土壤蛋白酶的测定方法与流程

本发明涉及蛋白酶的测定方法，特别是涉及一种土壤蛋白酶的测定方法。

背景技术：

蛋白酶能够将蛋白质、肽类分解为氨基酸，是土壤中的一种重要的胞外酶，该酶具有离体活性，能够参与土壤的氮素循环。在进入土壤的植物残体和施入的有机肥料中，含有一定数量的蛋白物质，土壤蛋白酶能对这类物质进行酶促分解，因此，可用蛋白酶来表征土壤的氮素状况及其转化进程。

测定土壤蛋白酶活性的方法中——荷夫曼(Hoffmann)方法(也叫铜盐比色法)，是目前比较常用的测定土壤蛋白酶活性的方法。该方法采用水溶解的1％明胶培养，然后用加入按比例混合好的铜-磷酸盐溶液，酶解后释放的氨基酸与铜盐反应形成蓝色复合物，用分光度计进行比色，计算氨基酸含量，进而分析蛋白酶活性。但是该方法存在许多的不足，首先，1％明胶基质培养的效果不够好，测得的结果不够稳定，其次，铜磷酸盐按照一定比例混合好进行反应生成蓝色的复合物的效果不够明显，导致测定的结果不够准确。土壤蛋白酶活性测定的过程中受试验试剂的影响较大，导致目前荷夫曼方法测定蛋白酶活性准确性较低。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决测定蛋白酶活性的准确性较低的问题，提供了一种土壤蛋白酶的测定方法。

本发明的土壤蛋白酶的测定方法按以下步骤进行：

一、试剂配制：分别配制0.10mol/L～0.15mol/L NaOH溶液，0.10mol/L～0.15mol/L KH2PO4溶液；

二、配制磷酸盐缓冲溶液(PBS)：取步骤一配制的NaOH溶液790mL～795mL和KH2PO4溶液1000mL～1010mL混合，调节pH至7.40～7.42；

三、配制明胶溶液：将明胶研磨粉碎，并称取10.0g～10.4g，量取700mL～710mL步骤二配制的磷酸盐缓冲溶液(PBS)加热至80℃～85℃，将研磨好的明胶溶解于加热后的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，溶解后冷却定容到1L；

四、配制铜盐溶液：首先配制0.15mol/L～0.17mol/L CuCl2溶液，再配制0.18mol/L～0.19mol/L Na2HPO4溶液，向Na2HPO4溶液中加入NaOH用来调节溶液的pH值，使其pH在8.0～8.5；然后配制0.28mol/L～0.29mol/LNa2B4O7(无水四硼酸钠)溶液，加入0.08mol/L～0.12mol/L盐酸，用来调节溶液的pH值，使其pH在6.0～6.5，静置待用；

五、土样的培养：准确称取采自田间的农田黑土10.01～10.04g，烘干制成土样，用孔径为2mm的筛子过筛，然后将过筛后的土样置于容器中，用移液管准确加入甲苯4mL±2μL，放置13min～17min，然后加入步骤三配制的明胶溶液39mL～41mL；再用保鲜膜将容器口封好，放置已预热37℃～38℃恒温箱中，培养23h～25h；

六、测定：将步骤五培养的土样过滤，取10mL～12mL滤液于50mL～100mL离心管中，加水10mL～15mL，依次用移液管准确加入步骤四配制的CuCl2溶液4mL±2μL、Na2HPO4溶液8mL±2μL和Na2B4O7溶液8mL±2μL，将离心管盖好，充分混匀，溶液由蓝色变成蓝紫色后离心，4000r/min～4500r/min离心4min～5min，离心完毕后，取上清液在分光光度计650nm处测定吸光度值；

七、甘氨酸标准液的配制和标准曲线的绘制：(目的：蛋白酶活性的大小是用甘氨酸的量来表示，所以需要用甘氨酸配置标准液，制取标准曲线，绘制甘氨酸的标准液，在标准曲线上找到待测液的值就可以知道蛋白酶活性的大小)精确称取0.2679g甘氨酸溶于蒸馏水，并准确稀释至100mL，此为甘氨酸标准溶液，1mL含500μgNH3-N；用移液管准确吸取甘氨酸标准液10mL于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，即得100μgNH3-N/mL的标准液，此溶液不宜久存；分别吸取稀释5倍标准液0、2、4、6、8、10mL于50mL～100mL离心管中，加水稀释至20mL～25mL；依次用移液管准确加入CuCl2溶液4mL±2μL、Na2HPO4溶液8mL±2μL、Na2B4O7溶液8mL±2μL；将离心管盖好，充分混匀，由蓝色变成蓝紫色后离心，4000r/min～4500r/min离心4～5min；离心完毕后，取上清液在分光光度计650nm处测定吸光度值；以甘氨酸浓度为横坐标，测得的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线；

