的种类(ECL活性种类)已被用作ECL标记物，例如i)有机金属化合物，其中金属来自例如组VIII的贵金属，包括含Ru和含Os有机金属化合物如三-联吡啶-钌(RuBpy)模块和ii)鲁米诺和相关化合物。在ECL过程中参与ECL标记物的种类在本文中称为ECL共反应物。常见使用的共反应物包括对于来自RuBpy的ECL为叔胺(例如参见美国专利No.5,846,485)、草酸盐和过硫酸盐，对于来自鲁米诺的ECL为过氧化氢(参见例如美国专利No.5,240,863)。通过ECL标记物生成的光可用作诊断规程中的报告信号(Bard等,美国专利No.5,238,808，通过提述并入本文)。例如，ECL标记物可以共价偶联于结合剂如抗体、核酸探针、受体或配体；可以通过测量从ECL标记物发出的ECL来监测结合相互作用中结合试剂的参与。或者，来自ECL活性化合物的ECL信号可以指示化学环境(参见例如美国专利No.5,641,623，其描述了监测ECL共反应物的形成或破坏的ECL测定)。对于ECL、ECL标记物、ECL测定法和用于进行ECL测定法的仪器的更多背景，参见美国专利Nos.5,093,268；5,147,806；5,324,457；5,591,581；5,597,910；5,641,623；5,643,713；5,679,519；5,705,402；5,846,485；5,866,434；5,786,141；5,731,147；6,066,448；6,136,268；5,776,672；5,308,754；5,240,863；6,207,369；6,214,552和5,589,136和公开的PCTNos.WO99/63347；WO00/03233；WO99/58962；WO99/32662；WO99/14599；WO98/12539；WO97/36931和WO98/57154，所有均通过提述并入本文。本发明的方法可应用于单路或其中在单一样品中进行多种测定测量的多重形式。可用于本发明的多重测量包括但不限于，以下多重测量i)牵涉多个传感器的使用；ii)使用基于表面上位置可区分的表面(例如阵列)上的离散测定域；iii)牵涉使用在颗粒上包被的试剂，所述颗粒基于颗粒特性如大小、形状和颜色等可区分；iv)产生基于光学特性(例如吸光度或发射光谱)可区分的测定信号或v)基于测定信号的时间特性(例如信号的时间、频率或相位)。在一些实施方案中，对样品中分析物分子浓度的量度可至少部分通过比较测量的参数与校正标准来测定。例如，包含分析物分子的结合表面的分数可与校正曲线比较以测定样品中分析物分子浓度的量度。校正曲线可通过在用于分析测试样品的条件下完成对多个已知浓度的标准化样品的测定来产生。对于每份标准化样品可对与分析物分子的检测/定量有关的信号取读数，因此允许形成将分析物分子的检测与已知浓度的分析物分子相关的校正曲线。然后，测定可以在包含未知浓度的分析物分子的样品上完成，并将来自该测定的分析物分子的检测绘制在校正曲线上，因此测定对样品中分析物分子浓度的量度。在使用成像技术以测量光信号(如荧光、化学发光或电化学发光)的一个具体情况中，结合事件可检测为光的亮点源。当点源的表面密度较低时(例如当在RxR(其中R是检测系统的空间分辨率)区域发现点源的概率低于10％时)，可能任何观察到的点源是由于单一结合事件。在这些条件下，对事件计数可以提供最灵敏的测量。当表面密度增加时，解析和计数各个结合事件变得逐渐困难的。在这些条件下，整合结合表面上的光信号提供更准确的测量。对于熟练技术人员而言明显的是本文中描述的方法可应用到本领域技术人员已知的大量免疫测定平台。可以调整免疫测定平台的多个特征以适合具体的平台，但那些调整是完全在普通技术人员能力范围内的。例如，本文中描述的方法可应用于使用编码颗粒的基于珠的形式。在这类系统中，使用的珠可以是磁性或非磁性的，且珠的表面经修饰以包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。该系统中采用的检测试剂是一对检测试剂。在一个实施方案中，两种检测试剂包含可区分的荧光标记物。或者，两种检测试剂用核酸探针修饰，如本文描述的，在该情况下，免疫测定方法包括延伸过程例如RCA-PLA以生成扩增的产物，其指示可检测的每种检测试剂的存在。如果检测试剂包含两种可区分的荧光标记物，那么测量步骤包括将珠引入流动池，且如果珠是磁性的，就在流动池中捕捉珠。如果检测试剂用核酸探针修饰，则测量步骤包括在珠上形成夹心复合物，实施RCA-PLA和用荧光标记的检测探针标记扩增子。然后，将经标记的珠引入流动池中且如果珠是磁性的，就在流动池中捕捉珠。在每个实施方案中，可以基于对荧光标记的编码珠的鉴定来光谱多重化测定。可以使用激发光源和用于多色检测的发射光检测器来检测每个实施方案中的结合事件，通过对具有两种可检测的标记的珠或包含可检测的经标记延伸产物的那些珠计数来实现定量，且定量还通过整合的强度来实现，例如通过对所有结合事件整合信号检测。因此，可以提供用于上文所述方法的试剂盒，其在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含以下一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁性或非磁性珠；(b)具有可区分荧光标记物的两种检测试剂；和(c)任选的缓冲剂和/或稀释剂用于测定方案。可用于上文所述方法的另一试剂盒可在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含以下一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁性或非磁性珠；(b)用核酸探针修饰的两种检测试剂(任选地，分别提供检测试剂且另外提供近端探针(1和2)，具有用探针修饰检测试剂的用法说明)；和(c)荧光标记的探针；任选的用近端探针修饰检测试剂所需的试剂；测定稀释剂、校正物、环化寡核苷酸、连接混合物或其组分，例如连接缓冲液、ATP、BSA、Tween20、T4DNA连接酶；RCA混合物或其组分，例如BSA、缓冲液、dNTP、Tween20、Phi29DNA聚合酶。在另一个实施方案中，本文中描述的方法可用于流动池分析的基于珠的恶性是。在这类系统中，使用的珠可以是磁性的且珠表面经修饰以包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。该系统中采用的检测试剂是一对用核酸探针修饰的检测试剂，如本文描述的，在该情况下，免疫测定方法包括延伸过程例如RCA-PLA以生成扩增的产物，其指示可检测的每种检测试剂的存在。测量步骤包括在珠上形成夹心复合物，实施RCA-PLA和用ECL-标记的检测探针标记扩增子。然后，将经标记的珠引入流动池中且在流动池中捕捉珠。具体地，应用磁场以将磁性颗粒例如珠吸引至电极表面，其可包含多种金属例如铂。使用电压源来对电极应用电压且可以使用发射光检测器来检测结合事件；通过对具有可检测经标记的延伸产物的珠计数来实现定量，且定量还通过整合的强度来实现，例如通过对所有结合事件整合信号检测。可用于上文所述方法的试剂盒在一个或多个管形瓶、容器或区室中可包含以下一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁珠；(b)用核酸探针修饰的两种检测试剂(任选地，分别提供检测试剂且另外提供近端探针(1和2)，具有用探针修饰检测试剂的用法说明)；和(c)ECL标记的探针；任选的用近端探针修饰检测试剂所需的试剂；测定稀释剂、校正物、环化寡核苷酸、连接混合物或其组分，例如连接缓冲液、ATP、BSA、Tween20、T4DNA连接酶；RCA混合物或其组分，例如BSA、缓冲液、dNTP、Tween20、Phi29DNA聚合酶。在流动池分析的基于珠的形式的一个具体的实施方案中，将样品与分析物特异性的生物素化单克隆捕捉抗体和分析物特异性单克隆抗体的混合物温育，所述单克隆抗体各自缀合寡核苷酸，其反应以形成夹心复合物。