技术领域本发明涉及蜂蜜鉴别技术领域，尤其涉及原阿片碱作为特征识别物在鉴别蜂蜜中是否含有博落回蜂蜜中的应用。
背景技术：
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露后与自身分泌物混合经充分酿造而成的天然甜物质。蜜蜂采集的植物花蜜、分泌物或蜜露应安全无毒，不得来源于有毒蜜源植物，如雷公藤、博落回、狼毒等。蜂蜜中毒事件时有发生，在国外来自马桑和杜鹃花的“野蜂蜜”中毒事件时有报道，国外也建立了对应的分析方法来对这种蜂蜜进行确认检验。在我国，蜂蜜中毒很少发生，但是近几年在我国福建、湖北、重庆等地出现了蜜蜂中毒死亡事件，通过花粉初步认定为博落回和雷公藤形成的有毒蜂蜜。尽管蜜蜂很少去采集博落回和雷公藤这两种有毒蜂蜜，但是在大旱之季，或其他蜜源减少，博落回和雷公藤大量产粉和流蜜时，蜜蜂会采集雷公藤和博落回的花蜜，生产有毒蜂蜜。加之我国蜂蜜的生产方式，这些蜂蜜有可能混到以其他蜂蜜中后加工，造成潜在风险。尽管目前还没有明确这种蜂蜜中到底是哪种或是那类物质导致的中毒，但是首先建立起响应的识别这种蜂蜜的方法，对于蜂蜜的消费安全有着重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷和不足，筛选出易发现、易制备的物质作为特征识别物来鉴别蜂蜜中是否含有毒的博落回蜂蜜，并利用该特征识别物建立起一种鉴别博落回蜂蜜的方法。本发明的技术方案之一是：原阿片碱作为特征识别物在鉴别蜂蜜中是否含有博落回蜂蜜中的应用。本发明的技术方案之二是：一种利用原阿片碱作为特征识别物鉴别蜂蜜中是否含有博落回蜂蜜的方法，该方法采用LC-Q-TOF(液相-四级杆-飞行时间质谱)或LC/MS/MS(液相色谱串联质谱)检测待测蜂蜜样品，所得谱图中含有所述原阿片碱对应的特征峰时，则判定蜂蜜中含有博落回蜂蜜；不含有所述特征峰时，判定蜂蜜中不含有博落回蜂蜜。其中，所述LC-Q-TOF的飞行时间质谱图中至少含有354.1366(允许偏差±5ppm)质量数(M+H)准分子离子峰。优选地，为了提高鉴别的精准度，所述飞行时间质谱图中还含有如下质量数(M+H)准分子离子峰中的一个或多个：336.0887(允许偏差±5ppm)，332.1090(允许偏差±5ppm)，370.1670(允许偏差±5ppm)，370.1683(允许偏差±5ppm)。更优选地，所述飞行时间质谱图中同时含有上述4个准分子离子峰。具体地，在对蜂蜜样品进行检测时，优选采用如下预处理方式对蜂蜜样品进行预处理：取蜂蜜样品，每1g蜂蜜中加入0.8-1.2mL水溶解，向溶解液中加入0％-0.3％的甲酸乙腈溶液或甲酸甲醇溶液斡旋提取1-8min，加入无水硫酸镁和氯化钠后离心，取有机相并用氮气吹干，然后加入40％-60％的乙腈水溶液或甲醇水溶液复溶，过滤即得。优选的预处理方法为：取蜂蜜样品，每1g蜂蜜中加入1mL水溶解，向溶解液中加入0％-0.2％的甲酸乙腈溶液或甲酸甲醇溶液斡旋提取5min，加入无水硫酸镁和氯化钠后离心，取有机相并用氮气吹干，然后加入50％的乙腈水溶液或甲醇水溶液复溶，过滤即得。其中，0％-0.3％或0％-0.2％的甲酸乙腈溶液(或甲酸甲醇溶液)指的是乙腈溶液(或甲醇溶液)中甲酸的体积百分含量。40％-60％或50％的乙腈水溶液(或甲醇水溶液)指的是水溶液中乙腈(或甲醇)的体积百分含量。采用LC-Q-TOF对蜂蜜样品进行检测时，所述LC-Q-TOF中的LC包括如下检测条件：色谱柱：C18柱或C8柱或苯基柱；流动相：A乙腈或甲醇，B0％-0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱：0-2min5％B，2-20min90％B，20-21min5％B，21-35min5％B；所述Q-TOF包括如下检测条件：目标离子：361.1646；碰撞能量30eV。