本发明涉及医学检验
技术领域：
，具体涉及一种检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸。
背景技术：
：基于我国的基本国情，巨大的人口压力已经在制约着社会的进一步发展，优生优育一直是我国倡导和注重的优化人口素质的手段，而孕期检查则是排除和及时控制胎儿健康问题的重要手段，但我国基于医疗检验水平，检验是否方便及经济成本等因素的限制，还不能做到孕妇孕期的全面检查，特别是一些隐性病症的检测，所以在这方面还需更多的研究和探索。弓形虫是细胞内寄生虫，寄生于细胞内，随血液流动，到达全身各部位，破坏大脑、心脏、眼底，致使人的免疫力下降，患各种疾病，多数人是无症状的带虫者，仅少数人发病，但临床表现复杂。一般分为先天性和后天获得性两类，均以隐性感染为多见，临床症状多由新近急性感染或潜在病灶活化所致。先天性感染的发生率和严重性与孕妇受染时间的早晚有关，妊娠早期感染弓形虫病的孕妇，如不接受治疗则可引起10％-25％先天性感染而导致自然流产、死胎、早产和新生儿严重感染，妊娠中期与后期感染的孕妇分别可引起30％-50％(其中72-79％可无症状)和60-65％(内89％-100％可无症状)的胎儿感染，受染孕妇如能及早发现并接受治疗，则可使先天性感染的发生率降低60％左右。现在我国有很多医院已在开展对孕妇普遍进行弓形虫抗体检查，一般为血清IgM抗体IgG抗体检测，若IgM抗体呈阳性，即为孕妇感染，需对胎儿进行进一步检查，但IgG抗体阳性表示有既往感染史，检查意义并不大，且这些检查均存在检查方法复杂，检查质量不高等问题，如何研究一种能快速方便检测其感染，灵敏度高，准确性强的方法用在怀孕初期进行弓形虫感染排查，就是我们要研究的问题。技术实现要素：本发明解决的技术问题就是提供一种快速准确地检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸。本发明的技术方案为：一种检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸由样品吸收垫、纳米金释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成；样品吸收垫上包被有弓形虫P22抗原；纳米金释放垫上包被有纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述检测线包被有弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗兔IgM抗体。优选的，所述的多克隆抗体的制备方法为：将花生油和羊毛脂按1:3的比例混合用超声法使之混合均匀，再进行灭菌处理，将其与弓形虫P22抗原以1:1的比例混合，振荡均匀成乳状，使其完全乳化，检验合格后用注射器抽取600μg剂量在家兔的皮下注射，15天后进行加强免疫，免疫剂量为200μg，再15天后，取血ELISA检测抗体效价，达到要求后收集血液在37℃恒温箱中放置35分钟，再在4℃下放置过夜，将血液转移至离心管中，4℃下离心10分钟，收集上清液即为抗血清，用抗原亲和纯化抗体，再用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定抗体纯度，即可得到所述的多克隆抗体。优选的，所述的纳米金标记的多克隆抗体的制备方法为：配制质量浓度为0.01-0.05％的氯金酸溶液200mL，再加入质量浓度为2-3％的柠檬酸钠溶液15mL，边加热边均匀搅拌，设置搅拌速度为450r/min，加热温度为50-54℃，再加入质量浓度为2.5％的分散剂聚乙烯吡咯烷酮，调节pH值到7.0-8.2，得到平均粒径在15-25nm稳定性好的纳米金溶液；取弓形虫多克隆抗体40μg加入制备好的纳米金溶液中，通过磁力震荡搅拌10min使其得以标记，再加入质量浓度为4％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，所得混合溶液10℃下，1000r/min的转速离心处理20min去除未结合的纳米金颗粒从而得到纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体。优选的，所述硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和质控线，检测线包被的是弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，包被量为10-30μg，质控线包被的是羊抗兔IgM抗体，包被量为1.5-5.5μg，线宽为2mm。