在添加用链霉亲合素包被的微颗粒后，复合物经由生物素和链霉亲合素之间的相互作用变成结合固相。对该混合物添加连接混合物，并将该混合物与连接混合物温育，清洗以除去过量的环状寡核苷酸，并与RCA混合物温育。清洗混合物并加入生物素-经标记检测探针的混合物。为了掺入适宜的标记物例如发光、化学发光或电化学发光标记物，例如SULFO-TAG，合成具有末端生物素标记物的检测探针并与用SULFO-TAG标记的链霉亲合素预结合。将反应混合物抽吸到测量孔，该处微颗粒被磁性捕捉到电极例如金属电极(如铂电极)的表面上。然后用适宜的清洗缓冲液例如ProCell(含TPA的缓冲液)除去未结合的物质。然后对电极应用电压诱导化学发光发射，对此通过光电倍增管测量。电压施用和所得发射的测量可在任何适宜的流动池例如Cobas和/或Elecsys仪器(可获自Hoffmann-LaRocheLTD.)中完成。在又一个实施方案中，本文描述的方法可应用于基于珠的形式，伴有毛细管流动以对个体分子数字计数。在这类系统中，使用的珠可以是磁性的且珠的表面修饰为包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。该系统中采用的检测试剂是一对包含可区分的荧光标记物的检测试剂。测量步骤包括形成包含捕捉试剂、分析物和检测试剂的夹心复合物，交联检测试剂，洗脱检测试剂并将珠引入流动池中。可以使用激发光源和用于多色检测的发射光检测器来检测结合事件，通过关联流动池中两种荧光团的检测来实现定量，且定量还通过整合的强度来实现，例如通过对所有结合事件整合信号检测。可用于上文所述方法的试剂盒可在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含以下一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁珠；(b)具有可区分的荧光标记物的两种可交联检测试剂；和(c)任选的缓冲剂和/或稀释剂用于测定方案。而且，本文描述的方法可应用于基于珠的形式，其包含将珠分到各个纳米孔中。在这类系统中，使用的珠可以是磁性的且珠的表面修饰为包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。该系统中采用的检测试剂是一对包含可区分的酶标记物的检测试剂。测量步骤包括形成包含捕捉试剂、分析物和检测试剂的夹心复合物，和添加两种酶标记物的底物。然后在各个纳米孔中捕捉珠。基于具有不同光谱特性的酶产物的鉴定，测定可以是光谱多重化的。可以使用激发光源和用于多色检测的发射光检测器来检测结合事件，通过对具有两种酶产物的纳米孔计数来实现定量，且定量还通过整合的强度来实现，例如通过对所有纳米孔整合信号检测。可用于上文所述方法的试剂盒可在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含以下一种或多种：(a)具有捕捉试剂的磁珠；(b)各用可区分的酶标记物修饰的两种检测试剂，例如生物素化的检测试剂和用半抗原缀合的检测试剂；(c)链霉亲合素-beta半乳糖苷酶，用抗-半抗原缀合的酶，试卤灵(resorufin)-beta-d-半乳吡喃糖苷(galactopyranoside)；(d)阵列，例如QuanterixDVD形式阵列；(e)氟碳油；和(f)任选的缓冲剂和/或稀释剂用于测定方案。在这种具体的实施方案中，通过将纳米孔高灵敏性系统与基于近端的检测系统组合使用来增强可检测的信号。尽管使用具体的基于近端的检测系统例示了这一具体的实施方案，但熟练技术人员将领会也可以使用本文描述的其他基于近端的检测系统来增强测定中的可检测的信号这一事实，例如FRET供体/接受体系统；就光谱特性而言彼此不同的发光标记物；或使用如上文描述的为水解酶的第一和第二酶，和适宜的伴随底物。仍进一步地，本文描述的方法可应用于基于珠-阵列的平台。在这类系统中，使用的珠可以是非磁性的且珠的表面修饰为包含捕捉试剂的一个或多个拷贝。该系统中采用的检测试剂是包含第一和第二核酸探针的一对检测试剂。测量步骤包括形成包含捕捉试剂、分析物和检测试剂的夹心复合物，延伸一种探针以形成延伸序列，其中该延伸依赖于第一和第二探针在夹心复合物中的共定位，用荧光探针标记延伸序列，并从表面释放延伸序列至洗脱物中。可以使用激发光源和用于多色检测的发射光检测器来检测结合事件，通过对可检测标记的个体延伸产物计数来实现定量，且定量还通过整合的强度来实现，例如通过对所有结合事件整合信号检测。可用于上文所述方法的试剂盒可在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含以下一种或多种：(a)具有捕捉试剂的非磁性珠；(b)用核酸探针修饰的两种检测试剂(任选地，分别提供检测试剂且另外提供近端探针(1和2)，具有用探针修饰检测试剂的用法说明)；和(c)荧光标记的探针；任选的用近端探针修饰检测试剂所需的试剂；测定稀释剂、校正物、环化寡核苷酸、连接混合物或其组分，例如连接缓冲液、ATP,BSA,Tween20,T4DNA连接酶；RCA混合物或其组分，例如BSA,缓冲液,dNTP,Tween20,Phi29DNA聚合酶。本文描述的改进的结合测定法可使用包含测定法中采用的一组组分的一种或多种试剂盒实施。例如，在检测样品中分析物中使用的试剂盒在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含，包含针对分析物的捕捉试剂和锚定试剂的表面；针对分析物的检测试剂，其连接于核酸探针。这类试剂盒可包含锚定试剂，其包含锚定寡核苷酸序列。可用于实施本文描述的方法的另一种试剂盒在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含，表面，其包含针对分析物的捕捉试剂和包含锚定寡核苷酸序列的锚定试剂；第一检测试剂，其连接于第一核酸探针；和第二检测试剂，其连接于第二核酸探针。可用于实施本文描述的结合测定法的再一种试剂盒在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含，包含针对分析物的捕捉试剂和锚定试剂的表面；针对分析物的第一检测试剂，其包含第一近端探针；针对分析物的第二检测试剂，其包含第二近端探针；和连接体序列，其包含(i)互补于第二近端探针的内部序列，和(ii)互补于第一近端探针的非重叠性区域的两个端序列。或者，试剂盒可改为包含，包含针对分析物的捕捉试剂和锚定试剂的表面；针对分析物的第一检测试剂，其包含第一近端探针；针对分析物的第二检测试剂，其包含第二近端探针；和(i)第一连接寡核苷酸，和(ii)第二连接寡核苷酸，其中(x)第一连接体的第一端和第二连接体的第一端互补于第一近端探针的两个非重叠性区域，和(y)第一连接体的第二端和第二连接体的第二端互补于第一近端探针的两个非重叠性区域。另外，在这些试剂盒的任一或两者中的锚定试剂可包含锚定寡核苷酸序列。而且，本文描述的方法可使用以下试剂盒实施，其在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含，包含第一可检测的标记的第一检测试剂；包含第二可检测的标记的第二检测试剂；配置为含有一个或更少的分析物分子的多个反应容器；和任选地，包含捕捉试剂的表面。最后，用于使用本文描述的方法检测分析物的试剂盒可在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含，表面，其包含固定化的捕捉试剂；包含第一可检测的标记的第一检测试剂；包含第二可检测的标记的第二检测试剂；和与第一和第二检测试剂反应性的交联剂。交联剂可包括多功能交联剂，其连接附接于检测试剂的反应性模块或附接于检测试剂的结合模块的多价结合伴侣。适宜的多功能交联剂包括但不限于，胺、硫醇、酰肼、醛、酯、碘乙酰胺、马来酰亚胺、点击化学试剂及其组合。类似地，多价结合伴侣的例子是多价抗物种抗体，其靶向作为该动物物种的抗体的检测试剂。