技术领域：
本发明涉及医学检验
技术领域：
，尤其涉及一种糖化血红蛋白质控物的制备方法。
背景技术：
：糖尿病治疗关键是血糖水平的控制与稳定，糖化血红蛋白是血红蛋白糖基化的产物，其能反映患者过去8～12周的平均血糖水平，且不受短期血糖浓度波动的影响。该糖化血红蛋白的准确测定需要一个稳定质控产品来监控仪器状态及试剂的好坏。而现有的质控产品稳定性差，从而使得糖化血红蛋白的测定存在偏差。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种糖化血红蛋白质控物的制备方法，旨在获得稳定性高糖化血红蛋白质控物。为实现上述目的，本发明提供一种糖化血红蛋白质控物的制备方法，包括以下步骤：S1，对血液样本进行离心处理，获得红细胞；S2，利用细胞洗涤液对所述红细胞进行洗涤，形成红细胞悬液；S3，在洗涤后的红细胞加入反应液中进行糖基化；S4，当糖基化过程中糖化血红蛋白的浓度达到所需的质控物浓度时，利用细胞洗涤液对所述步骤S3的红细胞悬液进行洗涤，进行去糖基化；S5，在去糖基化的红细胞悬液中加入稳定剂、冻干保护剂，制成液体或冻干的糖化血红蛋白质控物。优选地，所述步骤S1之前还包括：S0，在血液样本中加入抗氧化剂。优选地，所述细胞洗涤剂的成分为：聚乙烯乙二醇：0～3％；二钠：0～3％；葡萄糖酸镁：0-1％；Na2HPO4：0-2％；非葡萄糖六元醇六碳糖：0-8％；对羟基苯甲酸甲酯：0-0.2％；次黄嘌呤核苷：0-0.5％；新霉素：0-0.2％；氯霉素：0-0.2％；(NaOH)：0-0.5％；(KCl)：0-1.5％；摩尔渗透压：250-300mOsm/L；上述溶剂为去离子水。优选地，所述非葡萄糖六元醇六碳糖为甘露糖。优选地，所述含有甘露糖或葡萄糖的反应液的成分为：聚乙烯乙二醇(200-50000)：0-3％；二钠：0-3％；葡萄糖酸镁：0-1％；Na2HPO4：0-2％；甘露糖或葡萄糖：0-8％；对羟基苯甲酸甲酯：0-0.2％；次黄嘌呤核苷：0-0.6％；新霉素：0-0.2％；氯霉素：0-0.2％；(NaOH)：0-0.05％；(KCl)：0-1.5％；NaF：0～0.5％；Ph：6.0～8.0；摩尔渗透压：250-300mOsm/L；上述溶剂为去离子水。优选地，所述反应液中还加入有牛血清白蛋白，且所述牛血清白蛋白在反应液中的质量浓度为1～6％。优选地，所述步骤S3中进行糖基化时的反应温度为18～23℃，反应时间为4～8天。优选地，所述血液样本中红细胞的浓度为：3.5*1012/L-5.0*1012/L，血红蛋白的浓度为：9g/L-12g/L。优选地，所述步骤S4中，将糖基化后的红细胞悬液加入细胞洗涤液，并进行离心除去沉淀，留取上清液。优选地，所述红细胞悬液与细胞洗涤液的比例最少为1:3。本发明实施例采用正常人的红细胞进行体外糖基化进行糖化血红蛋白质控物的制备，扩大了原料的来源。另外，本发明实施例利用非葡萄糖六元醇六碳糖作为体外糖基化的糖类，缩短了体外糖基化的时间。而且，本发明实施例还利用细胞洗涤液进行去糖基化处理，使得制备后的糖化血红蛋白质控物中不稳定的糖化血红蛋白的浓度降低，从而保证了糖化血红蛋白质控物的稳定性。附图说明图1为本发明糖化血红蛋白质控物的制备方法第一实施例的流程示意图；图2为本发明红细胞的血红蛋白进行糖基化的过程；图3为是本发明糖化血红蛋白质控物的制备方法第二实施例的流程示意图。本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明提供一种糖化血红蛋白质控物的制备方法。如图1所示，该制方法可包括以下步骤：S1，对血液样本进行离心处理，获得红细胞；上述血液样本可来自没有糖尿病的健康人群，当然也可以为其他来源。收集到血液样本后，可对该血液样本进行离心处理，获得红细胞。采用的血液红细胞的浓度最好是与正常人的血液中的浓度一样。具体地，血液样本中红细胞的浓度为：3.5*1012/L-5.0*1012/L，血红蛋白的浓度为：9g/L-12g/L。S2，利用细胞洗涤液对所述红细胞进行洗涤，形成红细胞悬液；在红细胞中加入细胞洗涤液，获得红细胞混合物，即红细胞悬液。