用于确定吸收谱带的方法与流程

本发明涉及一种用于在光谱中确定至少一个吸收谱带的方法。本发明还涉及一种用于三维成像三维样品的方法。本发明还涉及相关的谱仪和计算机程序产品。

背景技术：

生物样品是包括不同细胞群和化合物的生物组织。每个细胞群表现出特定的代谢和生物化学特性，其被组织和/或分布在三个维度。每个化合物影响所分析的组织的整体状态。因此，希望在三个维度上研究生物样品中这些化合物和不同细胞群的演变。

为跟踪组织化合物的演变，已知有组织病理学技术。组织病理学是指为了研究疾病的表现对组织进行的显微检查。具体来说，在临床医学中，组织病理学是指手术样品经处理并将组织切片置于玻璃片上之后，由病理学家所做的活检或手术样品检查。相反，细胞病理学检查自由细胞或组织片段。

免疫组织化学和免疫荧光法是两种广泛应用的组织病理学技术。

免疫组织化学或IHC指利用抗体结合的原理特别是生物组织中的抗原检测在组织切片的细胞或间质化学物中的标志-主要是抗原-的过程。Albert Coons博士在1941年提出该过程的概念并首次实现。可视化抗体-抗原的相互作用可以通过多种方式实现。在最常见的例子是，抗体与酶结合，如过氧化物酶，其可以催化着色反应。

另外，抗体也可以标记有荧光基团，如荧光素或罗丹明。该技术被称为免疫荧光法或IF。因此，这项技术是一种广泛使用的免疫标记的例子以及免疫组织化学的特定例子，其利用荧光显示抗体的位置。免疫荧光法可用于组织切片、所培养的细胞系或单个细胞，并且可以用来分析蛋白质、多糖和小生物分子和非生物分子的分布。免疫荧光法可以和其他荧光染色的非抗体方法组合使用，例如利用DAPI标记DNA。多种显微镜的设计可用于分析免疫荧光样品；最简单的是荧光显微镜，共聚焦显微镜也被广泛使用。也可以使用具有高分辨率的多种超分辨率显微镜设计。

然而，免疫组织化学和免疫荧光法是组织病理学成像技术，其不对所分析的组织中的空间有序的化学品和细胞化合物提供分析方法。此外，这些技术不能提供对样品含量的定量测量。由于标志之间的兼容性差，这些技术在单一样品上的所分析的化合物的数目上也受到限制。

通过光谱技术可以显著提供对样品含量的这种定量且更全面的测量。根据定义，光谱学是在宽的波长区域上对物质和辐射能量之间的相互作用的研究。因此，多个实验技术是光谱学技术。红外光谱、拉曼光谱、质谱、X射线荧光都是提供对样品含量的定量测量的光谱技术的例子。

最近的举措已经表明，可以通过堆叠组织切片的二维图像重建三维红外成像。在B.R.Wood等人的文章中特别描述了这种技术的一个例子，标题是“A three-dimensional multivariate image processing technique for the analysis of FTIR spectroscopic images of multiple tissue sections”，发表于BMC Med Imaging，6(12)，1(2006)。

也提出了为了层析重建，从相同样品体积，共同添加几个视图角度。这种方法是从M.C.Martin等人的文章中演变而来，标题是“3D spectral imaging with synchrotron Fourier transform infrared spectro-microtomography”，发表于Nat Methods，10(9)，861(2013)。

使用同步辐射被认为是用于获得高信号/噪声值的硅碳棒资源的有价值的替代选择，其在三维重建中限制了定量人为产物。这种想法是从C.Petibois等人的文章中演变而来，标题是“A bright future for synchrotron imaging”，发表于Nat Photonics，3(4)，179(2009)。这种思想也可以从F.Jamme等人的文章中发现，标题是“Synchroton infrared confocal microscope：Application to infrared 3D spectral imaging”，发表于J Phys：Conf Series，425(142002)，1(2012)。

然而，使用这种技术意味着使用具有相对高功率的辐射源。用于X射线荧光光谱分析或质谱离子源的同步加速器是这种辐射源的例子。这种功率源的使用限制了在诊所中光谱技术的演变。值得注意的是，不易获得的同步加速器设施，阻止了考虑使用隐含同步辐射源的技术。还必须提到的是，这样的红外源被认为不够稳定以允许持久的光谱数据采集，其因此限制了在高光谱和像素分辨率时分析大型组织样品的能力。

此外，在诊所中使用的探测装置通常是小尺寸的，从而限制了对小的样品区域或体积的成像方法的适用性。

此外，这种技术还不适用于那些不是这些技术的应用专家的终端用户，即除医生和生物学家以外的终端用户。

此外，上述技术都不能够实现大尺寸的三维样品成像，即，例如，1cm³体积的手术切除活检。

在其他领域，特别是对于气体，已知的文件WO 2009/140492 A2和US 2012/065948 A1中提到，其目的是检测化合物。

技术实现要素：

因此需要一种至少部分地消除了上述缺陷的、用于确定来自样品中存在的化学物质的共价键的吸收谱带的方法。

为此本发明提出了一种用于确定光谱中至少一个吸收谱带的方法，光谱是在波长量的预设范围中吸收量关于波长量的演变，吸收量是表征吸收的量，波长量是表征波长的量，每个吸收谱带是与样本中存在的化学物种类的至少一个共价键相关联的一种数学分布，所述数学分布以数学参数为其特征，所述方法至少包括步骤：