当与附接于检测试剂的伴侣结合配偶成对时，交联剂还可包括链霉亲合素、亲合素或生物素。交联剂还可以是寡核苷酸，其包含与直接或间接结合试剂盒组分的核酸探针互补的序列。在一个具体的实施方案中，本文描述的方法中使用的试剂盒在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含，表面，其包含固定化的捕捉试剂；具有第一可检测的标记和第一核酸探针的第一检测试剂，和；具有第二可检测的标记和第二核酸探针的第二检测试剂；和具有互补于第一和第二核酸探针的区域的第三核酸。本文描述的试剂盒的表面可包含针对一种或多种分析物分子的多种捕捉试剂，其中所述捕捉试剂在位于表面上的多个可解析结合区域或反应容器上分配，例如在阵列中、多孔板中或微孔或纳米孔板中。另外，表面还可以包含多个颗粒，其各自包含针对分析物分子的多种捕捉试剂。上文描述的试剂盒可进一步包含一种或多种以下物质：一种或多种另外的试剂、缓冲液、聚合酶、连接酶、和/或dNTP(经标记或未经标记的)。另外，如果一种或多种检测试剂包含可检测的标记，则试剂盒还可包含试剂盒中采用的可检测的标记的共反应物。或者，如果一种或多种检测试剂是偶联的酶反应系统的组分时，则每种检测试剂包含第一和第二酶且试剂盒还在一个或多个管形瓶、容器或区室中包含，偶联酶反应系统的一种或多种底物，和任选地，配置为结合偶联酶反应系统的产物的经标记组分。例如，第一酶可以是氧化酶，第二酶是过氧化物酶，且试剂盒还包含氧化酶底物和经标记的酪胺衍生物。在另一个实施方案中，第一和第二可检测的试剂可包含近端依赖性检测系统的组分，例如FRET供体和FRET接受体，或彼此就光谱特性而言不同的发光标记物。其他的备选实施方案图7中例示了一个另外的实施方案。小图(a)中夹心免疫测定复合物中每个近端探针的一部分被杂交于各区段的RNA短链暂时保护。酶法除去RNA链从而使得每个近端探针可彼此杂交且使用生物素化的dNTP通过聚合酶延伸来延伸链(小图(b))。掺入链中的每个生物素化的碱基结合于用可检测的标记物标记的链霉亲合素(小图(c))。另一种方法在图8中例示。近端探针可附接于锚定试剂和检测试剂(如小图(a)中显示)或每种近端探针可附接于两种检测试剂，如上文描述的(未显示)。与图7中例示的方法大部分类似，每个近端探针的一部分被杂交于各区段的RNA短链暂时保护。酶法除去RNA链从而使得每个近端探针可彼此杂交且使用生物素化的dNTP通过聚合酶延伸来延伸链(小图(b))。掺入链中的每个生物素化的碱基结合于用可检测的标记物标记的链霉亲合素(小图(c))。另外的实施方案在图18中示出。在该实施方案中，使用多种短寡核苷酸作为U形序列(staplesequences)(1801)与扩增子的一部分杂交，并从而将产物折叠成易于成像的紧凑结构。每个U形序列包含至少两个序列(分别为1802和1803)，其每一个与扩增子的序列互补，且当每个U形序列与其互补体杂交时，所述扩增子如图18所示被折叠回自身上。另外，扩增子也可以通过与如上所述的锚定试剂(1804)的锚定相互作用而粘附到表面。通过在扩增步骤期间将U形序列添加到反应混合物中，可以原位(insitu)进行装订(stapling)过程。因此，随着每个扩增循环的完成，U形序列自由地与新形成的扩增子杂交并使其折叠。也可以在扩增过程完成之后添加U形序列，使得线性扩增子折叠成线圈或平片，这取决于U型序列及其相应的互补体的设计。标记分子，例如ECL或荧光，可以掺入到U型序列中(或者其可以如上所述并入到扩增子中)。该实施方案将在表面上产生三维结构，产生更高信号密度的更小特征，其允许表面上扩增子的更为容易地成像。实施例实施例1：用于近端连接和滚环扩增的一般方案通过如下添加近端探针1和2修饰针对靶分析物的一对检测抗体：对100uL缓冲液中的200ug第一检测抗体，添加在150mM磷酸盐缓冲液中稀释的1.74uL23mM磺基-SMCC，且在室温温育30分钟。通过大小排阻层析除去游离的磺基-SMCC。检测抗体的最终浓度为2mg/mL或稍微更低。将九十五(95)uL的300uM用硫醇修饰的寡核苷酸(近端探针1和2)用5uL的100mM磷酸盐缓冲液中1mMDTT，0.5mMEDTA，pH8.4在室温还原1小时。近端探针1和2的序列为：硫醇修饰的近端探针1:SH-AAAAAAAAAAGACGCTAATAGTTAAGACGCTTUUU(SEQIDNO:1；其中3个U残基为2’O-甲基RNA)硫醇修饰的近端探针2:SH-AAAAAAAAAATATGACAGAACTAGACACTCTT(SEQIDNO:2)。除去过量的磺基-SMCC和DTT，例如通过使用三次旋转柱分离，并合并抗体和DNA用于共价缀合。将溶液在室温温育1小时伴随混合。纯化抗体-近端探针缀合物，例如通过大小排阻层析以除去未缀合的抗体和寡核苷酸。将MSDMULTI-板用适宜的封闭溶液封闭1小时并清洗。板上的每个结合域包含捕捉抗体和锚定模块(固定化为BSA-寡核苷酸缀合物，选择寡核苷酸为特异于滚环扩增子)。本实施例中使用的锚定寡核苷酸的序列为5’-AAGAGAGTAGTACAGCAGCCGTCAAAAAAAAAAAA-/3ThioMC3-D/-3’(SEQIDNO:3)。对每个孔添加二十五(25)μl的每种测定稀释剂和校正物，或样品(按适宜的稀释)(产生50ul总体积)。将板伴随振动温育1-3小时并清洗每个孔。将如上文描述制备的用近端探针1和2标记的检测抗体的溶液添加到每个孔(25uL每孔)，并伴随振动温育1-2小时(或者，每一种检测抗体可以序贯添加，每次添加后是1小时温育)。对每个孔添加包含以下组分的连接混合物：(i)环化寡核苷酸1(4nM),环化寡核苷酸2(4nM),连接缓冲液,ATP(1mM),T4DNA连接酶(0.15U/uL)，其中每种环化寡核苷酸为：环化寡核苷酸1：磷酸根-CTATTAGCGTCCAGTGAATGCGAGTCCGTCTAAGAGAGTAGTAGAGCAGCCGTCAAGAGTGTCTA(SEQIDNO：4)。环化寡核苷酸2：磷酸根-GTTCTGTCATATTTAAGCGTCTTAA(SEQIDNO：5)。将板与连接混合物在室温温育30分钟，清洗以除去过量的环化寡核苷酸，并在37C与RCA混合物温育1.5小时，其中所述RCA混合物含有RCA缓冲液,dNTP(各250uM),Phi29DNA聚合酶(0.125U/ml)。清洗板和添加检测探针的混合物并在37C温育30分钟，其中检测探针混合物包含：20mMTris,1mMSDTA,250mMNaCl,0.01％Triton,BSA(200ug/ml),Tween20(0.05％),检测探针(6.25nM)。检测探针为序列CAGTGAATGCGAGTCCGTCT(SEQIDNO:6)。为了掺入电化学发光标记物SULFO-TAG(MesoScaleDiagnostics)，检测探针合成为具有末端生物素标记物且与用SULFO-TAG标记的链霉亲合素预结合。清洗板并用150μlMSD读数缓冲液填充且立即在MSD6000读数器上读数(板和读数器由MesoScaleDiscovery,Rockville,MD提供)。使用此一般性规程来检测以下分析物：肌钙蛋白I、Akt(总)、磷酸-Akt(473)、磷酸-Akt(308)、流感A核蛋白(NP)、IL-12p40、IL-12p70、Abeta1-42，使用TNFalpha模式系统的桥接和同种型分析(bridgingandisotyping)Ig测定，使用乙肝表面抗原的桥接和同种型分析Ig测定，和使用LymeC6的桥接和同种型分析Ig测定。相对于标准夹心免疫测定在ECL信号和测定灵敏性中的增加在测定法之间变化，但观察到高达100倍的改进。对于测试的某些测定，例如肌钙蛋白-I、Akt(总)、IL-12p40、IL-12p70和Abeta1-42，锚定模块的存在改进了信号和/或稀释线性，其通过防止扩增步骤期间检测复合物的解离。根据上述规程进行的IL-10测定的校正曲线显示于图9。