其中，流动相B0％-0.2％的甲酸水溶液指的是甲酸水溶液中甲酸的体积百分含量。优选地，色谱柱采用C18柱，进一步优选采用EclipsePlusC18，2.1x100mm，1.8μm。为了进一步提高检测的精准度，LC的流动相流速为0.15-0.6mL/min，柱温为25-35℃，进样量为1-30μL。优选地，流速为0.2mL/min，柱温为30℃，进样量为2μL。为了进一步提高检测的精准度，Q-TOF采用ESI正离子，干燥气氮气流速为5-7mL/min，温度为280-320℃，气帘气流速为9-11L/min，温度为330-370℃，电离电压为3800-4200V；扫描方式为MSscan全扫描，质量数范围100-2000，参比实时校正。优选地，采用ESI正离子，干燥气氮气流速为6mL/min，温度300℃，气帘气流速10L/min，温度350℃，电离电压4000V；扫描方式为MSscan全扫描，质量数范围100-2000，参比实时校正。采用LC-Q-TOF方法对蜂蜜进行检测，具有不用标准品，通过特征识别物即可测定蜂蜜中是否含有毒博落回蜂蜜的优势，但LC-Q-TOF方法存在着灵敏度低和仪器普及率不高的缺陷，为了能够更加快捷的对博落回蜂蜜进行鉴别，本发明还提供一种采用LC/MS/MS手段进行鉴别的方法，LC/MS/MS在许多实验室均有配备，该方法具有快速、准确、灵敏度高的优势。具体的，所述LC/MS/MS中的LC包括如下条件：色谱柱：C18柱或C8柱或苯基柱，优选为C18柱，进一步优选为agilentSBC18，2.1x50mm，1.8μm；流动相：A乙腈或甲醇，B0％-0.2％的甲酸水溶液，梯度洗脱，0-1min5％B，1-4min20％B，4-6min90％B，6-8min5％B；MS/MS包括如下条件：扫描方式：MRM，原阿片碱354>189，354>275；倍增电压：0-400。为了提高鉴别的精准度，所述LC还包括如下条件：流速：0.15-0.6mL/min，柱温：25-35℃，进样量1-30μL；优选为：流速：0.2mL/min，柱温：30℃，进样量2μL。所述MS/MS还包括：ESI正离子，干燥气氮气流速：5-7mL/min，温度180-220℃，气帘气流速：9-11L/min，温度330-370℃，电离电压3800-4200V；优选为：ESI正离子，干燥气氮气流速：6mL/min，温度300℃，气帘气流速：10L/min，温度350℃，电离电压4000V。本发明通过LC-Q-TOF或LC/MS/MS分析蜂蜜样品中是否含有原阿片碱，就可以确认蜂蜜中是否含有危害蜂蜜，且具有极低的检出限，具体地，LC-Q-TOF的检出限为2-3μg/kg，LC/MS/MS的检出限为0.5-1μg/kg。需要说明的是，本发明的目的在于发现特征提取物，并利用该特征提取物用于博落回蜂蜜的鉴别。原阿片碱毒性较低，其本身不可能导致中毒，但其可以作为特征识别物用于鉴别博落回蜂蜜，预防消费风险。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以互相组合，即得本发明各较佳实施例。本发明涉及到的原料和试剂均可市购获得。本发明具有的优点是：(1)确定了原阿片碱可以作为鉴别蜂蜜中是否含有博落回蜂蜜的特征识别物，建立起了响应博落回蜂蜜的方法，且两种方法具有极低的检出限，对于蜂蜜的消费安全有着重要意义；(2)原阿片碱标准样品易于获得，适合作为特征识别物；(3)在确定了特征识别物的基础上，通过LC-Q-TOF，LC/MS/MS方法可以快速分析原阿片碱，从而快速识别这两种蜂蜜；(4)蜂蜜样品预处理方法简单便捷，易于操作。