一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法与流程

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法。

背景技术：

低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)，是动脉粥样硬化斑块的主要成分，是导致动脉粥样硬化性血管疾病的罪魁。临床研究证实，LDL-C升高与动脉粥样硬化、冠心病的发病率之间呈正相关性。因此，准确测定血清中LDL-C的含量，对于动脉粥样硬化、高血压、冠心病等疾病诊断、预防和治疗有重要意义。检测方法主要有超速离心法、电泳法、化学或免疫沉淀法等，而目前临床实验室采用的沉淀法，血清中甘油三酯的含量对其检测有较大的干扰。最近，John J等报道了一种均相法检测LDL-C，其检测敏感性和特异性有了很大的提高(John J,Albers,Hal Kennedy,Santica M,Marcovina.Evaluation of a new homogenous method for detection of small dense LDL cholesterol:Comparison with the LDL cholesterol profile obtained by density gradient ultracetrifugation[J].Clinica ChimicaActa.412.556-561(2011))；而渡边基一等利用下述三种试剂或试剂组中的任何一种：(1)硫酸α-环糊精、硫酸葡聚糖、镁离子、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚醚试剂组；(2)两性表面活性剂和具有羧基或磺酸基的脂肪族胺试剂组；(3)聚阳离子试剂。与氧化还原酶一起构建了一种胆固醇传感器和胆固醇的定量方法(渡边基一，汤川系子，南海史郎.胆固醇传感器和胆固醇的定量方法.中国，发明专利，授权时间：2005.02.02，授权专利号：00802824.9)。这些方法所用仪器昂贵、操作复杂、费时且技术要求高，需要建立一种快速、灵敏、操作简便的LDL-C检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法，解决了传统LDL-C检测方法费用昂贵、操作复杂、费时且技术要求高的问题。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：玻碳电极预处理；

(1)用Al2O3悬浊液将玻碳电极表面打磨抛光至镜面，抛光后的电极依次在纯水、无水乙醇、纯水中磁力搅拌洗涤；

(2)将电极置于piraha溶液中浸泡，用纯水冲洗干净后再在纯水中磁力搅拌洗涤；

(3)将电极置于H2SO4中进行循环伏安扫描活化电极表面后得到活化后的玻碳电极，用纯水冲洗干净；

步骤2：电极的修饰；

(1)将活化后的玻碳电极浸入含邻氨基苯硫酚和高氯酸溶液中进行循环伏安扫描，扫描完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤；

(2)将电极放入HCl、KCl、HAuCl4组成的沉积底液中进行恒电位沉积，沉积完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤，得到修饰了金纳米粒的玻碳电极。

步骤3：生物传感界面的构建

(1)将apoB-100抗体滴加至修饰了金纳米粒的玻碳电极表面，孵育0.5-2小时，孵育完成后用用纯水将未固定的抗体洗去，用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；

(2)在电极表面滴加BSA溶液封闭反应0.5-2小时；

(3)用含BSA的甘氨酸-NaOH缓冲液溶液进行磁力搅拌洗涤；

步骤4：LDL-C的标准曲线绘制

(1)在步骤3得到的固定了ApoB-100抗体的电极表面滴加LDL溶液进行孵育，用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤将未被捕获的LDL洗去；

(2)在电极表面滴加胆固醇酯酶(CHER)、胆固醇氧化酶(CHOD)和AgNO3的溶液，避光孵育得到沉积有单质银的工作电极，该电极用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；

(3)将电极放入KNO3溶液中，进行线性扫描，记录Ag的溶出伏安峰；

(4)根据单质银的溶出伏安电流值大小，绘制LDL-C标准曲线，计算灵敏度和检测限。

步骤5：待测样品的检测

(1)在步骤3得到的固定了ApoB-100抗体的电极表面滴加15μL待测样品进行孵育，用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；

(2)在电极表面滴加含有CHER酶、CHOD酶和AgNO3的溶液，避光孵育得到沉积有单质银的工作电极，该电极用甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤；

(3)将工作电极放入KNO3溶液中，进行线性扫描，扫描范围0.0～+0.8V，扫描速率为50-200mV/s，记录Ag的溶出伏安电流值；

(4)根据步骤4所述标准曲线，得到所述待测样品溶液中LDL-C的浓度。

进一步，所述步骤1中Al2O3悬浊液颗粒大小为0.3μm和0.05μm。

进一步，所述步骤1中piraha溶液为体积比3:7的30％H2O2和98％H2SO4混合配置。

进一步，所述步骤1中将电极置于H2SO4中进行循环伏安扫描后，用纯水冲洗干净后，再将电极置于铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中分别进行循环伏安扫描和交流阻抗扫描，最后用纯水冲洗晾干备用。

进一步，所述步骤2中，邻氨基苯硫酚浓度为5mmol/L，高氯酸浓度为1mol/L。

进一步，所述步骤2中沉积底液分别由同体积的0.01mol/L HCl、0.1mol/L KCl、10μmol/L HAuCl4组成。

进一步，所述孵育温度为37℃。

进一步，所述甘氨酸-NaOH为pH8.6的甘氨酸0.1mol/L-NaOH缓冲液。

进一步，所述步骤4和步骤5中的线性扫描范围0.0～+0.8V，扫描速率为50-200mV/s。

其中，步骤1为步骤2提供一个新鲜的电极表面，为形成完整、稳定、牢固、导电性好的高分子聚合膜提供条件。步骤2中高分子聚合膜的形成为步骤3中生物识别分子apoB-100抗体的固定提供位点，从而构成特异性识别LDL的生物传感界面，并有利于电子的传递。步骤3中生物传感界面的构建为步骤4中LDL-C的电化学检测中必不可少的关键步骤。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能利用双酶协同催化银沉积反应实现电化学检测LDL-C。