另外，表2(下面)显示根据上述规程进行的一组代表性测定的LOD(第2列，“3-ABRCA/PLA测定”)相对于来自MesoScaleDiagnostics(MSD),Rockville,MD，www.mesoscale.com(第3栏，“MSDV-Plex2-AB免疫测定方案”)的标准两抗体免疫测定方案的LOD。表2.实施例2.有和无锚定试剂的测定方案如上文实施例1描述的将MSD7-spotMULTI-SPOT板各用肌钙蛋白I捕捉抗体(220ug/mL)包被。将捕捉抗体在有或无锚定模块BSA的情况下共打点(co-spotted)，BSA共价附接有特异于扩增子的寡核苷酸(5ug/mL锚定物，若存在的)。对每个孔添加二十五(25)μl的每种测定稀释剂和校正物，或样品(按适宜的稀释)(总共50ul)。将板伴随振动温育2小时并清洗每个孔。将如上文描述制备的用近端探针1和2标记的检测抗体的溶液添加到每个孔(25uL每孔)，并伴随振动温育1小时。对每个孔添加如在上文实施例1中描述的连接混合物。将板与连接混合物在室温温育30分钟，清洗以除去过量的环化寡核苷酸，并在37C与RCA混合物温育1.5小时，如在上文实施例1中描述的。清洗板并添加检测探针的混合物且在37C温育30分钟，如在上文实施例1中描述的。清洗板并用150μlMSD读数缓冲液填充且立即在MSD6000读数器上读数。从板顶部移去MSD电极用于荧光成像并用PBS和盖片保持湿润。使用Zyla照相机观察表面，20x物镜，2x2面元(binning)，客户过滤集(customerfilterset)，具有2二次曝光(secondexposure)。如表3(下面)中显示的，ECL值在存在锚定试剂的情况下高4-5倍，且检测限低3倍(更灵敏)。表3图10(a)和(b)显示具有(小图(a))和没有(小图(b))5ug/mL锚定试剂的板表面的荧光显微镜图像。该图像显示与个体结合事件有关的亮荧光点，且确认了在存在锚定试剂的情况下RCA扩增对于生成可观察的结合事件更有效率。实施例3.一种相对于两种连接子寡核苷酸的比较使用具有一个连接位点以形成环状模板的单一线性连接子寡核苷酸而不是具有两个分别的连接位点的两种连接子寡核苷酸重复实施例2中描述的测定。如图11(a)中显示的，制备单一线性连接子寡核苷酸，其在连接位点1或连接位点2处打开。使用实施例1和2中使用的寡核苷酸Circ-1和Circ-2的组合，并排测试两种单一线性连接子寡核苷酸。采用实施例2中描述的方案，另外，以三种浓度测试该单一线性连接子寡核苷酸：125nM、62.5nM和31nM，而以125nM测试使用Circ-1和Circ-2寡核苷酸的组合的标准测定。如图11(b)中显示的，将两种单一线性连接子寡核苷酸以大致相同的效率成功地掺入RCA扩增产物中作为两部分连接子寡核苷酸混合物(Circ-1和Circ-2)。基于信号强度、非特异性背景和总体灵敏性，在连接位点1打开的单一线性连接子寡核苷酸具有与两部分连接子混合物可比的性能。如预期的，在连接位点2打开的单一线性连接子寡核苷酸具有更高的非特异性背景和更低的灵敏性。在后一情况中，连接和引发两者均仅依赖于近端探针#1的存在；因此失去了近端扩增办法的一些特异性益处。实施例4.使用备选的近端探针、锚定寡核苷酸和连接子序列进行的三抗体测定使用实施例1中列出的方案进行测定，其使用下列备选的试剂组：表4下表5中的结果针对肌钙蛋白测定，其中肌钙蛋白的浓度为500pg/mL且MULTI-SPOT板的每个孔包含一个捕获点，其具有来自表4中列出的组之一的锚定寡核苷酸。测定使用一种近端探针(1)和一种近端探针(2)，以与实施例1中描述的相同的浓度。组(a)-(c)的非特异性结合更高，因为它们相比于实施例1中描述的浓度具有高9倍的检测寡核苷酸-SA-STAG浓度。检测寡核苷酸-SA-STAG的更高浓度来自于对预结合的复合物总体的滴定，而非对单独SA-STAG的滴定，如实施例1中的。表5.PLA组(a)(b)(c)实施例1肌钙蛋白178,560138,540189,166273,261无肌钙蛋白41231454588实施例5.在另外的免疫测定平台上进行的三抗体测定(a)使用编码颗粒的基于珠的免疫测定形式所有测定步骤均在96孔过滤板中进行。用真空歧管(不超过10In.的Hg)从板除去液体。从不翻转板。如果发生堵塞，使用15ml锥形管的尖端以轻柔按压堵塞孔下面的区域，然后使用1mlPasteur吸耳球(pipetterubberbulb)或将拇指放在堵塞孔上以通过生成压力除去堵塞。在最后吸出步骤后，在一堆纸巾上轻敲板底部，然后用Kimwipe轻擦过滤板底部以除去残余液体/液滴。清洗溶液制备：通过将20x工作洗涤液瓶的全部内容物用285ml去离子水稀释来制备1x工作洗涤液。测定标准制备：在100％测定稀释剂(血清和血浆样品)或50％测定稀释剂/50％组织培养基(组织培养上清)中重建冻干标准；重建体积：(i)1管形瓶：1ml；(ii)2管形瓶：0.5ml每管形瓶。在室温再水合8-10分钟。轻柔颠倒管形瓶几次和允许管形瓶再放置3-5分钟以确保完全水合。如果使用超过1种标准，组合等体积的每种标准并轻柔混合。实施重建标准的3倍系列稀释以制备七点标准曲线。分析物捕获：(1)涡旋(30sec)和超声处理(30sec)10x捕获珠储液。在箔包裹的管中，将10x捕获珠储液(2.5μl每孔)在工作洗涤液(WorkingWashSolution)(25μl每孔～2,000至5,000珠/测定)中稀释。对于更高的多重化，调整工作洗涤液的体积以适应保留的10x捕获珠储液的额外体积。(2)用200μl的工作洗涤液预湿润标准和样品孔。(3)涡旋(30sec)和超声处理(30sec)稀释的捕获珠溶液。立即向每个测定孔添加25μl，接着是200μL的1x洗涤液。用200μL的工作洗涤液抽吸和重复清洗。按需要轻敲和轻擦过滤板的底部。(4)对所有测定孔添加50μl的温育缓冲液。(5)将100μl标准添加到指定孔中。对于指定用于样品的孔，添加50μl测定稀释剂接着是50μl样品。覆盖板和在定轨式板振动器上(500-600rpm)室温温育板2小时。在所有温育期间用不透明盖覆盖测定板以避光。根据定轨振动器的半径可能需要调整速度。分析物检测(6)制备荧光标记的检测抗体的1x混合物：在稀释剂(100μl每孔)中稀释10x检测抗体混合物(10μl每孔)。混合物包含特异于目的分析物的一对检测抗体，一种用AlexaFluor350(蓝色荧光标记物)标记，另一种用AlexaFluor594(红色荧光标记物)标记(这些荧光标记物的每种可获自LifeTechnologies,GrandIsland,NY,www.lifetechnologies.com)。对于更高的多重化，调整稀释剂的体积以适应需要的10x抗体混合物储液的额外体积。用200μL的工作洗涤液抽吸和清洗测定孔两次。向每个测定孔添加100μl稀释的检测抗体混合物。覆盖板并在板振动器(500-600rpm)上温育1小时。测定读数(8)用200μl工作洗涤液抽吸和清洗测定孔3次。用干净纸巾干燥过滤板的底部以完全除去所有残余液滴。向每个测定孔添加100μl工作洗涤液并将板置于板振动器(500-600rpm)上2-3分钟。(9)在多色荧光颗粒分析仪(如FACS系统或改动的xMAP仪)中分析珠悬液，该分析仪包含针对每种荧光标记物的颜色通道。为了最大灵敏性，测定在以下条件下运行，其中任何颗粒可能具有仅0个或1个结合的分析物且通过对颗粒数目计数来对分析物的量定量，所述颗粒特异于包含两种荧光标记物的给定分析物(基于颗粒编码)。任选地，可在多重形式中运行测定，其使用编码珠和针对每种分析物的另外的检测抗体对，其中编码指示珠上捕获抗体的分析物特异性。在确定编码时，如使用掺入珠中的另外荧光色在xMAP中的，分析仪应具有另外的检测通道用于测量另外的颜色并鉴定珠编码。(b)使用包含锚定部分的编码颗粒，使用用核酸探针修饰的两种检测试剂的基于珠的免疫测定形式如实施例5(a)中所述的，所有测定步骤在96孔过滤板中进行。