-自样品提供测量得到的吸收光谱，

-提供与测量得到的吸收光谱相等的计算光谱，

-从计算光谱中提取至少一个吸收谱带，

-通过集合各个提取得到的吸收谱带形成吸收谱带群，

-通过从计算光谱中去除各个提取得到的吸收谱带计算剩余光谱，

-测试剩余光谱是否满足预设的停止准则，

-如果不满足停止准则，则使用剩余光谱作为计算光谱并重复提取步骤、形成步骤、计算步骤和测试步骤，在重复的步骤结束时提取得到的吸收谱带(一个或多个)不同于先前提取得到的吸收谱带(一个或多个)，以及

-如果满足停止准则，则输出每个提取得到的吸收谱带。

与文件WO 2009/140492 A2相比，应强调的是，本发明的方法应用于吸收谱带，而不是单一谱线(因为它是气体背景下的情况)。此外，在文件中没有提到，剩余光谱(即，误差谱)被用于校正所生成的谱带，并通过采用迭代方法生成新的谱带。

和文件2012/065948 A1相反，本发明的方法确定吸收谱带并且使用剩余光谱来校正所生成的谱带，以及通过采用迭代方法生成新的谱带。

因此，这种方法能提高化学物种类测定的准确性。

这与生物样品更有关系。在通常情况下，生物样品是固体或液体，这使样品含量的分析相当困难。值得注意的是，文件WO 2009/140492 A2和US 2012/065948 A1不便于这种使用。[连同生物学的上下文中避免使用这些文件的论述]。

根据有利而非强制的另一方面，用于确定与样品的化学物种类中存在的共价键相关联的至少一个吸收谱带的方法可能包括下列特征中的一个或以任何允许组合的几个：

-样品是生物样品；

-分布图在高斯线型、洛伦兹线型和Voigt线型中选择，Voigt线型以高斯比例和洛伦兹比例为特征；

-一个数学参数是吸收谱带的位置，该位置是所考虑的吸收谱带的吸收量的最大绝对值的波长量；

-一个数学参数是吸收谱带的宽度；

-提取步骤包括在计算光谱中搜索吸收谱带(一个或多个)，以得到所发现的吸收谱带(一个或多个)，并推导每个所发现的吸收谱带的数学参数的值，以得到推导得出的参数；

-提取步骤包括执行在组中选择的步骤，该组包括获得计算光谱的最大值，计算吸收量关于波长量的一阶导数以获得计算光谱的一阶导数，计算吸收量关于波长量的二阶导数以获得计算光谱的二阶导数，并且获得计算光谱的二阶导数的最小值，该二阶导数是吸收量关于波长量的二阶导数；

-提取步骤进一步包括使用吸收谱带的推导得到的参数和分布曲线拟合每个吸收谱带；

-停止准则在组中选择，该组包括：

·剩余光谱中吸收量在波长量预设范围内的积分严格低于测量得到的吸收光谱中吸收量在波长量预设范围内的积分乘以1％；

·剩余光谱中吸收量在波长量预设范围内的积分严格低于测量得到的吸收光谱中吸收量在波长量预设范围内的积分乘以0.1％；

·剩余光谱中每波长量的吸收量的绝对值严格低于测量得到的吸收光谱中每波长量的吸收量的绝对值乘以1％；

·剩余光谱中每波长量的吸收量的绝对值严格低于测量得到的吸收光谱中每波长量的吸收量的绝对值乘以0.1％；

·在波长量预设范围内，在在剩余光谱中的吸收量和在测量得到的吸收光谱中的吸收量之间的比率严格低于1％；

·在波长量预设范围内，在在剩余光谱中的吸收量和在测量得到的吸收光谱中的吸收量之间的比率严格低于0.1％；和

·上述停止准则的任意组合。

-该方法还包括如果不满足停止准则，则使用剩余光谱校正每个先前提取得到的吸收谱带的步骤；

-每个吸收谱带具有位置和带有端点的宽度，校正步骤包括，对每个提取得到的吸收谱带，确定剩余光谱在所考虑的吸收谱带的位置上和/或在考虑的吸收谱带的宽度的端点上的代数符号；

-每个吸收谱带具有位置和带有端点的宽度，校正步骤包括，对每个提取得到的吸收谱带，分析剩余光谱关于每个所考虑的吸收谱带的位置的对称性；

-当使用剩余光谱作为计算光谱重复提取步骤、形成步骤、计算步骤和测试步骤时满足停止准则，则不再修改先前确定的谱带的参数且没有新的谱带被加入到先前得到的吸收谱带群。

还提出了一种用于三维成像三维样品的方法，该方法至少包括以下步骤：将三维样品划分为多个二维样品；执行用于针对每个二维样品确定至少一个吸收谱带的方法，该方法如上所述，以针对每个二维样品获得与至少一个共价键相关联的至少一个吸收谱带；并且采用针对每个二维样品的所获得的吸收谱带重构三维样本。

本文还提出了一种谱仪，包括辐射源、向样品传输辐射源发出的辐射的光学组件、样品保持器、探测装置和适用于执行如上文所述方法的计算器。

本文还涉及一种计算机程序产品，包括计算机可读介质，其上具有包括程序指令的计算机程序，当数据处理单元运行计算机程序时，计算机程序可被加载到数据处理单元中并适于执行上述方法。