一种检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸的制备方法为：步骤一：纳米金释放垫制备方法：(1)将花生油和羊毛脂按1:3的比例混合用超声法使之混合均匀，再进行灭菌处理，将其与弓形虫P22抗原以1:1的比例混合，振荡均匀成乳状，使其完全乳化，检验合格后用注射器抽取600μg剂量在家兔的皮下注射，15天后进行加强免疫，免疫剂量为200μg，再15天后，取血ELISA检测抗体效价，达到要求后收集血液在37℃恒温箱中放置35分钟，再在4℃下放置过夜，将血液转移至离心管中，4℃下离心10分钟，收集上清液即为抗血清，用抗原亲和纯化抗体，再用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定抗体纯度，即可得到所述的多克隆抗体；(2)配制质量浓度为0.01-0.05％的氯金酸溶液200mL，再加入质量浓度为2-3％的柠檬酸钠溶液15mL，边加热边均匀搅拌，设置搅拌速度为450r/min，加热温度为50-54℃，再加入质量浓度为2.5％的分散剂聚乙烯吡咯烷酮，调节pH值到7.0-8.2，得到平均粒径在15-25nm稳定性好的纳米金溶液；取弓形虫多克隆抗体40μg加入制备好的纳米金溶液中，通过磁力震荡搅拌10min使其得以标记，再加入质量浓度为4％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，所得混合溶液10℃下，1000r/min的转速离心处理20min去除未结合的纳米金颗粒从而得到纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；(3)将(2)中制备好的纳米金包被纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体均匀喷涂于聚酯膜上，冷冻干燥，即为纳米金释放垫；步骤二：硝酸纤维素膜的包被方法：在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和质控线，检测线包被的是弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，包被量为10-30μg，质控线包被的是羊抗兔IgM抗体，包被量为1.5-5.5μg，线宽为2mm；步骤三：样品吸收垫的制备方法：将弓形虫P22抗原60μg用2倍量的PBS溶解后包被在玻璃纤维膜上，即为所需样品吸收垫；步骤四：试纸制备：将样品吸收垫、纳米金释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在底板上，叠加厚度在3-4mm，然后将试纸包封储存。本发明的试纸使用方法：室温条件下取被检血清30-80ul，将试纸平放，备检血清加到样品吸收垫区，纳米金溶解后在硝酸纤维素膜上层析，10分钟内观察和判断结果，若样品中含有弓形虫IgM抗体，则会与弓形虫P22抗原结合，遇到检测线处多克隆抗体呈显色反应，即为阳性，反之为阴性。本发明的有益效果体现在：弓形虫血清IgM抗体检查是孕妇在怀孕初期排查弓形虫的主要标志，本发明基于现有技术的基础上，选用弓形虫P22抗原制备多克隆抗体，具有很好的免疫原性，以纳米金标记多克隆抗体，可使检测结果更加准确，而且操作简单，反应快，敏感度高，可大大减少由于检验人员水平差异带来的误差，对于规范弓形虫检查在我国的不标准化有重要的意义。具体实施方式实施例1：一种检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸由样品吸收垫、纳米金释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成；样品吸收垫上包被有弓形虫P22抗原；纳米金释放垫上包被有纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述检测线包被有弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗兔IgM抗体。其中，所述的多克隆抗体的制备方法为：将花生油和羊毛脂按1:3的比例混合用超声法使之混合均匀，再进行灭菌处理，将其与弓形虫P22抗原以1:1的比例混合，振荡均匀成乳状，使其完全乳化，检验合格后用注射器抽取600μg剂量在家兔的皮下注射，15天后进行加强免疫，免疫剂量为200μg，再15天后，取血ELISA检测抗体效价，达到要求后收集血液在37℃恒温箱中放置35分钟，再在4℃下放置过夜，将血液转移至离心管中，4℃下离心10分钟，收集上清液即为抗血清，用抗原亲和纯化抗体，再用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定抗体纯度，即可得到所述的多克隆抗体；所述的纳米金标记的多克隆抗体的制备方法为：配制质量浓度为0.01％的氯金酸溶液200mL，再加入质量浓度为2％的柠檬酸钠溶