附图说明图1中A为博落回整花提取物Q-TOF分析总离子图，B为整花提取物Q-TOF分析特征离子354.1366(原阿片碱)提取色谱图，C为采集的博落回蜂蜜提取物Q-TOF分析总离子图，D为采集的博落回蜂蜜提取物Q-TOF分析特征离子354.1366(原阿片碱)提取色谱图；图2中为E为博落回整花提取物Q-TOF分析特征离子准确质量数质谱图，F为采集的博落回蜂蜜提取物Q-TOF分析特征离子准确质量数质谱图；图3中为G为实际样品提取物Q-TOF分析特征离子354.1366(提取色谱图，H为实际样品提取物Q-TOF分析特征离子准确质量数质谱图；图4为油菜蜂蜜特征离子354.1366(原阿片碱)提取色谱图；图5为椴树蜂蜜特征离子354.1366(原阿片碱)提取色谱图；图6为荆条蜂蜜特征离子354.1366(原阿片碱)提取色谱图；图7为洋槐蜂蜜特征离子354.1366(原阿片碱)提取色谱图；图8为枣花蜂蜜特征离子354.1366(原阿片碱)提取色谱图；图9为多花种蜂蜜特征离子354.1366(原阿片碱)提取色谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。预实验例1、实验材料：博落回蜂蜜，博落回整花，油菜蜂蜜，洋槐蜂蜜，荆条蜂蜜，椴树蜂蜜，枣花蜂蜜，多花种蜂蜜。其中，博落回蜂蜜通过如下方法获得：在河南新乡蜂场，选择有博落回种植地域，将蜂场置于密封能采集的区域，通过人工手段将附近其他蜜源去除，让蜜蜂来采集博落回蜂蜜，采集一周花，从蜂箱摇出蜂蜜，取100g，清蜜脾，并将其他剩余蜂蜜销毁。2、实验方法：(1)准备待测样品：制备蜂蜜待测样品：取博落回蜂蜜、油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜、椴树蜂蜜、枣花蜂蜜各10g，分别按照如下方式处理，得到待测样品：将蜂蜜放入50mL离心管中，加入10mL水溶解，再加入0.2％甲酸乙腈20mL斡旋提取5min，将4g无水硫酸镁和1g氯化钠加入到离心管中，混合1min，5000rpm离心5min。取上层有机相氮气吹干，用2mL50％的乙腈水溶液复溶，混合后，用0.2μm滤膜过滤。制备博落回整花提取液：称取2.5g博落回整花到50mL离心管中，加入0.2％甲酸乙腈10mL斡旋提取5min，将4g无水硫酸镁和1g氯化钠加入到离心管中，混合1min，5000rpm离心5min，取0.5mL上清液到离心管中，再加入0.5mL去离子水，混合后，用0.2um滤膜过滤。(2)采用LC-Q-TOF对博落回整花提取液和博落回蜂蜜进行检测，检测条件为：LC条件如下：色谱柱：EclipsePlusC18，2.1x100mm，1.8μm；流速：0.2mL/min；流动相：A乙腈，B0.2％的甲酸水，梯度洗脱：0-2min5％B，2-20min90％B，20-21min5％B，21-35min5％B；柱温：30℃；进样量：2μL；Q-TOF条件：ESI正离子，干燥气氮气流速：6L/min；温度：300℃；气帘气流速：10L/min；温度：350℃；电离电压4000V；扫描方式：MSscan全扫描，质量数范围100-2000，参比实时校正；确证方法：targetms，目标离子354.1366，碰撞能量30eV。(3)检测结果：请参考图1和图2，E中的354.1366峰为B中5.6min对应的准分子离子峰；F中354.1366峰为D中5.6min对应的准分子离子峰。