附图说明

在下述描述的基础上能更好地理解本发明，并以示例性的例子对应于附图给出下述描述，但并不限制本发明的对象。在附图中：

图1是一个系统和一个计算机程序产品的示意图，它们的交互使得能够执行用于在光谱中确定至少一个吸收谱带的方法，

图2是执行用于在光谱中确定至少一个吸收谱带的方法的一个例子的流程图，

图3是执行用于确定至少一个吸收谱带的方法的另一个例子的流程图，

图4是吸收光谱的图示，其是吸光度关于波数的演变，

图5是吸光度关于波数的二阶导数关于波数的演变的图示，

图6是吸光度关于波数的演变和吸收光谱中的不同的识别出的吸收谱带的图示，以及

图7是谱仪的示意图。

具体实施方式

图1示意了系统10和计算机程序产品11。在计算机程序产品11和系统10之间的交互使得能执行用于在光谱中确定至少一个吸收谱带的方法。这在图1中用两个框12和13表示。第一个框对应于输入，在此上下文中，即光谱。第二个框对应于输出，在此上下文中，即吸收谱带。在本说明书其余部分中，用于在光谱中确定至少一个吸收谱带的方法被命名为用于确定吸收谱带的方法。

系统10是计算机。在这一例子中，系统10是笔记本电脑。

更一般的，系统10是计算机或计算机系统，或类似的电子计算装置，其适用于操纵和/或将在计算系统的寄存器和/或存储器中的表现为物理量，例如电子量的数据转换为在计算系统的存储器、寄存器或其他这种信息存储、传输或显示装置中的同样表现为物理量的其他数据。

系统10包括处理器、键盘14和显示单元16。

该处理器包括数据处理单元、存储器和适用于读取计算机可读介质的读取器。

计算机程序产品11包括计算机可读介质。

计算机可读介质是可由处理器的读取器读取的介质。该计算机可读介质是适用于存储电子指令的介质，并且能够耦合到计算机系统总线上。

这样的计算机可读存储介质例如是磁盘、软盘、光盘、光盘只读存储器、磁光盘、只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)、电可编程只读存储器(EPROM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、磁性或光学卡或任何其他类型的媒质，适用于存储电子指令，并能够被耦合到计算机系统总线。

计算机程序存储在计算机可读存储介质中。该计算机程序包括一个或多个存储的程序指令序列。

计算机程序可被加载到数据处理单元，当数据处理单元运行该计算机程序时，适用于执行用于确定吸收谱带的方法。

现参照图2的流程图描述系统10的运转，图2示意了执行用于确定吸收谱带的方法的一个例子。

每个吸收谱带是与样品中存在的化学物种类的共价带相关联的一种数学分布。

根据定义，共价键是指原子间共享电子对的化学键。当原子共享电子时，原子之间的吸引力和排斥力的稳定平衡被称为共价键合。对于许多分子来说，电子的共享允许每个原子实现与稳定的电子结构一致的相当于完整的外壳。

共价键包括许多种类的相互作用，包括σ键、ττ键、金属键、抓氢键和三中心两电子键。

共价键适用于两个或多个相同的原子、两个不同的原子或不同类型原子的任何其他组合。在超过两个原子上共享电子的共价键被称为是离域的。

吸收发生所处的频率以及它们的相对强度主要取决于样品的电子和分子结构。频率也将取决于样品中的化合物之间的相互作用、固体中的晶体结构、超分子组织(聚合物、分子间键)和一些环境因素(例如，温度、压力、电磁场)。吸收谱带也具有宽度和形状，主要取决于光谱密度或系统的态密度。

吸收谱带通常由分子或原子中的量子力学变化的性质分类。例如，当分子的旋转状态变化时，出现旋转谱带。旋转谱带通常在微波光谱区域发现。振动谱带对应于分子的振动状态变化，通常在红外区域中发现。电子带对应于原子或分子的电子态变化，通常在可见光和紫外区域中发现。X射线吸收与原子中的内层电子激发相关。这些变化也可以结合起来(如旋转振动跃迁)，两个变化的结合能会导致新的吸收谱带。

与量子力学变化相关的能量主要决定吸收谱线的频率，但频率可以由几种类型的相互作用移动。电场和磁场会引起频率移动。与邻近分子的相互作用可能导致频率移动。例如，气相分子的吸收谱带可以显著移动，当该分子是液相或固相并与相邻分子更强烈地相互作用时。

所观察的吸收谱带总是具有宽度和形状，这是由用于观察的仪器、吸收辐射的材料和材料的物理环境所决定的。因此，吸收谱带的数学分布是特征为数学参数的分布图。分布的例子例如是高斯或洛伦兹分布。数学参数的例子则是强度和宽度。

在当前情况下，每个吸收谱带有延伸于两个端点间的宽度。宽度定义为在极大值一半时的全宽(也标为FHWM)。这样的宽度对应于函数的范围，由自变量的两个极值之差给出，其中应变量等于其最大值的一半。换句话说，宽度是由与它端点相关联的两个特定波长量定义。

样品优选为生物样品或任何其他含有机物的样品。其中尤其包括生物组织和细胞、合成生物材料、植物种类、含油母质样品(沥青砂、化石、沥青...)以及工业材料(胶、聚合物、塑料、橡胶、油漆、胶水...)。