液15mL，边加热边均匀搅拌，设置搅拌速度为450r/min，加热温度为50℃，再加入质量浓度为2.5％的分散剂聚乙烯吡咯烷酮，调节pH值到7.0，得到平均粒径在15nm稳定性好的纳米金溶液，取弓形虫多克隆抗体40μg加入制备好的纳米金溶液中，通过磁力震荡搅拌10min使其得以标记，再加入质量浓度为4％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，所得混合溶液10℃下，1000r/min的转速离心处理20min去除未结合的纳米金颗粒从而得到纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和质控线，检测线包被的是弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，包被量为10μg，质控线包被的是羊抗兔IgM抗体，包被量为1.5μg，线宽为2mm。一种检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸的制备方法为：步骤一：纳米金释放垫制备方法：(1)将花生油和羊毛脂按1:3的比例混合用超声法使之混合均匀，再进行灭菌处理，将其与弓形虫P22抗原以1:1的比例混合，振荡均匀成乳状，使其完全乳化，检验合格后用注射器抽取600μg剂量在家兔的皮下注射，15天后进行加强免疫，免疫剂量为200μg，再15天后，取血ELISA检测抗体效价，达到要求后收集血液在37℃恒温箱中放置35分钟，再在4℃下放置过夜，将血液转移至离心管中，4℃下离心10分钟，收集上清液即为抗血清，用抗原亲和纯化抗体，再用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定抗体纯度，即可得到所述的多克隆抗体；(2)配制质量浓度为0.01％的氯金酸溶液200mL，再加入质量浓度为2％的柠檬酸钠溶液15mL，边加热边均匀搅拌，设置搅拌速度为450r/min，加热温度为50℃，再加入质量浓度为2.5％的分散剂聚乙烯吡咯烷酮，调节pH值到7.0，得到平均粒径在15nm稳定性好的纳米金溶液；取弓形虫多克隆抗体40μg加入制备好的纳米金溶液中，通过磁力震荡搅拌10min使其得以标记，再加入质量浓度为4％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，所得混合溶液10℃下，1000r/min的转速离心处理20min去除未结合的纳米金颗粒从而得到纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；(3)将(2)中制备好的纳米金包被纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体均匀喷涂于聚酯膜上，冷冻干燥，即为纳米金释放垫；步骤二：硝酸纤维素膜的包被方法：在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和质控线，检测线包被的是弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，包被量为10μg，质控线包被的是羊抗兔IgM抗体，包被量为1.5μg，线宽为2mm；步骤三：样品吸收垫的制备方法：将弓形虫P22抗原60μg用2倍量的PBS溶解后包被在玻璃纤维膜上，即为所需样品吸收垫；步骤四：试纸制备：将样品吸收垫、纳米金释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在底板上，叠加厚度在3mm，然后将试纸包封储存。实施例2：一种检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸由样品吸收垫、纳米金释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成；样品吸收垫上包被有弓形虫P22抗原；纳米金释放垫上包被有纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述检测线包被有弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗兔IgM抗体。