土壤蛋白酶的测定方法与流程

文档序号:17196453发布日期:2019-03-27 09:32阅读:来源:国知局

技术特征:

1.土壤蛋白酶的测定方法,其特征在于:该测定方法按以下步骤进行:

一、试剂配制:分别配制0.10mol/L~0.15mol/L NaOH溶液,0.10mol/L~0.15mol/L KH2PO4溶液;

二、配制磷酸盐缓冲溶液:取步骤一配制的NaOH溶液790mL~795mL和KH2PO4溶液1000mL~1010mL混合,调节pH至7.40~7.42;

三、配制明胶溶液:将明胶研磨粉碎,量取700mL~710mL步骤二配制的磷酸盐缓冲溶液加热至80℃~85℃,称取研磨好的明胶10.0g~10.4g溶解于加热后的磷酸盐缓冲溶液中,溶解后冷却定容到1L;

四、配制铜盐溶液:首先配制0.15mol/L~0.17mol/L CuCl2溶液,再配制0.18mol/L~0.19mol/L Na2HPO4溶液,向Na2HPO4溶液中加入NaOH,使其pH在8.0~8.5;然后配制0.28mol/L~0.29mol/L Na2B4O7溶液,向Na2B4O7溶液中加入0.08mol/L~0.12mol/L盐酸,使其pH在6.0~6.5,静置待用;

五、土样的培养:准确称取采自田间的农田黑土10.01~10.04g,烘干制成土样,用孔径为2mm的筛子过筛,然后将过筛后的土样置于容器中,用移液管准确加入甲苯4mL±2μL,放置13min~17min,然后加入步骤三配制的明胶溶液39mL~41mL;再用保鲜膜将容器口封好,放置已预热37℃~38℃恒温箱中,培养23h~25h;

六、测定:将步骤五培养的土样过滤,取10mL~12mL滤液于50mL~100mL离心管中,加水10mL~15mL,依次用移液管准确加入步骤四配制的CuCl2溶液4mL±2μL、Na2HPO4溶液8mL±2μL和Na2B4O7溶液8mL±2μL,将离心管盖好,充分混匀,溶液由蓝色变成蓝紫色后离心,4000r/min~4500r/min离心4min~5min,离心完毕后,取上清液在分光光度计650nm处测定吸光度值;

七、甘氨酸标准液的配制和标准曲线的绘制:配制甘氨酸标准液,以甘氨酸浓度为横坐标,测得的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线;

八:结果计算:以每克烘干土样在24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量来表示蛋白酶活性Pro:Pro=a·V·n/m,式中:a为由标准曲线求的NH3-N浓度,单位为μg/mL;V为显色液体积,单位为mL;n为分取倍数;m为烘干土重,单位为g。

2.根据权利要求1所述的土壤蛋白酶的测定方法,其特征在于:步骤五加入甲苯4mL。

3.根据权利要求1所述的土壤蛋白酶的测定方法,其特征在于:步骤五加入步骤三配制的明胶溶液40mL。

4.根据权利要求1所述的土壤蛋白酶的测定方法,其特征在于:步骤六用移液管准确加入步骤四配制的CuCl2溶液4mL、Na2HPO4溶液8mL和Na2B4O7溶液8mL。

5.根据权利要求1所述的土壤蛋白酶的测定方法,其特征在于:步骤七配制甘氨酸标准液按以下步骤进行:精确称取0.2679g甘氨酸溶于蒸馏水,并准确稀释至100mL,此为甘氨酸标准溶液,1mL含500μgNH3-N;用移液管准确吸取甘氨酸标准液10mL于50mL容量瓶中,用水稀释至刻度,即得100μgNH3-N/mL的标准液;然后分别吸取稀释5倍标准液0、2、4、6、8和10mL于50mL~100mL离心管中,加水稀释至20mL~25mL;依次用移液管准确加入步骤四配制的CuCl2溶液4mL±2μL、Na2HPO4溶液8mL±2μL和Na2B4O7溶液8mL±2μL;将离心管盖好,充分混匀,由蓝色变成蓝紫色后离心,4000r/min~4500r/min离心4~5min;离心完毕后,取上清液在分光光度计650nm处测定吸光度值。

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