用于确定吸收谱带的方法包括步骤50，自样品提供测量得到的吸收光谱。

测量得到的吸收光谱在本说明其余部分标为S_MEASURED。

根据定义，光谱是一组光谱数据，其代表在波长量的预设范围中的吸收量关于波长量的演变。

吸收量是代表吸收的量。例如，吸收强度或吸光度为吸收量。

波长量是代表波长的量。例如，频率、波数、波长为代表波长的量。

波长量的预设范围代表可用数据的波长域。

本说明中的其余部分中，例如，吸收量被认为是吸光度，且波长量被认为是波数。然而，与吸光度相关的每个特征可应用于另一个吸收量。同样，与波长量相关的每个特征可应用于另一个波长量。因此，在本说明其余部分，吸收光谱被认为是一组光谱数据，其表示在波数的预设范围内吸光度关于波数的演变。

吸收光谱指的是测量辐射的吸收的光谱技术，由于与样品的相互作用，吸收光谱是频率或波长的函数。样品从辐射场吸收能量，即光子。吸收量作为波长量的函数而变化，这种变化就是吸收光谱。因此，吸收光谱在整个电磁频谱上执行。

这意味着，波数的预设范围一般可以是电磁频谱的任意部分，如可见光、紫外和红外部分。

优选地，波数的预设范围使得吸收光谱是红外光谱。

更优选地，波数的预设范围在7000cm^-1和10cm^-1之间延伸(这对应于包括在1.5微米和1000微米之间的波长的范围)。

有很多实验方法来测量吸收光谱。最常见的布置是在样品上直接产生辐射束，并检测穿过它的辐射强度。所发射的能量可用于计算吸收。源、样品布置和检测技术根据频率范围和实验目的可以有显著不同。

因此，步骤50自样品提供测量得到的吸收光谱通过提供能从中获得吸收光谱的任意光谱来实现。

值得注意的是，吸收光谱可以来自于透射光谱。事实上，吸收和透射光谱表示出等效信息，且一个可以从另一个通过数学变换计算得出。透射光谱在吸收最弱的波长处具有最大强度，因为更多的光传输通过样品。吸收光谱在吸收最强的波长处具有最大强度。

替代地，吸收光谱来自于发射光谱的结果。发射是物质以电磁辐射形式释放能量的过程。发射可以发生在吸收可以发生的任何频率处，这使得吸收谱线能由发射光谱来确定。但发射光谱通常会有完全不同于吸收光谱的强度图形，所以这两个光谱不等价。采用适当的理论模型和关于物质的量子力学状态的额外信息，吸收光谱可以由发射光谱计算出来。

根据另一个实施例，吸收光谱可以获自于散射或反射光谱。材料的散射和反射光谱受其折射率和吸收光谱的影响。在光学方面，吸收光谱通常是用消光系数量化，且消光系数和指数系数是通过Kramers-Kronig关系定量相关。因此，吸收光谱可以获自于散射或反射光谱。这通常需要简化假设或模型，因此由此得到的吸收光谱是近似。

在优选的实施例中，步骤50自样品提供测量得到的吸收光谱通过在样品上进行吸收实验取得。

进行这样的吸收光谱实验的最简单的方法是用源产生辐射、用探测装置测量该辐射的参考光谱、然后在将感兴趣的材料放置于源和探测装置之间之后重新测量样品的光谱。然后将两个测量得到的光谱结合以确定材料的吸收光谱。单独的样品谱不足以确定吸收光谱，因为它受到实验条件源光谱、在源和探测装置之间的其他材料的吸收光谱以及探测装置的取决于波长的特性的影响。参考光谱也因这些实验条件以同样方式受到影响，因此，组合产生单独的材料吸收光谱。

用于确定吸收谱带的方法包括步骤52，提供等于测量得到的吸收光谱S_MEASURED的计算光谱S_CALCULATION。

在数学上，这意味着S_CALCULATION＝S_MEASURED

换句话说，对于所研究的光谱的每个波数，在计算光谱S_CALCULATION中和在测量得到的吸收光谱S_MEASURED中的吸光度的值相同。

用于确定吸收谱带的方法还包括步骤54，提取与样品中存在的共价键相关联的至少一个吸收谱带。利用计算光谱S_CALCULATION执行提取步骤54。在上下文中，“提取”可以理解为“建模”的意义。

步骤54提取至少一个吸收谱带可选地包括提取针对每个所考虑的吸收谱带的宽度。

用于确定吸收谱带的方法还包括步骤55，通过集合每个提取得到的吸收谱带形成吸收谱带群。

换句话说，这意味着，吸收谱带群是在提取步骤54中提取得到的吸收谱带的集合。

用于确定吸收谱带的方法还包括步骤56，通过从计算光谱S_CALCULATION中去除每个提取得到的吸收谱带计算剩余光谱S_RESIDUAL。

用于确定的方法还包括步骤58，测试剩余光谱S_RESIDUAL是否满足预设的停止准则C_STOP。

根据一个实施例，当剩余光谱中吸光度在波数预设范围内的积分严格低于测量得到的吸收光谱中吸收度在波数预设范围内的积分乘以1％时，满足该停止准则C_STOP。根据定义，在本说明书其余部分，光谱中吸光度在波数预设范围内的积分即光谱中的吸光度在波数预设范围内关于波数的积分。