其中，所述的多克隆抗体的制备方法为：将花生油和羊毛脂按1:3的比例混合用超声法使之混合均匀，再进行灭菌处理，将其与弓形虫P22抗原以1:1的比例混合，振荡均匀成乳状，使其完全乳化，检验合格后用注射器抽取600μg剂量在家兔的皮下注射，15天后进行加强免疫，免疫剂量为200μg，再15天后，取血ELISA检测抗体效价，达到要求后收集血液在37℃恒温箱中放置35分钟，再在4℃下放置过夜，将血液转移至离心管中，4℃下离心10分钟，收集上清液即为抗血清，用抗原亲和纯化抗体，再用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定抗体纯度，即可得到所述的多克隆抗体；所述的纳米金标记的多克隆抗体的制备方法为：配制质量浓度为0.03％的氯金酸溶液200mL，再加入质量浓度为3％的柠檬酸钠溶液15mL，边加热边均匀搅拌，设置搅拌速度为450r/min，加热温度为52℃，再加入质量浓度为2.5％的分散剂聚乙烯吡咯烷酮，调节pH值到7.6，得到平均粒径在20nm稳定性好的纳米金溶液，取弓形虫多克隆抗体40μg加入制备好的纳米金溶液中，通过磁力震荡搅拌10min使其得以标记，再加入质量浓度为4％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，所得混合溶液10℃下，1000r/min的转速离心处理20min去除未结合的纳米金颗粒从而得到纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和质控线，检测线包被的是弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，包被量为,20μg，质控线包被的是羊抗兔IgM抗体，包被量为3.5μg，线宽为2mm。一种检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸的制备方法为：步骤一：纳米金释放垫制备方法：(1)将花生油和羊毛脂按1:3的比例混合用超声法使之混合均匀，再进行灭菌处理，将其与弓形虫P22抗原以1:1的比例混合，振荡均匀成乳状，使其完全乳化，检验合格后用注射器抽取600μg剂量在家兔的皮下注射，15天后进行加强免疫，免疫剂量为200μg，再15天后，取血ELISA检测抗体效价，达到要求后收集血液在37℃恒温箱中放置35分钟，再在4℃下放置过夜，将血液转移至离心管中，4℃下离心10分钟，收集上清液即为抗血清，用抗原亲和纯化抗体，再用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定抗体纯度，即可得到所述的多克隆抗体；(2)配制质量浓度为0.03％的氯金酸溶液200mL，再加入质量浓度为3％的柠檬酸钠溶液15mL，边加热边均匀搅拌，设置搅拌速度为450r/min，加热温度为52℃，再加入质量浓度为2.5％的分散剂聚乙烯吡咯烷酮，调节pH值到7.6，得到平均粒径在20nm稳定性好的纳米金溶液；取弓形虫多克隆抗体40μg加入制备好的纳米金溶液中，通过磁力震荡搅拌10min使其得以标记，再加入质量浓度为4％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，所得混合溶液10℃下，1000r/min的转速离心处理20min去除未结合的纳米金颗粒从而得到纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；(3)将(2)中制备好的纳米金包被纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体均匀喷涂于聚酯膜上，冷冻干燥，即为纳米金释放垫；步骤二：硝酸纤维素膜的包被方法：在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和质控线，检测线包被的是弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，包被量为20μg，质控线包被的是羊抗兔IgM抗体，包被量为3.5μg，线宽为2mm。；步骤三：样品吸收垫的制备方法：将弓形虫P22抗原60μg用2倍量的PBS溶解后包被在玻璃纤维膜上，即为所需样品吸收垫；步骤四：试纸制备：将样品吸收垫、纳米金释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在底板上，叠加厚度在4mm，然后将试纸包封储存。实施例3：一种检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸由样品吸收垫、纳米金释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板组成；样品吸收垫上包被有弓形虫P22抗原；纳米金释放垫上包被有纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线，所述检测线包被有弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，所述质控线包被有羊抗兔IgM抗体。