本发明建立的检测LDL-C方法有益效果在于操作简单、检测时间短，易于微型化。

附图说明

图1基于双酶协同催化银沉积反应原理检测LDL-C的电化学方法原理图；

图2电极表面不同修饰过程的循环伏安表征图；

图3电极表面不同修饰过程的交流阻抗表征图；

图4(a)传感器在不同浓度LDL-C下的响应电流；

图4(b)传感器的工作曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。图1为基于双酶协同催化银沉积反应原理检测LDL-C的电化学方法原理图。图2为电极表面不同修饰过程的循环伏安表征图；图3为电极表面不同修饰过程的交流阻抗表征图。实施步骤如下：

1.电极的预处理：用颗粒大小为0.3μm和0.05μm的Al2O3悬浊液将玻碳电极表面打磨抛光至镜面，抛光后的电极依次在纯水、无水乙醇中分别磁力搅拌洗涤5min，用纯水冲洗再在纯水中磁力搅拌洗涤5min；将电极置于体积比3:7的30％H2O2和98％H2SO4配制的piraha溶液中浸泡1min，用纯水冲洗干净后再磁力搅拌洗涤5min；将电极置于0.5M H2SO4中于-0.3～+1.5V电位下进行循环伏安扫描10min活化电极表面，扫描范围-0.3～+1.5V，扫描速率为50-100mV/s，用纯水冲洗干净；将电极置于铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中分别进行循环伏安扫描(-0.5～+1.0V，50mV/s)和交流阻抗扫描(0.24V，1×10⁵Hz，0.1Hz)，最后用纯水冲洗晾干备用。

2.电极的修饰：将活化后的玻碳电极垂直浸入含邻氨基苯硫酚(oATP)(浓度为5mmol/L)和高氯酸(浓度为1mol/L)溶液中进行循环伏安扫描(扫描范围0.0～+0.8V，扫描速率为10-100mV/s，扫描圈数为40)，扫描完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤5分钟；将电极放入1mL沉积底液(组成为同体积的：0.01mol/L HCl、0.1mol/L KCl、10μmol/L HAuCl4)中进行恒电位沉积(沉积电位为-0.5V，沉积时间为100-150秒)，沉积完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤5分钟，即得到修饰了金纳米粒的玻碳电极。

3.固定ApoB-100抗体：在修饰了纳米金粒子的电极表面滴加10μl20μg/ml的ApoB-100抗体，于37℃孵育1h，孵育完成后用纯水将未固定的抗体洗去，用pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤5min；在电极表面滴加10μl1％的BSA溶液，以封闭电极表面非特异性吸附位点，于37℃下进行封闭反应1h，反应完成后用含BSA(0.1％)的pH8.6的甘氨酸(0.1mol/L)-NaOH缓冲液冲洗干净。

4.检测LDL-C的标准曲线：在固定了ApoB-100抗体的电极表面滴加10μlLDL溶液，于37℃下孵育30min，免疫反应完成后，用pH8.6的甘氨酸(0.1mol/L)-NaOH缓冲液将未被捕获的LDL洗去；在电极表面滴加5μl 100μg/ml CHER酶液、5μl100μg/ml CHOD酶液、10μl5mMAgNO3溶液，于37℃下孵育30min，得到沉积有单质银的工作电极，酶催化反应完成后用pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤5min；在KNO3(1mol/L)溶液中，以洗涤后的电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，在电化学工作站上进行线性扫面LSV，扫描范围为-0.5～0.6V，扫描速率50mV/s，得到单质银的溶出伏安电流值。单质银的溶出伏安电流值(Y)大小在10ng/mL-1000ng/mL范围内与LDL-C的浓度(X)成线性关系，其线性方程为：Y＝0.9459+0.4413X，线性相关系数R²＝0.9982。图4为基于双酶协同催化银沉积反应原理检测LDL-C的电化学方法标准曲线，其中图4(a)传感器在不同浓度LDL-C下的响应电流；图4(b)传感器的工作曲线。

5.实际样本中LDL-C的检测：在固定了10μl20μg/ml ApoB-100抗体的电极表面，加入10μL LDL-C待测溶液，于37℃下孵育30min，免疫反应完成后，用pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液将未被捕获的LDL洗去；在电极表面滴加5μl100μg/ml CHER酶液、5μl 100μg/ml CHOD酶液、10μl5mM AgNO3溶液，于37℃下孵育30min得到沉积有单质银的工作电极，酶催化反应完成后用pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤5min；在1mol/L KNO3溶液中，以洗涤后的电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，在电化学工作站上进行线性扫描，扫描范围为-0.5～0.6V，扫描速率50mV/s，得到单质银的溶出伏安电流响应值分别为(23.6μA,217.3μA,395.7μA)。根据步骤4的标准曲线Y＝0.9459+0.4413X，可得到对应的实际样本溶液中LDL-C浓度分别为(51.3ng/mL,490.3ng/mL,894.5ng/mL)。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1.采用双酶协同催化银沉积原理来实现电化学检测LDL-C，检测时间短，背景干扰小，检测灵敏度高。

2.高分子聚合膜可为生物识别分子apoB-100抗体的固定提供位点，并有利于电子的传递。

3.在金纳米材料表面进行的免疫反应是一种界面反应体系，可提高ApoB-100抗体与LDL的反应效率

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。