根据一个实施例，当剩余光谱中吸光度在波数预设范围内的积分严格低于测量得到的吸收光谱中吸光度在波数预设范围内的积分乘以0.1％时，满足停止准则C_STOP。

根据另一个实施例，当剩余光谱中每波数的吸光度的绝对值严格低于测量得到的吸收光谱中每波数的吸光度的绝对值乘以1％，满足停止准则C_STOP。

根据另一个实施例，当剩余光谱中每波数的吸光度的绝对值严格低于测量得到的吸收光谱中每波数的吸光度的绝对值乘以0.1％，满足停止准则C_STOP。

根据另一个实施例，在波数预设范围中，当在在剩余光谱中吸光度和在测量得到的吸收光谱中吸光度之间的比率严格低于1％时，满足停止准则C_STOP。

根据另一个实施例，在波数预设范围中，当在在剩余光谱中吸光度和在测量得到的吸收光谱中吸光度之间的比率严格低于0.1％时，满足停止准则C_STOP。

根据另一个实施例，当满足上述停止准则的任意组合时，满足停止准则C_STOP。

值得注意的是，特别感兴趣的是两个停止准则的组合。根据第一停止准则，剩余光谱中吸光度在波数预设范围内的积分严格低于测量得到的吸收光谱中吸光度在波数预设范围内的积分乘以0.1％。根据第二停止准则，在波数预设范围中，当在在剩余光谱中吸光度和在测量得到的吸收光谱中吸光度之间的比率严格低于1％时，满足停止准则。

如果不满足预设停止准则C_STOP，将剩余光谱S_RESIDUAL作为计算光谱S_CALCULATION使用。换句话说，计算光谱S_CALCULATION被设定为等于剩余光谱S_RESIDUAL。

在数学上，这意味着S_CALCULATION＝S_RESIDUAL。

换句话说，对于所研究的光谱的每个波数，在计算光谱S_CALCULATION中吸光度的值等于在剩余光谱S_RESIDUAL中吸光度的值。

然后在新计算得到的计算光谱S_CALCULATION上重复提取步骤54、形成步骤55、计算步骤56和测试步骤58。在提取步骤54的新的重复结束时提取得到的谱带不同于先前提取得到的谱带。这意味着，谱带不共享相同的端点。

如果满足预设的停止准则C_STOP，用于确定吸收谱带的方法还包括步骤60，输出每个提取得到的吸收谱带。

输出每个提取得到的吸收谱带的步骤60包括在每次重复中收集不同的提取到的吸收谱带并输出与提取到的吸收谱带相关的数据。

用于确定吸收谱带的方法得益于吸收技术所提供的所有优点。尤其是，光谱学作为分析技术的独特优势之一，其可以不引入仪器和样品发生接触进行测量。在样品和仪器之间传播的辐射包含光谱信息，因此可以远程测量。远程光谱感测在许多情况下是有价值的。例如，测量可以在有毒或危险的环境中进行，而无需将操作人员或仪器置于风险下。此外，样品材料不必接触仪器-防止可能的交叉污染。

用于确定吸收谱带的方法也可以更准确地确定所研究的样品中存在的共价键。

用于确定吸收谱带的方法利用了每个计算光谱有自己的谱带的事实，即第一计算光谱能得到第一系列的谱带，第二计算光谱能得到第二系列的谱带等等，每个系列的谱带是不同的或自完备的。因为具有较小光谱贡献的谱带能够和在光谱中的贡献处在相同数量级的谱带一起进行研究，这使得得以在每次重复中改善谱带的提取。

这种确定吸收谱带的方法是从吸收光谱中提取谱带的全面且自动的方法，特别是针对红外光谱。

现在，参照图3到图6所描述的是执行用于确定吸收谱带的方法的另一个例子。

根据图3所示的例子，用于提取吸收谱带的方法包括步骤100，自样品提供测量得到的吸收光谱S_MEASURED。

对于步骤50从样本中提供测量得到的吸收光谱S_MEASURED所做的同样论述也适用于步骤100从样本中提供测量得到的吸收光谱S_MEASURED。因此，此处不重复这些论述。

根据如图3所示的例子，用于提取吸收谱带的方法还包括步骤102，提取基线校正曲线。

根据一个实施例，通过使用对于所考虑的样品在其中是可预期不存在吸收的至少一个光谱间隔来确定基线校正曲线。根据定义，对于样品，在红外光谱中这样的光谱间隔没有吸收。

在这样的光谱间隔中存在的吸收是环境的存在的一种表现形式。这种存在扰乱吸收测量，应予以校正。

基线校正曲线是由插值确定，该插值考虑到光谱间隔在红外光谱中没有吸收。

优选地，插值设置为，与包括于4000cm^-1到3700cm^-1之间以及在2700cm^-1和1850cm^-1之间的光谱间隔相关联的吸光度应该为零。根据定义，如果值高于或等于A且如果值低于或等于B，则值被包括在A和B之间。

根据优选的实施例，插值还设置为，基线校正曲线为多项式。

优选地，基线校正曲线是低于4阶的多项式。

根据图3所示的例子，用于确定吸收谱带的方法还包括步骤104，提供等于在测量得到的吸收光谱S_MEASURED和基线校正曲线之间的差的计算光谱S_CALCULATION。

根据图3所示的例子，用于确定吸收谱带的方法还包括步骤105，从计算光谱S_CALCULATION中提取至少一个吸收谱带。

该提取步骤105包括在计算光谱中搜索吸收谱带(一个或多个)的步骤，以获得所发现的吸收谱带(一个或多个)，以及推导出每个所发现的吸收谱带的数学参数的值的步骤，以获得推导得出的参数。