八：结果计算：以每克烘干土样在24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量(μg)来表示蛋白酶活性(Pro)：Pro＝a·V·n/m式中：a为由标准曲线求的NH3-N浓度(μg/mL)；V为显色液体积(40mL)；n为分取倍数；m为烘干土重(g)。

蛋白酶活性的计算方法：

以每克烘干土样在24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量(μg)来表示蛋白酶活性(Pro)：Pro＝a·V·n/m式中：a为由标准曲线求的NH3-N浓度(μg/mL)；V为显色液体积(40mL)；n为分取倍数；m为烘干土重(g)。

本发明相对于现有技术其优点在于：

通过使用磷酸缓冲液配制明胶基质代替用水配制明胶，铜-盐溶液也由依次分别添加替代原来先按比例混合后添加，显色方式也由离心管内混合离心比色替代了原来在三角瓶内混合显色过滤，提高了土壤蛋白酶活性测定的准确性。同时采用本方法与原有的普通方法测定同一土壤蛋白酶活性，本发明方法得到的值分别为793.47、787.70、789.16、781.48，标准值为788.85±4.75，原有普通方法测定得到值分别为638.45、622.96、666.78、671.63、558.72，标准值为631.71±45.48本发明测定土壤蛋白酶活性平行性好，变异系数小，方法可行性高。

附图说明：

图1为甘氨酸含量的标准曲线。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式的土壤蛋白酶的测定方法按以下步骤进行：

一、试剂配制：分别配制0.10mol/L～0.15mol/L NaOH溶液，0.10mol/L～0.15mol/L KH2PO4溶液；

二、配制磷酸盐缓冲溶液：取步骤一配制的NaOH溶液790mL～795mL和KH2PO4溶液1000mL～1010mL混合，调节pH至7.40～7.42；

三、配制明胶溶液：将明胶研磨粉碎，量取700mL～710mL步骤二配制的磷酸盐缓冲溶液加热至80℃～85℃，称取研磨好的明胶10.0g～10.4g溶解于加热后的磷酸盐缓冲溶液中，溶解后冷却定容到1L；

四、配制铜盐溶液：首先配制0.15mol/L～0.17mol/L CuCl2溶液，再配制0.18mol/L～0.19mol/L Na2HPO4溶液，向Na2HPO4溶液中加入NaOH，使其pH在8.0～8.5；然后配制0.28mol/L～0.29mol/L Na2B4O7溶液，向Na2B4O7溶液中加入0.08mol/L～0.12mol/L盐酸，使其pH在6.0～6.5，静置待用；

五、土样的培养：准确称取采自田间的农田黑土10.01～10.04g，烘干制成土样，用孔径为2mm的筛子过筛，然后将过筛后的土样置于容器中，用移液管准确加入甲苯4mL±2μL，放置13min～17min，然后加入步骤三配制的明胶溶液39mL～41mL；再用保鲜膜将容器口封好，放置已预热37℃～38℃恒温箱中，培养23h～25h；

六、测定：将步骤五培养的土样过滤，取10mL～12mL滤液于50mL～100mL离心管中，加水10mL～15mL，依次用移液管准确加入步骤四配制的CuCl2溶液4mL±2μL、Na2HPO4溶液8mL±2μL和Na2B4O7溶液8mL±2μL，将离心管盖好，充分混匀，溶液由蓝色变成蓝紫色后离心，4000r/min～4500r/min离心4min～5min，离心完毕后，取上清液在分光光度计650nm处测定吸光度值；

七、甘氨酸标准液的配制和标准曲线的绘制：配制甘氨酸标准液，以甘氨酸浓度为横坐标，测得的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线；

八：结果计算：以每克烘干土样在24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量(μg)来表示蛋白酶活性(Pro)：Pro＝a·V·n/m式中：a为由标准曲线求的NH3-N浓度(μg/mL)；V为显色液体积(40mL)；n为分取倍数；m为烘干土重(g)。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤五加入甲苯4mL。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤五加入步骤三配制的明胶溶液40mL。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤六用移液管准确加入步骤四配制的CuCl2溶液4mL、Na2HPO4溶液8mL和Na2B4O7溶液8mL。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是，步骤七配制甘氨酸标准液按以下步骤进行：精确称取0.2679g甘氨酸溶于蒸馏水，并准确稀释至100mL，此为甘氨酸标准溶液，1mL含500μgNH3-N；用移液管准确吸取甘氨酸标准液10mL于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，即得100μgNH3-N/mL的标准液；然后分别吸取稀释5倍标准液0、2、4、6、8和10mL于50mL～100mL离心管中，加水稀释至20mL～25mL；依次用移液管准确加入步骤四配制的CuCl2溶液4mL±2μL、Na2HPO4溶液8mL±2μL和Na2B4O7溶液8mL±2μL；将离心管盖好，充分混匀，由蓝色变成蓝紫色后离心，4000r/min～4500r/min离心4～5min；离心完毕后，取上清液在分光光度计650nm处测定吸光度值。其他步骤与参数与具体实施方式一相同。