其中，所述的多克隆抗体的制备方法为：将花生油和羊毛脂按1:3的比例混合用超声法使之混合均匀，再进行灭菌处理，将其与弓形虫P22抗原以1:1的比例混合，振荡均匀成乳状，使其完全乳化，检验合格后用注射器抽取600μg剂量在家兔的皮下注射，15天后进行加强免疫，免疫剂量为200μg，再15天后，取血ELISA检测抗体效价，达到要求后收集血液在37℃恒温箱中放置35分钟，再在4℃下放置过夜，将血液转移至离心管中，4℃下离心10分钟，收集上清液即为抗血清，用抗原亲和纯化抗体，再用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定抗体纯度，即可得到所述的多克隆抗体；所述的纳米金标记的多克隆抗体的制备方法为：配制质量浓度为0.05％的氯金酸溶液200mL，再加入质量浓度为2-3％的柠檬酸钠溶液15mL，边加热边均匀搅拌，设置搅拌速度为450r/min，加热温度为54℃，再加入质量浓度为2.5％的分散剂聚乙烯吡咯烷酮，调节pH值到8.2，得到平均粒径在25nm稳定性好的纳米金溶液；取弓形虫多克隆抗体40μg加入制备好的纳米金溶液中，通过磁力震荡搅拌10min使其得以标记，再加入质量浓度为4％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，所得混合溶液10℃下，1000r/min的转速离心处理20min去除未结合的纳米金颗粒从而得到纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜的包被方法为：在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和质控线，检测线包被的是弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，包被量为30μg，质控线包被的是羊抗兔IgM抗体，包被量为5.5μg，线宽为2mm。一种检测血清中弓形虫IgM抗体纳米金免疫层析试纸的制备方法为：步骤一：纳米金释放垫制备方法：(1)将花生油和羊毛脂按1:3的比例混合用超声法使之混合均匀，再进行灭菌处理，将其与弓形虫P22抗原以1:1的比例混合，振荡均匀成乳状，使其完全乳化，检验合格后用注射器抽取600μg剂量在家兔的皮下注射，15天后进行加强免疫，免疫剂量为200μg，再15天后，取血ELISA检测抗体效价，达到要求后收集血液在37℃恒温箱中放置35分钟，再在4℃下放置过夜，将血液转移至离心管中，4℃下离心10分钟，收集上清液即为抗血清，用抗原亲和纯化抗体，再用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳鉴定抗体纯度，即可得到所述的多克隆抗体；(2)配制质量浓度为0.05％的氯金酸溶液200mL，再加入质量浓度为3％的柠檬酸钠溶液15mL，边加热边均匀搅拌，设置搅拌速度为450r/min，加热温度为54℃，再加入质量浓度为2.5％的分散剂聚乙烯吡咯烷酮，调节pH值到8.2，得到平均粒径在25nm稳定性好的纳米金溶液；取弓形虫多克隆抗体40μg加入制备好的纳米金溶液中，通过磁力震荡搅拌10min使其得以标记，再加入质量浓度为4％的胎牛血清，其加入量为使总溶液最终浓度为0.9％，所得混合溶液10℃下，1000r/min的转速离心处理20min去除未结合的纳米金颗粒从而得到纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体；(3)将(2)中制备好的纳米金包被纯化的弓形虫纳米金标记的多克隆抗体均匀喷涂于聚酯膜上，冷冻干燥，即为纳米金释放垫；步骤二：硝酸纤维素膜的包被方法：在硝酸纤维素膜上依次包被检测线和质控线，检测线包被的是弓形虫纳米金标记的多克隆抗体，包被量为30μg，质控线包被的是羊抗兔IgM抗体，包被量为5.5μg，线宽为2mm；步骤三：样品吸收垫的制备方法：将弓形虫P22抗原60μg用2倍量的PBS溶解后包被在玻璃纤维膜上，即为所需样品吸收垫；步骤四：试纸制备：将样品吸收垫、纳米金释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次相互叠加粘贴在底板上，叠加厚度在4mm，然后将试纸包封储存。临床统计试验：本发明者收集50例怀孕初期孕妇，已确诊为弓形虫感染，以ELISA试剂为对照组，本发明实施例2试纸为实验组，进行灵敏度测试，结果显示如下表：表1组别确诊病例人数阳性阴性准确度实验组5050100％对照组5027390％试验结果表明：本发明的纳米金免疫层析试纸条具有较高的灵敏度和特异性，适合临床推广应用。最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。当前第1页1 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