如下所述，该提取步骤105也可以包括在组中选出的步骤，组包括得到计算光谱的最大值、计算吸收量关于波长量的一阶导数以获得计算光谱的一阶导数、计算吸收量关于波长量的二阶导数以获得计算光谱的二阶导数、并且得到计算光谱的二阶导数的最小值，该二阶导数是吸收量关于波长量的二阶导数。

在图3所示的例子中，提取步骤105包括以下五步：步骤106、108、110、112和114，下文将详述。

根据图3所示例子的用于确定吸收谱带的方法还包括步骤106，在计算光谱S_CALCULATION中搜索吸收谱带。

该搜索步骤106可依靠在计算光谱S_CALCULATION中搜索局部最大值。

对于每个局部最大值，在存储器中存储该局部最大值的位置。这个局部最大值的位置通常统一以波长量表示。

有多种方法用于确定计算光谱S_CALCULATION中局部最大值的存在。

图4示意了图形化方法，其中通过各自的箭头指出吸收值的各个局部最大值。

根据一个更复杂的实施例，只考虑高于吸光度阈值的局部最大值。这能够只考虑最相关的局部最大值。

根据图3所示例子的用于确定吸收谱带的方法还包括步骤108，计算吸光度关于波数的二阶导数，以获得计算光谱的二阶导数S”_CALCULATION。

根据图3所示例子的用于确定吸收谱带的方法还包括步骤110，推导与步骤106搜索吸收谱带时得到的局部最大值对应的吸收谱带的参数。

例如，推导出的参数从组中选择，该组包括谱带中最大吸光度的位置、谱带的中心位置、谱带的端点位置。这些位置通常统一以波长量表示。

在本说明书其余部分中，谱带中最大吸光度的位置是吸收谱带的位置。例如，将宽度设置为预设值。

根据所示例子，利用计算光谱的二阶导数S”_CALCULATION，实现该步骤110推导带。

例如，参考图5所示，计算光谱的二阶导数S”_CALCULATION的演变的变化被认为是谱带的中心位置。

更精确地，每个谱带的中心位置的精确位置是推导得出的。为此，在推导吸收谱带的参数的步骤110，在二阶导数光谱S_CALCULATION的计算中的吸光度的最小值被确定。

对于每个局部最小值，在存储器中存储最小值的位置。这个位置通常统一以波长量表示。

有多种方法用于确定在计算光谱的二阶导数S”_CALCULATION的计算中的局部最小值的存在，其与计算光谱S_CALCULATION中的最大值对应。

根据图3所示例子的用于提取吸收谱带的方法还包括步骤112，通过使用推导得到的参数和Voigt线型来曲线拟合各个吸收谱带。具有Voigt线型的吸收谱带产生自两个展宽机制的结合，两个展宽机制一个产生高斯线型，另一个产生洛伦兹线型。Voigt线型是洛伦兹线型和高斯线型的卷积。在本说明书其余部分中，这意味着可以针对Voigt线型定义高斯比例和洛伦兹比例。

例如，根据一个具体的实施例，高斯-洛伦兹函数的宽度被设定为推导得出的宽度，且高斯-洛伦兹函数的最高值被设定为等于计算光谱S_CALCULATION在推导得出的中心位置的值。

替代地，可考虑高斯线型或洛伦兹线型代替Voigt线型。

根据图3所示例子的用于确定吸收谱带的方法还包括步骤114，通过使用优化准则，优化曲线拟合出的高斯-洛伦兹函数的参数。

在优化步骤114中所考虑的曲线拟合出的Voigt线型的参数是与Voigt线型的形状相关的参数。

例如，一个参数是高斯-洛伦兹函数的中心位置，该中心位置的变化被限制在距曲线拟合步骤中所得到中心位置1cm^-1。

在一个实施例中，一个参数是Voigt线型中的高斯比例，该高斯比例的变化被限制在15％和25％之间。

根据一个实施例，一个参数是Voigt线型中的洛伦兹比例，该洛伦兹比例的变化被限制在75％和85％之间。

优选地，优化准则是在计算光谱S_CALCULATION和代表所考虑的吸收谱带的各个Voigt线型的总和之间的距离。例如，该距离为均方根。

根据图3所示例子的用于确定吸收谱带的方法还包括步骤115，形成吸收谱带群。

对于形成步骤55所作的相同论述也适用于形成步骤115。因此，此处不重复这些论述。

根据图3所示例子的用于确定吸收谱带的方法还包括步骤116，计算所考虑的吸收谱带的总和。

根据图3所示例子的用于确定吸收谱带的方法还包括步骤118，通过从计算光谱S_CALCULATION中去除提取得到的吸收谱带，计算剩余光谱S_RESIDUAL。根据步骤116计算的所考虑的吸收谱带的总和的结果，可实现计算剩余光谱S_RESIDUAL的步骤118。

对于步骤56通过从计算光谱S_CALCULATION中去除每个提取得到的吸收谱带计算剩余光谱S_RESIDUAL所作的相同论述也适用于通过从计算光谱S_CALCULATION中去除每个提取得到的吸收谱带来计算剩余光谱S_RESIDUAL的步骤118。因此，此处不再重复这些论述。

用于确定吸收谱带的方法还包括步骤120，测试剩余光谱S_RESIDUAL是否满足预设的停止准则C_STOP。

对于步骤58测试剩余光谱S_RESIDUAL是否满足预设的停止准则C_STOP所作的相同论述也适用于测试剩余光谱S_RESIDUAL是否满足预设的停止准则C_STOP的步骤120。因此，此处不再重复这些论述。

