一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法与流程

文档序号:15730045发布日期:2018-10-23 17:05阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种双酶协同催化银沉积检测低密度脂蛋白胆固醇的方法,其特征在于按照以下步骤进行:

1).电极的预处理:用颗粒大小为0.3μm和0.05μm的Al2O3悬浊液将玻碳电极表面打磨抛光至镜面,抛光后的电极依次在纯水、无水乙醇中分别磁力搅拌洗涤5min,用纯水冲洗再在纯水中磁力搅拌洗涤5min;将电极置于体积比3:7的30%H2O2和98%H2SO4配制的piraha溶液中浸泡1min,用纯水冲洗干净后再磁力搅拌洗涤5min;将电极置于0.5M H2SO4中于-0.3~+1.5V电位下进行循环伏安扫描10min活化电极表面,扫描范围-0.3~+1.5V,扫描速率为50-100mV/s,用纯水冲洗干净;将电极置于铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中分别进行循环伏安扫描、扫描条件:-0.5~+1.0V,50mV/s,和交流阻抗扫描、扫描条件:0.24V,1×105Hz,0.1Hz,最后用纯水冲洗晾干备用;

2).电极的修饰:将活化后的玻碳电极垂直浸入含浓度为5mmol/L的邻氨基苯硫酚和浓度为1mol/L的高氯酸溶液中进行循环伏安扫描,扫描范围0.0~+0.8V,扫描速率为10-100mV/s,扫描圈数为40,扫描完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤5分钟;将电极放入1mL沉积底液中进行恒电位沉积,沉积底液成分为同体积的:0.01mol/L HCl、0.1mol/L KCl、10μmol/L HAuCl4,沉积电位为-0.5V,沉积时间为100-150秒,沉积完成后用纯水进行磁力搅拌洗涤5分钟,即得到修饰了金纳米粒的玻碳电极;

3).固定ApoB-100抗体:在修饰了纳米金粒子的电极表面滴加10μl 20μg/ml的ApoB-100抗体,于37℃孵育1h,孵育完成后用纯水将未固定的抗体洗去,用pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤5min;在电极表面滴加10μl 1%的BSA溶液,以封闭电极表面非特异性吸附位点,于37℃下进行封闭反应1h,反应完成后用含0.1%BSA的pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液冲洗干净,甘氨酸-NaOH缓冲液中甘氨酸含量为0.1mol/L;

4).检测LDL-C的标准曲线:在固定了ApoB-100抗体的电极表面滴加10μl LDL溶液,于37℃下孵育30min,免疫反应完成后,用pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液将未被捕获的LDL洗去,甘氨酸-NaOH缓冲液中甘氨酸含量为0.1mol/L;在电极表面滴加5μl 100μg/ml CHER酶液、5μl 100μg/ml CHOD酶液、10 μl 5mM AgNO3溶液,于37℃下孵育30min,得到沉积有单质银的工作电极,酶催化反应完成后用pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤5min;在KNO3 1mol/L溶液中,以洗涤后的电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极,在电化学工作站上进行线性扫描LSV,扫描范围为-0.5~0.6V,扫描速率50mV/s,得到单质银的溶出伏安电流值,单质银的溶出伏安电流值Y大小在10ng/mL-1000ng/mL范围内与LDL-C的浓度X成线性关系,其线性方程为:Y=0.9459+0.4413X,线性相关系数R2=0.9982;

5).实际样本中LDL-C的检测:在固定了10μl 20μg/ml ApoB-100抗体的电极表面,加入10μL LDL-C待测溶液,于37℃下孵育30min,免疫反应完成后,用pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液将未被捕获的LDL洗去;在电极表面滴加5μl 100μg/ml CHER酶液、5μl 100μg/ml CHOD酶液、10μl 5mM AgNO3溶液,于37℃下孵育30min得到沉积有单质银的工作电极,酶催化反应完成后用pH8.6的甘氨酸-NaOH缓冲液进行磁力搅拌洗涤5min;在1mol/L KNO3溶液中,以洗涤后的电极为工作电极、铂电极为对电极、饱和甘汞电极为参比电极,在电化学工作站上进行线性扫描,扫描范围为-0.5~0.6V,扫描速率50mV/s,得到单质银的溶出伏安电流响应值分别为23.6μA,217.3μA,395.7μA,根据步骤4)的标准曲线Y=0.9459+0.4413X,得到对应的实际样本溶液中LDL-C浓度。

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