清洗溶液和测定标准如实施例5(a)中描述的制备，且如实施例1中描述的通过添加近端探针1和2修饰针对靶分析物的一对检测抗体。分析物被捕获到捕获珠上，如实施例5(a)中描述的。捕获珠包含锚定模块，固定化于珠表面为BSA-寡核苷酸缀合物，其中寡核苷酸选择为特异于滚环扩增子。使用的锚定寡核苷酸的序列为SEQIDNO：3。将二十五(25)μl的测定稀释剂、校正物、或样品(按适宜的稀释)与捕获珠的混合物混合。将混合物伴随振动温育1-3小时并清洗。将如上文描述制备的用近端探针1和2标记的检测抗体的溶液添加到混合物，并伴随振动温育1-2小时(或者，每一种检测抗体可以序贯添加，每次添加后是1小时温育)。添加如实施例1中描述的连接混合物。将该混合物与连接混合物在37C温育30分钟，清洗以除去过量的环化寡核苷酸，并在37C与RCA混合物温育1.5小时，其中RCA混合物在上文实施例1中描述。清洗混合物，添加荧光素-经标记检测探针的混合物并在37C温育30分钟，其中所述检测探针混合物在上文描述。清洗混合物并将颗粒抽吸到多通道荧光颗粒分析仪中。(c)基于珠的形式和将捕获分析物分子分到各个纳米孔中样品在100ul25％牛血清(2-4倍稀释)中制备，且将用捕获抗体包被的500K珠(顺磁2.7um，任选地荧光编码地)添加到样品中。将样品在23℃温育约2hr。将样品用PBS(5X，0.1％Tween-20)清洗3次，且添加经标记检测抗体的混合物(包含第一生物素化的检测抗体和缀合有半抗原的抗体的混合物)。将混合物在23℃温育约1hr。将混合物用PBS(5X，0.1％Tween-20)清洗3次，添加酶标记物，还添加链霉亲合素-beta-半乳糖苷酶(40pM)，抗半抗原缀合的酶，并将混合物在23℃温育约30min(或在Simoaanalyzer中3min)。将混合物用PBS(5X，0.1％Tween-20)清洗七次并添加酶底物15ul的试卤灵-beta-d-半乳吡喃糖苷(100uM，在加载缓冲液中)。引导混合物通过纳米孔的阵列(由Quanterix以DVD形式提供，从cyclicolefin聚合物制备，具有24-样品每盘)，允许放置约2分钟。将阵列用缓冲液冲洗，阵列用氟碳油密封，在23℃温育2-5min，并在多色荧光成像仪上读出结果。使用图像分析来对含有两种荧光酶产物的纳米孔的数目计数，由此提供与样品中分析物的浓度相关的值。(d)流动池分析的基于珠的免疫测定形式第一温育：10ul样品，生物素化的分析物特异性单克隆捕获抗体(工作溶液为2.6mg/l)，和各缀合于寡核苷酸的分析物特异性单克隆抗体的混合物(工作溶液为0.3mg/l)反应以形成夹心复合物。分析物特异性单克隆抗体的混合物如实施例1中制备，且该混合物包含缀合于近端探针1和2的一对抗体，如上文实施例1中描述的。第二温育：在添加用链霉亲合素包被的微颗粒(DynalM280，2.8um，0.72mg/ml，对生物素的结合能力470ng/mg)后，复合物经由生物素和链霉亲合素之间的相互作用变得结合于固相。将连接混合物添加到混合物，其中连接混合物依照实施例1中所述方案制备。将该混合物与连接混合物在37C温育30分钟，清洗以除去过量的环化寡核苷酸，并与RCA混合物，如实施例1中描述的。清洗混合物和添加用生物素标记的检测探针的混合物，并在37C温育30分钟，其中检测探针混合物如实施例1中所述制备。为了掺入电化学发光标记物SULFO-TAG(MesoScaleDiagnostics)，检测探针合成为具有末端生物素标记物且与用SULFO-TAG标记的链霉亲合素预结合。将反应混合物抽吸到测量孔，该处微颗粒被磁性捕获到电极的表面上。然后用ProCell(含TPA的缓冲液)除去未结合的物质。然后对电极应用电压诱导化学发光发射，对此通过光电倍增管测量。结果经由仪器特异地由2点校正生成的校正曲线和经由试剂条形码提供的主曲线(mastercurve)测定。实施例6.HIV-1P24的检测材料、方法和结果：将实施例1中描述的规程用于检测HIV-1p24。从混合HIV-1的滴定性能组(可获自SeracareLifeSciences,www.seracarecatalog.com)、HIV-1血清转化组(也可获自SeracareLifeSciences)、HIV抗体阳性样品(可获自ProMedDx,LLC,www.promeddx.com)、和正常匹配的样品(可获自Bioreclamation,www.bioreclamation.com)测试约64份血清或血浆样品。依照上文所述规程进行的HIV-1p24测定的校正曲线显示于图12。发现测定的LOD为1.3fg/mL，LLOQ为3.0fg/mL且ULOQ为37,500fg/mL。对于25uL样品1.3fg/mL的检测限对应于约650个p24分子，且每个病毒颗粒(分子)产生约2000个p24蛋白拷贝。混合的滴定性能组PRA204(B)由具有通过商品化测定法(bioMerieux、PerkinElmer和Zeptometrix)对HIVp24抗原的反应性范围从较弱到较强阳性的10份标本的组组成。将两份阴性的标本包含在该组中。测定的结果显示于下表6：表6.对于大多数样品，HIVp24水平较高且高于ULOQ。所有10份阳性样品均为可检测的且与商品化的p24试剂盒是可比的，而阴性样品(基于商业测定法，分别为PRA204(B)-10和-20)相当低，分别为约3和2fg/mL。血清转化组的分析结果显示于图13。发现3抗体测定形式与PCR一样灵敏且第一阳性样品的检测前时间中估测的延迟和来自PRB948和PRB962组的两种样品中的p24水平与PCR试剂盒可比，且比其他商业p24测定性能更好。数据显示于表7。表7.AbbottBBI指AbbottBBIHIV-1抗原测试。CoulterBBI指CoulterBBIHIV-1抗原测试。DuPontBBI指DuPontBBIHIV-1抗原测试。Inno.指InnogeneticsR129HIV-1抗原测试。RochePCR指RochePCRHIVRNABBItest。Coulter指CoulterELISAHIV-1抗原测试。PE指PerkinElmerELISAHIV-1抗原测试。Zepto.指ZeptometrixELISAHIV-1抗原测试。RocheUltra指RocheUltrasensitiveHIV-1RNA测试。Rochestandard指theRochestandardHIV-1RNA测试。BLD＝低于检测限和NT＝未测试。结论：新近感染HIV的患者不成比例地促进该疾病的传播。病毒负载在感染后头几周较高，而且新感染的患者不太可能知晓他们被感染且可能将疾病传给他人。因此，对急性HIV感染的早期检测对于公共健康具有极大重要性。PCR方法就灵敏性而言是金标准；它们能检测少至60个HIVRNA拷贝每mL血清或血浆(30病毒颗粒每mL)。然而，PCR技术是复杂且昂贵的，因此不适用于所有背景。免疫测定法是更简单和便宜的，但目前第4代p24免疫测定法的检测限仅为约10pg/mL，或约250百万壳体蛋白质每mL。在按病毒的基础上，这些免疫测定法比PCR测试灵敏性低几千倍，尽管事实上有约2,000p24个壳体蛋白质每病毒。如本文描述的，开发了基于MSD的MULTI-技术的下一代电化学发光测定形式并表征了其性能。这一新的p24免疫测定法的检测限为约1fg/mL，比目前的p24免疫测定法灵敏10,000倍。1fg/mL的灵敏度对应于我们25uL的样品体积中低于1个病毒颗粒。定量的下限和上限分别为3fg/mL和38,000fg/mL。板内CV为7％，且总CV为15％。加标回收(Spikerecovery)和稀释线性为80％至120％。p24在32名明显健康的供体的血清或血浆中未检出。混合p24的滴定组显示3-ABHIVp24测定与商业p24免疫测定之间的较好相关性。测试了两个血清转化组：SeraCarePRB948(第0和18天，PCR阴性；第22和23天，PCR阳性)和PRB962(第0和2天，PCR阴性；第7、9、14和17天，PCR阳性)。