如果不满足预设的停止准则C_STOP，根据图3所示例子的用于确定吸收谱带的方法包括将计算光谱S_CALCULATION设定为等于剩余光谱S_RESIDUAL。

换句话说，对于所研究的光谱的每个波数，在计算光谱S_CALCULATION中的吸光度的值和在剩余光谱S_RESIDUAL中的吸光度的值相同。

根据图3所示例子的方法还包括步骤124，校正每个提取得到的吸收谱带。

根据一个实施例，校正步骤124包括，对于每个提取得到的吸收谱带，在所考虑的吸收谱带的位置确定剩余光谱的代数符号。

根据一个实施例，校正步骤124包括，对于每个提取得到的吸收谱带，在所考虑的吸收谱带的宽度端点处确定剩余光谱的代数符号。

根据一个实施例，校正步骤124包括，对于每个提取得到的吸收谱带，分析剩余光谱关于所考虑的吸收谱带的位置的对称性。

根据一个实施例，利用在所考虑的吸收谱带的宽度端点处的剩余光谱的值，实现校正吸收谱带的步骤124。例如，如果剩余光谱的值为正，则放大宽度，如果剩余光谱的值为负，则缩小宽度。

作为一个例子，如果对于一个特定宽度，发生在所考虑的宽度的端点处剩余光谱中的误差对应为正值，则意味着宽度应该延伸超出当前端点。相反，如果在所考虑的宽度的端点处剩余光谱中的误差对应为负值，则意味着宽度应该对于当前端点缩小。

根据一个实施例，通过利用在所考虑的吸收谱带的宽度的中心位置的剩余光谱的值，实现校正每个提取得到的吸收谱带的步骤124。例如，如果在中心位置的剩余光谱的值为正，则增加吸收谱带的吸光度，如果在中心位置的剩余光谱的值为负，则减少吸收谱带的吸光度。

替代地，所考虑的剩余光谱的值可选取远离吸收谱带的宽度端点的任何位置。例如，位于在中心位置和距离中心位置最近的端点之间的距离一半的位置被认为是远离吸收谱带的宽度端点。

如图3的箭头所示，然后，重复步骤106搜索在计算光谱S_CALCULATION中的吸光度的局部最大值、步骤108计算吸光度关于波数的二阶导数、步骤110通过搜索对应于计算光谱S_CALCULATION中吸光度最大值的吸光度的局部最小值推导谱带、步骤112通过利用推导得出的谱带和高斯-洛伦兹函数曲线拟合各个吸收谱带、步骤114通过使用优化准则优化曲线拟合的高斯洛伦兹函数的参数、形成步骤115、步骤116计算所考虑的吸收谱带的总和、步骤118通过从计算光谱S_CALCULATION中去除每个提取得到的吸收谱带计算剩余光谱S_RESIDUAL、以及步骤120测试剩余光谱S_RESIDUAL是否满足预设的停止准则C_STOP。

根据一个优选的实施例，步骤114采用优化准则，优化曲线拟合的Voigt线型的参数，步骤114应用于在新重复步骤112提取得到的Voigt线型且也应用于先前的曲线拟合函数，步骤112通过使用推导得出的宽度和Voigt线型曲线拟合每个吸收谱带。在这种情况下，参考光谱是校正得出的吸收光谱。

如果满足预设的停止准则C_STOP，用于确定吸收谱带的方法还包括步骤120，输出每个提取出的吸收谱带。

对于步骤60输出每个提取出的吸收谱带所作的相同论述也适用于步骤120输出每个提取出的吸收谱带。因此，此处不重复这些论述。

可选地，在较佳的情况下，如图3所示的方法中存在校正步骤124，当使用剩余光谱作为计算光谱重复提取步骤、形成步骤、计算步骤和测试步骤时满足停止准则C_STOP，不再修改先前确定的谱带的参数，且没有新的谱带被加入到先前所获得的吸收谱带群。

根据图3所示例子的用于确定吸收谱带的方法得益于吸收技术所提供的所有优点。值得注意的是，光谱学作为分析技术的独特优势之一在于，可以不引入仪器和样品发生接触进行测量。在样品和仪器之间传播的辐射将包含光谱信息，因此可以远程测量。远程光谱感测在许多情况下是有价值的。例如，测量可以在有毒或危险的环境中进行，而无需将操作人员或仪器置于风险中。此外，样品材料不必接触到仪器-防止可能的交叉污染。

用于确定吸收谱带的方法也可以更准确地确定与所研究的样品中存在的化学物种类的共价键相关联的吸收谱带。这种用于确定吸收谱带的方法是用于从吸收光谱中提取谱带的全面且自动化的方法，特别是对于红外光谱。

可以发现很多用于确定吸收谱带的方法的应用。这些应用与吸收光谱的使用相关。吸收光谱也被用于分子和原子物理、天文光谱和遥感的研究。

在天文学中，吸收光谱学对于理解星际云和确定其中一些包含分子是特别重要的。吸收光谱学也用于太阳系外行星的研究。使用凌日变光观测法对太阳系外行星进行的探测也测量其吸收光谱，并允许对行星的大气组成、温度、压力和均质大气高度进行测定，也允许对行星质量进行测定。

在原子和分子物理学中，理论模型，主要是量子力学模型，使得原子和分子的吸收光谱得以与其他物理性质相关联，如电子结构、原子或分子质量和分子几何。因此，吸收光谱的测量被用来确定这些其他性质。例如，微波光谱使得得以以高精度测定键长和键角。