该红细胞与细胞洗涤液的比例可根据具体情况而灵活设置，而且洗涤次数也可以灵活设置，本实施例中，该洗涤次数为3次。上述细胞洗涤液的成分及浓度如下表1所示：表1.细胞洗涤液的成分及浓度细胞洗涤液成分浓度聚乙烯乙二醇0-3％乙二胺四乙酸(EDTA)0-3％葡萄糖酸镁0-1％Na2HPO40-2％甘露糖0-8％对羟基苯甲酸甲酯0-0.2％次黄嘌呤核苷0-0.5％新霉素0-0.2％氯霉素0-0.2％(NaOH)0-0.5％(KCl)0-1.5％摩尔渗透压250-300mOsm/L上述溶剂为去离子水。上表1中，甘露糖也可以用其他的非葡萄糖六元醇六碳糖或者葡萄糖代替，本实施例中，优选为甘露糖。本发明实施例中，该甘露糖的浓度尽量低，甚至为0％，以免红细胞的血红蛋白与甘露糖进行糖基化。上述Na2HPO4作为磷酸盐缓冲液使用，当然也可以由其他缓冲液代替，例如三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液等等。优选地，上述细胞洗涤液的成分的浓度示例如下表2所示：细胞洗涤液成分浓度聚乙烯乙二醇0.7％EDTA0.7％葡萄糖酸镁0.39％Na2HPO40.27％甘露糖0％对羟基苯甲酸甲酯0.04％次黄嘌呤核苷0.025％新霉素0.04％氯霉素0.015％(NaOH)0.08％(KCl)0.632％PH7.0摩尔渗透压300mOsm/LS3，在洗涤后的红细胞悬液中加入反应液中进行糖基化；上述反应液的成分及浓度如下表3所示：红细胞悬液与含有甘露糖的反应液混合后，红细胞中的血红蛋白会进行糖基化，且糖基化阶段会产生不稳定的糖化血红蛋白(Labile-A1c，L-A1C)和稳定的糖化血红蛋白(Stable-A1c，S-A1c)，如图2所示。其中，不稳定的糖化血红蛋白为快速可逆的，在无或低浓度的甘露糖中，将被分解为血红蛋白和甘露糖。稳定的糖化血红蛋白为不可逆的。由于在糖基化过程中，稳定的糖化血红蛋白的转化相对比率取决于反应液中甘露糖的量，因此通过设置反应液中甘露糖的量，可以决定糖化血红蛋白在红细胞中的浓度，从而制备一系列不同的糖化血红蛋白质控物，用于不同的用途。稳定的糖化血红蛋白在红细胞中的浓度占总重量6％-12％或更高的浓度为优选。一般情况下，正常人的糖化血红蛋白S-A1c的正常浓度范围是约占红细胞总重量的6％或以下。为了获得所需浓度的糖化血红蛋白质控物，上述反应液中需含有足够量的甘露糖以使糖化血红蛋白到预期浓度，甘露糖在反应液中的浓度下限是可以以合理的速度糖化血红蛋白的浓度。本发明实施例中，甘露糖在反应液中的质量百分比在2％-8％。而且，糖基化反应时的环境温度越高，达到所需浓度的糖化血红蛋白质控物所需要的反应时间越短。在试验过程中，发现温度过高，虽然可以减少反应时间，但是制备后的糖化血红蛋白质控物的稳定性较差。因此，本发明实施例中红细胞的血红蛋白进行糖基化处理时的反应温度为18～23℃，反应时间为4～8天。进一步地，上述反应液中还可加入牛血清白蛋白，且所述牛血清白蛋白在反应液中的质量浓度为1～6％。反应液中加入牛血清白蛋白，目的是抗凝血和抗溶血。反应液中牛血清白蛋白的浓度下限是能防止溶血和凝聚的最低牛血清白蛋白浓度，牛血清白蛋白浓度的上限是浓度增加没有进一步的减少凝血、溶血。本发明实施例中，该牛血清白蛋白在反应液中的浓度优选为1％-6％之间。S4，当糖基化过程中糖化血红蛋白的浓度达到所需的质控物浓度时，利用细胞洗涤液对所述步骤S3的红细胞悬液进行洗涤，进行去糖基化；红细胞中的血红蛋白糖基化后通常会包含较高浓度的不稳定的糖化血红蛋白(L-A1C)，虽然L-A1c也存在在糖尿病患者的血液中，但浓度较低。因此，需要对糖基化后的红细胞去糖基化，使得不稳定的糖化血红蛋白的浓度降低。在糖基化过程中，将实时监测稳定的糖化血红蛋白的浓度，可采用高效液相色谱(HPLC),免疫分析、酶学方法和硼酸亲和方法检测，本实施例中优选采用日本爱科莱公司HA-8180全自动糖化血红蛋白分析仪。当糖基化过程中，稳定的糖化血红蛋白的浓度达到所需的质控物浓度时，可以利用细胞洗涤液对糖基化后的红细胞悬液进行洗涤，去除该红细胞悬液中的甘露糖。在去糖基化处理时，需要用稀释液将红细胞混悬。