在两种情况中，3ABHIVp24测定结果对于所有PCR阴性样品为阴性且对于所有PCR阳性样品为阳性，且感染在常规p24免疫测定之前很早就检测到。结论是，本文中描述的3-ABHIVp24免疫测定比目前的p24ELISA的限度灵敏10,000倍，且与PCR测定的灵敏性是可比的。该测定法不需要专门的设备且可在MESOTMQuickPlexSQ120和成像仪上运行。实施例7.分析物的浓缩，随后是3-ABRCA/PLA测定(a)实验条件显示于如下表8(a)中：表8(a).对于捕获相对短的寡核苷酸近端探针序列(例如9-13个核苷酸长)而言，制备与近端探针序列的一部分互补的捕获寡核苷酸并在3’末端生物素化。表8(b)显示了近端探针和捕获寡核苷酸序列的细节：表8(b).计算的解链温度示于图8(c)中：以如下方式制备用捕获寡核苷酸修饰的珠子：涡旋后，将五十(50)ul的DynalMyOne链霉亲和素T1珠浆(beadslurry)加入到五个1.5mL的Eppendorf管中，每个具有用于分到两个结合条件实验所需的两倍的量。用1mlDiluent100(获得自MesoScaleDiscovery，Rockville，MD)洗涤三次珠子，且将1.2mL的每种捕获寡核苷酸，每种以200pmol/ml的浓度加入到每个小瓶中，所述每种捕获寡核苷酸溶于含有EDTA的Diluent100中。通过在室温下旋转1小时孵育溶液，并向每个管的溶液中掺入溶于含EDTA的Diluent100中的游离生物素至5nmol/mL。通过在室温下旋转15分钟孵育溶液，并用1mL的0.5MNaCl/BSA溶液洗涤珠子三次。将1mL0.5MNaCl/BSA加入管中，混合，且将每个捕获寡核苷酸-珠子混合物等分到2个小瓶中，总共10个小瓶。从所有小瓶中吸出溶液，并向每个捕获管中加入1mL溶于0.5M中以及1MNaCl/BSA中的1ug/mL(6.7pmol/mL)PP1(PP1序列，其结合到特异性针对HIVp24的检测抗体)。将溶液在室温下旋转孵育40分钟。每个管用盐溶液洗涤三次(不包括捕获寡核苷酸的对照不洗涤)。将7pg/mL的1mLHIVp24加入到四个管中，而将抗原从储液中加入到无捕获物的对照管中。将溶液在4℃下旋转孵育过夜，并将每个具有捕获寡核苷酸的管用盐溶液(各1mL)洗涤三次。将每个管用洗涤缓冲液(0.1XPBS，500mMNaCl，1mMEDTA，0.1％TritonX-100，2mg/mLBSA)充入至1/3，混合，然后将400uL珠子的等分试样加入到两个小瓶中用于2种释放盐条件，总共18个管。除了没有捕获物的对照管之外，从所有小瓶除去洗涤缓冲液，并向管中加入400uL0.0M和10mM盐缓冲液。将管的内容物混合，且将来自每个管(包括不含捕获物的对照(beans))的100ul的等分试样加入到三个基质板中以用于分析三种温度释放条件。所述板分别在25C、30C和37C下在热振荡器(thermoshaker)中混合5分钟。磁力分离珠子，且将25uL的上清液加入到测定板的孔中，所述板加入有包括mIgG的5uL6XPBS(每个条件三个重复)。将板在室温下振荡温育1小时，并在PBS缓冲液中洗涤三次。如实施例1所述，每个位于板上的结合域包括捕获抗体和锚定部分，并且在孵育步骤之后，在每个结构域上形成复合物，其包括结合抗原的抗体，其结合具有PP1序列的检测抗体(除对照结合域外)。将用PP2(或对于对照的PP1+PP2)标记的检测抗体的溶液加入每个孔(25uL每孔)中，并震荡孵育1小时，之后洗涤。如实施例1所述，将连接混合物添加到每个孔并将板与连接混合物在室温下孵育30分钟，洗涤以去除多余的环化寡核苷酸，并与RCA混合物在37C下孵育1.5小时。洗涤所述板，并加入检测探针的混合物，并在37C下孵育30分钟。洗涤所述板并加入150μlMSD读数缓冲液(readbuffer)且立即在MSDSECTOR读数器上读数。该实验的结果显示于图14中。(b)进行另外的实验以进一步评价分析物的浓缩条件。一般实验条件描述于表9(a)中：涡旋后，将五十(50)ul的DynalMyOne链霉亲和素T1珠浆加入到微量离心管。用1mlDiluent100洗涤珠子三次，并将1mL的捕获寡核苷酸Cap1:9加入到包含EDTA的Diluent100中。溶液在室温下旋转孵育1小时，且在向溶液中掺入(spike)游离的生物素至10X过量，所述生物素溶于包含EDTA的Diluent100中。通过在室温旋转30分钟孵育所述溶液，并用1mL的洗涤缓冲液洗涤珠子三次。将一(1.0)mLPP1加入到结合缓冲液中，且在溶液室温下旋转孵育40分钟。用洗涤缓冲液洗涤所述管三次，且将1mLDiluent2加到珠子，混合，且所述珠子溶液被分配到12个管中用于抗原水平2-4的1X、0.5X、0.25X、和0.125X珠子-PP1浓度。将珠子-PP的所需体积转移到对照管。将HIVp24和Diluent2以所需的抗原和珠子-PP的终浓度加入到珠子溶液中，且总体积为5mL。加入(spike)无珠子对照管以包括仅1X浓度的游离的PP1和所有4种水平的抗原在4℃旋转过夜孵育所述管，并通过每次转移1mL的方式将5mL珠子缓冲液转移至1.5mLEppendorf管。用洗涤缓冲液洗涤每个管(洗涤三次)。不洗涤不含珠子的对照管。第三次洗涤后，将100uL的0盐缓冲液加入到测试管，并将500uL的0盐缓冲液加入到对照管，并将管在25℃下孵育6分钟。将上清液转移至测定板，并如实施例7(a)中那样分析。所述结果示于表9(b)-(c)中：表9(b)：表9(c)：在用磁珠分析物浓缩后观察到信号增加约50倍。非浓缩样品#1显示与对照#1信号相似的结果，这表明PP-抗原复合物的释放具有最高的效率。使用分析物预浓缩，实现了低于0.1fg/mL的检测，其与1病毒粒子/mL病毒载量(viralload)相当。相反，商业病毒测定可合理地检测约50个拷贝/mL，相当于25个病毒/mL。具有和不具有用于该实验的预浓缩的校正曲线显示在图15中。实施例8.使用珠子沉降(Settling)方案的3-ABRCA/PLA基于珠子的测定如实施例7所述进行IL-4的3-ABRCA/PLA测定，除了使用二氧化硅珠子(获得自_____)替代Dynabeads。RCA和检测温育在MSD大点多孔测定板(可得自MesoScaleDiscovery，Rockville，MD)中进行，在37℃静置。所述珠子不包括锚定试剂。在RCA孵育步骤期间，允许珠子通过重力缓慢沉降到孔的表面上，取决于溶液体积，大约沉降时间为5-8分钟。通过在摇摆斗离心机(swingingbucketcentrifuge)中旋转板来洗涤所述板。初步测试表明，在旋转后珠子均匀分散，只有很小的梯度穿过孔表面。用15对(vs.)90分钟的RCA孵育测试所述方案。发现了与磁力捕获相比，使用珠沉降方案的15分钟RCA孵育后测定的灵敏度和动态范围提高约10倍。使用90分钟的RCA孵育步骤进一步改善灵敏度(高达约50-100倍)。或者，如本文所述进行3-ABRCA/PLA测定，其中珠子包括锚定试剂，并在连接步骤期间加入封闭剂(约2.5mg/ml)以减少非特异性结合。可以使用多种封闭剂，包括但不限于，mBSA、剪切的多聚(A)、多聚BSA-I、mIgG、Tween、多聚BSA-II、酵母RNA、mBSA+多聚(a)，和/或多聚BSA+多聚(A)。实施例9.修饰的桥接免疫测定形式如上所述，实施例1中所述的方法用于使用TNFalpha模型系统的桥接和同种型Ig测定，使用HepB表面抗原的桥接和同型Ig测定，以及使用LymeC6的桥接和同种型Ig测定。对该程序的修改如图19所示，其中使用如下检测自身抗体(1901)：(i)PP2修饰的抗人Ig抗体(1902)，和(ii)PP1-标记的自身抗原(1903)，之后进行如实施例1所述的PLA-RCA。示于图19的形式还显示了使用靶向部分(1904)及其与自身抗原结合的互补体(1905)作为将捕获部分(在这种情况下为自身抗原)粘附到表面(1906)的手段。