此外，光谱测量可用于确定理论预测的准确性。例如，在氢原子吸收光谱中测得的兰姆位移在测量时并未被预料存在。它的发现，促进并引导了量子电动力学的演变，且兰姆位移的测量现在可用于测定精细结构常数。

用于确定吸收谱带的方法也可用于三维成像三维样品的方法中。

用于三维成像的方法包括划分三维样品为多个二维样品的步骤。

用于三维成像的方法还包括对每个二维样品执行用于确定吸收谱带的方法的步骤，该方法如前所述，以获得与每个二维样品的共价键相关联的提取出的吸收谱带。

用于三维成像的方法还包括通过使用每个二维样品的提取出的吸收谱带来重建三维样品的步骤。

在一个优选实施例中，重建步骤意味着使用矩阵，其中对每个二维样品都给出了从共价键(一个或多个)提取得到的吸收谱带(一个或多个)。该矩阵可以被称为“光谱矩阵”。

用于三维成像的方法使得得以在大尺寸上实现三维样品成像，例如，1cm³体积的手术切除活检。

本发明提出的方法和显示与任何特定的计算机或其他装置没有内在联系。各种通用系统可以与根据本发明教导的程序一起使用，或者可以便利地构造更专业化的设备来执行期望的方法。多种系统的期望结构在下文中进行描述。此外，本发明的实施例并非参照任何特定的编程语言来描述。应注意的是，多种编程语言均可用于实施如在此所述的本发明所给出的教导。

例如，如图7所示，提出一种谱仪200，其包括系统10。

谱仪200包括辐射源202、向样品206传输辐射源发出的辐射的光学组件204、样品保持器208、探测装置210。

为了覆盖电磁频谱，采用多种辐射源。对于光谱学，为了测量吸收光谱的广阔区域，通常期望源覆盖大片波长的源。有些源本身就散发出宽广的光谱。这方面的例子包括，在红外区域的硅碳棒或其他黑体源、在可见光区域的水银灯、紫外线和X射线管、以及在红外区域内发射的各种激光技术。最近开发的一种新的广谱辐射源是同步辐射，其覆盖所有这些光谱区域。其他辐射源产生窄谱，但发射波长可以被调谐到覆盖光谱范围。这方面的例子包括在微波段的调速管和跨越红外、可见光和紫外区域的激光器(虽然不是所有的激光器具有可调谐波长)。

在本申请中，辐射源202优选地是适用于发射包括在波数预设范围内的波长的红外源。如上文所述，该范围可以扩展到7000cm^-1和10cm^-1之间。

光学组件204的材料的选择与感兴趣的波长范围有关，光学组件向样品206传输辐射源202发射的辐射。事实上，应考虑在感兴趣的波长范围内的吸收相对较少的材料。例如，吸收应低于0.5％，最好是低于0.01％。其他材料的过高吸收会干扰或掩盖样品的吸收。例如，在几个波长范围内，对样品206的吸收的测量是在真空下或在稀有气体环境中进行，因为大气中的气体有干扰吸收的特性。

在生物环境中，光学组件通常是显微镜物镜和反射镜。

样品保持器208也由特定材料制成，换句话说，对在波长范围内吸收相对较少的材料感兴趣。例如，吸收应低于50％，较佳地低于0.01呱

用来测量辐射功率的探测装置210也取决于感兴趣的波长范围。大多数探测装置对相当宽的光谱范围敏感，且传感器的选择往往会更多地依赖于给定的测量的灵敏度和噪声要求。在光谱学中常见的探测装置的例子包括微波区域的外差接收机、在毫米波和红外区域中的辐射热计、在红外区域的碲镉汞探测装置和其他低温半导体探测装置、以及在可见光和紫外区域的光电二极管和光电倍增管。

可选地，谱仪200还包括摄谱仪。摄谱仪用于在空间上分离辐射波长，从而可得以独立测量每个波长的功率。当源和探测装置覆盖宽光谱区域时，为了确定光谱，尤其会使用这种方法分解辐射的波长。事实上，由于光谱可以逐个波长重建，因而摄谱仪并不是必需的。

在本专利申请中，考虑了不同的方法，这些方法使得得以获得生物样品的三维整体和定量的成像，而不使用任何内部标准、试剂或标签(这也可以扩展到非生物样品，如果是有机样品则更好)。在红外光谱中用于这些目的这种技术提供了关于样品中存在的有机功能(和潜在的一些无机功能)的整体且定量的信息。有机功能的使用使得得以清楚显示单个分子、分子族、化学物种类、和生物化学参数的存在，这些都可以被三维重建。

更具体地，已经记述了自连续的二维图像的完整的三维重建方法，其通过排除组织和光谱操作、标准化和校正，以获得三维中的红外吸收的定量分布，改善了先前的方案。自动光谱曲线拟合过程允许将波长相关的吸收光谱转移到谱带相关的化学谱，其变为三维的红外光谱矩阵。然后，三维红外成像开辟了一条新途径，用以分析微米尺度上的组织体积，具有定量和整体的性能。在显微术上的这一突破性进展打开了完全虚拟化组织分析的道路，其成为生物科学中可实施组织的第一种数字化相关的诊断和研究性利用。

上述所考虑的实施例和替代实施例可以结合，以产生本发明的更多实施例。