实施例1

本实施例的土壤蛋白酶的测定方法按以下步骤进行：

一、试剂配制：分别配制0.10mol/LNaOH溶液，0.10KH2PO4溶液；

二、配制磷酸盐缓冲溶液(PBS)：取步骤一配制的NaOH溶液790mL和步骤一配制的KH2PO4溶液1000mL混合，调节pH为7.40；

三、配制明胶溶液：将明胶研磨粉碎，并称取10.0g，量取700mL步骤二配制的磷酸盐缓冲溶液(PBS)加热至80℃，将研磨好的明胶溶解于加热后的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，溶解后冷却定容到1L；

四、配制铜盐溶液：首先配制0.15mol/L CuCl2溶液，再配制0.18mol/LNa2HPO4，加入7.2gNaOH用来调节溶液的pH值。然后配制0.28mol/LNa2B4O7(无水四硼酸钠)溶液，加入0.1mol/L盐酸100mL，用来调节溶液的pH值，静置待用；

五、土样的培养：称取相当于10.0g烘干土重的鲜土(过2mm筛)两份，分别置于200mL三角瓶中。其中的一份加入甲苯4mL，放置15min，然后加入用PBS配制的明胶溶液40mL。同时向称取的另一份土样中加入甲苯4mL放置15min，加入40mL磷酸盐缓冲溶液PBS代替基质作为对照。将称量好的土样，用保鲜膜封好容器封口，放置已预热37℃恒温箱中，培养24h；

六、测定：培养结束后，将悬液过滤，取10mL滤液于50mL离心管中，加水10mL，依次加入CuCl2溶液4mL、Na2HPO4溶液8mL、Na2B4O7溶液8mL，将离心管盖好，充分混匀，溶液完全变色后离心，4500r/min离心5min，离心完毕后，取上清液在分光光度计650nm处测定吸光度值；

七、甘氨酸标准液的配制：精确称取0.2679g甘氨酸溶于蒸馏水，并稀释至100mL，此为甘氨酸标准溶液，1mL含500μgNH3-N。吸取甘氨酸标准液10mL于50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，即得100μgNH3-N/mL的标准液，此溶液不宜久存；分别吸取稀释5倍标准液0、2、4、6、8、10mL于50mL离心管中，加水稀释至20mL；依次用移液管准确加入CuCl2溶液4mL、Na2HPO4溶液8mL、Na2B4O7溶液8mL；将离心管盖好，充分混匀，显色完全后离心，4500r/min离心5min。离心完毕后，取上清液在分光光度计650nm处测定。

八：结果计算：以每克烘干土样在24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量(μg)来表示蛋白酶活性(Pro)：Pro＝a·V·n/m式中：a为由标准曲线求的NH3-N浓度(μg/mL)；V为显色液体积(40mL)；n为分取倍数；m为烘干土重(g)。

实施例2

本实施例与实施例1不同的是步骤五中称量土样后加用水溶解的明胶。其它步骤与实施例1相同。

实施例3

本实施例与实施例1不同的是步骤六中加铜盐溶液时，使用前按1:2:2(体积分数)将CuCl2溶液、Na2HPO4溶液和Na2B4O7(无水四硼酸钠)溶液进行混合加入样品中，其它步骤与实施例1相同。

实施例4

本实施例与实施例1不同的是步骤六中称量土样的量是称取5.0g烘干的鲜土(过2mm筛)，其它步骤与实施例1相同。

表1有效分光比色值

表1为四个实施例的有效分光比色值。其中样品编号A为采用实施例1方法测定的5份标准样品土壤蛋白酶活性的测试结果，样品编号B为采用实施例2的方法测定的5份标准样品土壤蛋白酶活性的测试结果，样品C为采用实施例3的方法测定的5份标准样品土壤蛋白酶活性的测试结果，D为采用实施例4的方法测定的5份标准样品土壤蛋白酶活性的测试结果。采用实施例1测定得到的土壤蛋白酶活性变异系数为0.60％，显示出较好的准确性，采用实施例3未能产生有效的分光光度计比色数值。