同样地，可以如实施例1所述进行抗体(例如自身抗体)的免疫测定，其中该抗体的抗原用作捕获部分(直接附接到表面或通过靶向部分及其互补体)，且两种检测物种是附接于PP1的同种型抗体，和附接于PP2的抗原(反之亦然)。形成夹心复合物，然后如实施例1所述的PLA-RCA。这些修饰的测定形式还可以包括锚定部分，以将扩增子粘附到表面。实施例10.用于产生接近连接滚环模板的生物合成方法可以生物合成生成接近连接滚环模板。该方法利用最初高度纯化和良好表征的模板，以在有效的基于溶液的连接和RCA反应系列中产生RCA产物。该方法也可以在珠子上进行以增强反应的选择性。在种子RCA模板的扩增后，使用独特的限制酶与短的合成序列组合对单链产物进行位点特异性切割。因此，RCA模板从其自身产物产生。对生物合成产生的RCA模板进行HPLC或凝胶纯化以产生包含100％正确的5’和3’末端的产物。该方法示于图20(a)中。该方法需要在RCA模板中添加限制性位点以在所需的连接位点处引导切割。限制酶，例如那些切割从距离限制性位点14-20个碱基的酶是优选的。或者，也可以使用该方法与来自M13噬菌体的单链DNA或类似物组合以毫克量产生单链模板。该方法可以避免进行RCA模板的基于RCA的扩增的需要，仅需要将模板克隆到M13载体中用于DNA的产生产。这在图20(b)中示出。实施例11.样品多重化(Multiplexing)本文所述方法用于基于使用光谱签名的多重化样品。多重化样品为使用者提供了进行内部校正和对照、降低成本和增加通量的能力。通过基于空间和光谱签名的独特签名(该分析物的编码)的对分析物进行多重化的能力也可以用于多重化样品。使用成像扩增产物的荧光染料比率编码(fluorescentdyeratiecoding)来多重化样品。对于样品中的每种分析物，使用能够产生独特的滚环产物的一组独特的测定试剂，每种可以用独特的检测寡核苷酸检测。一组独特的测定试剂的合成和使用可以根据描述的方法，例如实施例1中所述的方法进行。如图21所示，将含有感兴趣分析物的每个样品A和B与特异于该分析物的两种检测抗体孵育，每种具有独特的近端探针。该孵育步骤将一组独特的近端探针与该样品中的分析物连接，从而与分析物形成双抗体复合物并“编码(coding)”样品。在该温育后，合并编码样品，作为混合物加入到单个捕获抗体表面，孵育并洗涤。在洗涤步骤之后，加入捕获的三抗体复合物、用于每组近端探针的线性滚环模板，并使混合物进行如实施例1所述的杂交条件。连接该混合物以产生滚环模板、洗涤、进行滚环扩增，和洗涤。每个滚环扩增子与互补且独特的检测寡核苷酸杂交，所述检测寡核苷酸用基于两种或更多种荧光标记比例的独特的光谱特征编码。在检测探针杂交后，对测定表面进行成像，并且基于其光谱特征(例如2种或更多种荧光标记物的比率)对每个滚环产物进行解码，并计数。这允许确定多个样品中的分析物水平。使用这种方法，用户可以组合样品和分析物多重化，允许在测试和对照样品中同时测试多种分析物。实施例12.脂蛋白复合物的检测本文所述的方法用于检测和定量存在于脂蛋白复合物(例如HDL和LDL)中的蛋白质复合物组。例如，使用实施例1中描述的方法，在脂蛋白复合物内检测三种不同的蛋白质和/或表位，并因此可以分析患者脂蛋白内的蛋白质谱。在人体中，血液脂蛋白分为5个主要组，HDL、LDL、IDL、VLDL和乳糜微粒。其中，HDL和LDL级分作为心血管健康的风险标志物已经获得了最多的临床兴趣。这些关键脂蛋白由多种蛋白质和脂质的复合物组成。与这些脂蛋白相关的蛋白质由对其功能构成所必需的蛋白质以及乘客蛋白(passengerproteins)组成。这些脂蛋白也可以进行修饰，例如氧化，其修饰个体的风险特征(profile)。例如，较高水平的氧化HDL和LDL与不良心血管事件的风险增加相关。LDL通常由两种核心蛋白Apo(a)和ApoB以及脂质组成。升高的Apo(a)与心脏病的风险增加相关；此外，Apo(a)蛋白的长度变化也与改变的风险特征相关。Apo(a)蛋白的尺寸由于尺寸多态性而不同，这是由LPA基因中可变数目的所谓的kringle重复引起的。LDL颗粒中的ApoB携带配体，其针对各种组织中的LDL受体。高水平的ApoB也与斑块形成相关，导致心血管疾病。HDL通常由一组核心蛋白组成，包括；ApoA1、ApoE、ApoC和ApoA-II。除了这些核心蛋白，还已知HDL与也具有临床价值的另外的蛋白质相关。例如，HDL相关的SAA和SP-B已经被证明与心脏事件和死亡率相关。通过升高的ApoA-II的HDL组成的变化也已经与致动脉粥样硬化风险相关。下列步骤描述于图1中，用于脂蛋白复合物的多重化接近测定如图22所示进行。图22例示了HDL脂蛋白复合物的检测，其中对每种核心蛋白特异性的捕获抗体固定到表面以将脂蛋白复合物结合到表面。添加对其他核心蛋白特异性的检测抗体，每种检测抗体带有近端探针。如实施例1中所述完成测定。本发明在范围上不受本文描述的具体实施方案的限制。事实上，除了本文描述的那些以外的对方法的多种修改将是本领域技术人员从前述说明和所附附图来看明显的。这类修改意图落入权利要求的范围内。本文中引用了多种出版物，其公开内容通过提述完整并入本文。参考文献1.美国专利No.7,306,9042.美国专利No.7,320,8603.美国专利No.7,351,5284.美国专利No.7,192,7035.美国专利No.6,878,5156.Zhou等,GenomeBiology(2004),5:R287.Dean等,GenomeResearch(2001),11:1095-10998.Soderberg等,Methods(2008),45:227-2329.Fredriksson等,NatureBiotech(2002),20:473-47710.Fredriksson等,NatureMethods(2007),4(4):327-32911.Vincent等,EMBOReports(2005),5(8):795-80012.Gajadjar等,Biotechniques(1010),48(22):145-15213.Schallmeiner等,NatureMethods(2007)4(2):135-13714.Ericsson等,Nucl.AcidsResearch(2008),36(8):e4515.Darmanis等,Biotechniques(2007),43:443-45016.Dahl等,Proc.Natl.Acad.Sci.(2004),101(13):4548-455317.Weibrecht等,ExpertRev.Proteomics(2010),7(3):401-40918.Spits等,NatureProtocols(2005),1(4):1965-197019.Nordengrahn等,Vet.Microbio(2008),127:227-23620.Vuoriluoto等,Mol.Oncology(2011),5:105-11121.Zhang等,ClinicaChimicaActa(2006),363:61-7022.Andras等,Mol.Biotech.(2001),19:29-4423.Schweltzer等,Proc.Natl.Acad.Sci.(2000),97(18):10113-1011924.Jeong,等,Cell.Mol.LifeSci.(2009),66:3325-333625.Gill等,Nucleosides,Nucleotides,andNucleicAcids(2008),27:224-24526.Gullberg,等,CurrentOp.inBiotech.(2003),14:82-8627.Gustafsdottir,等,ClinicalChemistry(2006),52(6):1152-116028.美国专利公开No.2010007586229.美国专利No.8,222,04730.美国专利No.8,236,57431.美国专利No.8,338,77632.