本发明利用洗涤红细胞的细胞洗涤液，其实也可以利用其他的公知稀释剂，只要该稀释剂中不含有甘露糖。稀释比例最少为1:3，即红细胞悬液与细胞洗涤液的比例，例如1:5。而且在去糖基化过程中，红细胞在稀释液混悬一定的时间，以使L-A1c降低到正常的范围。温度过低，去糖基化时间太长。如果温度太高，可能会损害红细胞。因此，去糖基化的温度优选为18-23℃。去糖基化的时间则根据不稳定的糖化血红蛋白L-A1c的浓度而定。为了准确确定去糖基化时间，该去糖基化过程也可以测量L-A1c糖化血红蛋白的浓度。任何分析技术可以用来监测L-Alc糖化血红蛋白的浓度，本发明实施例中优选高压液相色谱分析技术。当去糖基化处理过程中，L-Alc糖化血红蛋白达到理想的浓度，将红细胞与反应液进行分离，本发明实施例优选采用离心分离方法。S5，在去糖基化的红细胞悬液中加入稳定剂、冻干保护剂，制成液体或冻干的糖化血红蛋白质控物。上述稳定剂可利用上述表3中列出成分的组合物，且作为稳定剂时，采用葡萄糖代替甘露糖。本发明实施例采用正常人的红细胞进行体外糖基化进行糖化血红蛋白质控物的制备，扩大了原料的来源。另外，本发明实施例利用非葡萄糖六元醇六碳糖作为体外糖基化的糖类，缩短了体外糖基化的时间。而且，本发明实施例还利用细胞洗涤液进行去糖基化处理，使得制备后的糖化血红蛋白质控物中不稳定的糖化血红蛋白的浓度降低，从而保证了糖化血红蛋白质控物的稳定性。体外糖基化可以使用大量的正常的健康人血液样本生产出高糖化血红蛋白浓度的糖化血红蛋白质控物。因为这些正常的血液样本来自健康的个体，他们通常不含异常血红蛋白变体。此外体外糖基化方法还可以根据需要生产不同浓度的糖化血红蛋白的质控物来满足日益增长的需求。进一步地，如图3所示，上述步骤S1之前还包括：S0，在血液样本中加入抗氧化剂。利用抗氧化剂与血液样本的红细胞中的血红蛋白接触，可防止红细胞中的血红蛋白从二价铁价态转换到三价铁价态，Fe2+位于血红蛋白的中心，在血液流动过程中结合和携带氧气。血红蛋白中的Fe为二价离子状态时，红细胞红细胞保留红色。二价Fe氧化时生成三价铁，使红细胞变成棕褐色。任何该类可以阻止这种氧化的试剂都可以使用。本发明实施例中，优选使用一氧化碳(CO)气体作为抗氧化剂。在一定条件下使抗氧化剂和红细胞接触，红细胞中血红蛋白的二价铁和抗氧化剂结合使得红细胞保持红色。摩尔百分比大约50％-80％Fe2+和抗氧化剂结合或相连。可以理解的是，上述步骤S0也可以位于步骤S2之前，或者将抗氧化剂加入细胞洗涤液中，用于对红细胞进行洗涤，形成红细胞悬液。抗氧化剂处于液体或固体时可以加入到细胞洗涤剂中。以下将举例说明糖化血红蛋白质控物的制备过程：提供一血液样本中，该血液样本中血红蛋白的浓度为120g/L，红细胞的浓度为4*1012/L，稳定的糖化血红蛋白的浓度为S-Alc:5-6％。先对该血液样本进行离心分离，生成红细胞，并在该血液样本中通入CO气泡的方式。然后利用细胞洗涤液对该血液样本进行洗涤，形成细胞悬液。再加入反应液，该反应液中含甘露糖6％，0.3％BSA磷酸盐缓冲液等等。将加入反应液的细胞悬液放置在设定温度下，反应设定时间进行糖基化，同时不同时间段测定糖化血红蛋白的浓度。当测定糖化血红蛋白的浓度达到所需浓度时，将混合物利用稀释剂(例如细胞洗涤液)进行洗涤去糖基化处理。对糖基化后的红细胞混合物洗涤3次，稀释剂含3％缓冲液，不含有甘露糖。典型的洗涤过程包括用稀释剂稀释样品，彻底混合，然后在1500rpm离心15分钟，去除沉淀后吸取上清液。稀释比例为1:5。去糖基化后还可加入表面活性剂的缓冲液溶血，离心去除杂质，加入冻干保护剂、稳定剂后，冻干或液体冰冻保存。另外，还可对的体积进行调整，使得血红蛋白浓度保持为110-120g/L。本发明通过控制反应液的浓度、反应温度和反应时间，可以制备两种或两种以上浓度的糖化血红蛋白质控物。两组或两组以上的糖化血红蛋白可以组装成套件。通常一组S-Alc糖化血红蛋白的浓度在正常范围内(非糖尿病范围,约4％-6％)，另一组S-Alc糖化血红蛋白的浓度约10-12％。以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页1 2 3