3、结果分析：从图1A和C可以看出博落回整花和其蜂蜜在5-7min有共有物质，用分子特征软件形成分子式，共有63个化合物，其中强度较大的有336.0887，322.1090，370.1670，354.1356，370.1683，将这些物质形成分子式，并结合已报到的文献，检索可能的分子式，其中354.1356，形成的分子式为C20H19O5N。为了能够最后形成有效的标准方法，筛选的化合物应该具有易获得或是有标准品的优先，最后分子式C20H19O5N获选，初步推测其为原阿片碱，在博落回提取物和其蜂蜜提取物中提取准确质量数354.1366，可以看出两个提取物中均有该组分(参见图2)。通过购买标准品和提取样品中的物质比对，保留时间和准确质量数一致，确认该物质为原阿片碱(参见图3，保留时间为5.770，分子离子峰为354.1352)。通过标样校正计算该蜂蜜中原阿片碱的含量为109μg/kg。根据博落回的文献报道，推测其他物质应该也为其他生物碱类物质，但因很难推测其结构，也很难获得标准品，他们仅能作为辅助参考。此外，按照此方法分析常见的其他蜂蜜，油菜，洋槐，枣花，荆条，椴树和多花种蜂蜜的萃取物(图4-图9)，提取原阿片碱准确质量数354.1366，在这些蜂蜜中对应的保留时间未检测到该特征离子存在。进一步说明原阿片碱可以作为此蜂蜜的特征识别指示物。实施例1检测样品：市场抽取130多份不同样品，包括油菜、洋槐、枣花、荆条、荔枝、龙眼、椴树、山花、荞麦等，其中3份怀疑为博落回蜂蜜(蜂农反应附近有少量博落回)。样品预处理：将10g蜂蜜放入50mL离心管中，加入10mL水溶解，再加入乙腈20mL斡旋提取5min，将4g无水硫酸镁和1g氯化钠加入到离心管中，混合1min，5000rpm离心5min。取上层有机相氮气吹干，用2mL50％的甲醇水溶液复溶，混合后，用0.2μm滤膜过滤。检测方法：采用LC/MS/MS法检测(检出限为1μg/kg)，检测条件为：色谱柱：agilentSBC18，2.1x50mm，1.8μm；流速：0.2mL/min；流动相：A乙腈，B0.2％的甲酸水，梯度洗脱：0-1min5％B,1-4min20％B，4-6min90％B，6-8min5％B；柱温：30℃；进样量：2μL；MS/MS条件：离子漏斗ESI正离子，干燥气氮气流速：6L/min；温度：200℃；气帘气流速：10L/min；温度：350℃；电离电压4000V；扫描方式：原阿片碱354>189，354>275；倍增电压：0。检测结果：3份疑似博落回蜂蜜中，仅1份疑似样品中检测出原阿片碱，含量为47μg/kg，实地确认，附近确有博落回植物，另2份疑似样品未检测到原阿片碱，经色谱指纹判别为多花种蜂蜜，是因为蜜蜂采集具有单一性，附近有少量的博落回种植，但在其他蜜源丰富的情况下，蜜蜂一般很少采集博落回花粉或蜜。实施例2检测样品：同实施例1样品预处理：将10g蜂蜜放入50mL离心管中，加入10mL水溶解，再加入0.2％甲酸甲醇溶液20mL斡旋提取8min，将4g无水硫酸镁和1g氯化钠加入到离心管中，混合1min，5000rpm离心5min。取上层有机相氮气吹干，用2mL50％的甲醇水溶液复溶，混合后，用0.2μm滤膜过滤。检测方法：采用LC-Q-TOF法检测，检测条件同预实验例，区别仅在于色谱柱采用苯基柱，流动相为：A甲醇，B水。检测结果：3份疑似博落回蜂蜜中，1份疑似样品中检测出原阿片碱，实地确认，附近却有博落回种植，另2份疑似样品未检测到原阿片碱，检测结果与LC/MS/MS一致。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。