美国专利公开No.2011021253733.美国专利公开No.2012019677434.美国专利公开No.2012028942835.Kopecky,C.,等,Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2014Nov.2536.Watanabe,J.,等,ArthritisRheum.2012Jun；64(6):1828-3737.Ribas,V.,等,Circ.Res.2004Oct.15:95(8):789-97序列表<110>中尺度技术有限责任公司<120>改进的测定方法<130>31085<150>61/993,581<151>2014-05-15<150>62/013,823<151>2014-06-18<150>62/048,489<151>2014-09-10<150>62/049,520<151>2014-09-12<150>62/055,093<151>2014-09-25<160>22<170>PatentInversion3.5<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>Thiol-修饰的近端探针1<220><221>修饰的碱基<222>(33)..(35)<223>um<400>1aaaaaaaaaagacgctaatagttaagacgcttuuu35<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>Thiol-修饰的近端探针2<400>2aaaaaaaaaatatgacagaactagacactctt32<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>锚定寡核苷酸<400>3aagagagtagtacagcagccgtcaaaaaaaaaaaa35<210>4<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1<400>4ctattagcgtccagtgaatgcgagtccgtctaagagagtagtagagcagccgtcaagagt60gtcta65<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2<400>5gttctgtcatatttaagcgtcttaa25<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>检测探针<400>6cagtgaatgcgagtccgtct20<210>7<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>检测寡核苷酸<400>7acatcggtagtt12<210>8<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸<220><221>polyA_位点<222>(1)..(10)<220><221>修饰的碱基<222>(34)..(34)<223>gm<220><221>修饰的碱基<222>(35)..(36)<223>um<400>8aaaaaaaaaacactaagctgttagtccattaccguuu37<210>9<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸2<220><221>polyA_位点<222>(1)..(10)<400>9aaaaaaaaaagctggaggttcagacgattttgcg34<210>10<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1a<400>10aacagcttagtgacatcggtagttaacagattgatcttgacacatcggtagttcgcaaaa60tcgtc65<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2a<400>11tgaacctccagctttcggtaatggact27<210>12<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>锚定寡核苷酸<400>12acagattgatcttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa35<210>13<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸1<220><221>polyA_位点<222>(1)..(10)<220><221>修饰的碱基<222>(34)..(34)<223>tm<220><221>修饰的碱基<222>(35)..(36)<223>um<400>13aaaaaaaaaaagagtccagaggcaaagcgtgaatuuu37<210>14<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸2<220><221>polyA_位点<222>(1)..(10)<400>14aaaaaaaaaagataaggaaggggccttagcgaca34<210>15<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1b<400>15cctctggactctacatcggtagtttggaacattttattctaacatcggtagtttgtcgct60aaggc65<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2b<400>16cccttccttatctttattcacgctttg27<210>17<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>锚定寡核苷酸<400>17ggaacattttattctaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa35<210>18<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸1<220><221>polyA_位点<222>(1)..(10)<220><221>修饰的碱基<222>(34)..(34)<223>tm<220><221>修饰的碱基<222>(35)..(36)<223>um<400>18aaaaaaaaaaaacaactccgattgcttgcttcttuuu37<210>19<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>近端寡核苷酸2<220><221>polyA_位点<222>(1)..(10)<400>19aaaaaaaaaatagccctacgtgccctgcatagac34<210>20<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-1c<400>20atcggagttgttacatcggtagttcgcgcaggtcgggaattacatcggtagttgtctatg60caggg65<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>Circ-2c<400>21cacgtagggctatttaagaagcaagca27<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>锚定寡核苷酸<400>22gcgcaggtcgggaataaaaaaaaaaaaaaaaaaaa35当前第1页1 2 3