用于诊断宫颈炎和宫颈癌的生物标志物组合物的制作方法

本发明涉及一种生物标志物组合物，进一步具体涉及用于诊断宫颈炎和宫颈癌的生物标志物组合物。

背景技术：

宫颈炎是妇科常见疾病之一，包括子宫颈阴道部炎症及子宫颈管黏膜炎症。因子宫颈管阴道部鳞状上皮与阴道鳞状相延续，阴道炎症均可引起子宫颈阴道部炎症。由于子宫颈管黏膜上皮为单层柱状上皮，抗感染能力较差，易发生感染。临床多见的子宫颈炎是急性子宫颈管黏膜炎，若急性子宫颈炎未经及时诊治或病原体持续存在，可导致慢性子宫颈炎症。

宫颈癌是妇女中的第二大常见肿瘤，大约占所有女性癌症的12％，每年导致大约250,000人死亡。大部分宫颈癌的病例表现为鳞状细胞癌，尽管也观察到腺癌。可通过人群筛查来预防宫颈癌，因为其通过已完全明确的非浸润上皮内阶段演化而来，所述阶段可通过形态学方法进行辨别。

已证实宫颈癌和通过高危型的人乳头瘤病毒(HPV)例如16、18和31型的感染之间的强关联性。事实上，大量流行病学和分子生物学证据已将HPV感染确定为宫颈癌的病因因素。此外，在85％或更多的高度子宫颈疾病的病例中发现了HPV。然而，HPV感染非常普遍，可能在5-15％超过30岁的妇女中发生，但很少有HPV阳性的妇女会发展成高度子宫颈疾病或癌症。单独的HPV存在只是感染的指标，而不是高度子宫颈疾病的指标，因此，只对HPV感染进行检测导致许多假阳性。在许多不能进行大规模筛查程序的发展中国家，临床问题更加严重。在这些国家，宫颈癌是妇女中癌症死亡的头号病因。

针对上述问题，本发明提供了一种用于诊断宫颈炎和宫颈癌的生物标志物组合物，能够快速、准确、方便的诊断宫颈炎和宫颈癌疾病。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明第一个方面提供了一种用于诊断宫颈炎和宫颈癌的生物标志物组合物，至少包括5'-尿苷酸二钠、组胺、3'-甲氧基鸟苷、苯基乳酸一种或几种的组合。

本发明第二个方面提供了一种用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括：5'-尿苷酸二钠、L-半胱氨酸、异柠檬酸、二磷酸尿苷葡糖、一磷酸腺苷、次黄苷5'—单磷酸、L-六氢吡啶羧酸、N-乙酰腐胺、蔗糖一种或几种的组合。

本发明第三个方面提供了一种用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括：组胺、苯基乳酸、柠康酸、L-2-氨基己二酸、3'-O-甲氧基鸟苷、β-D-葡萄糖胺、甘油、胆固醇硫酸酯一种或几种的组合。

本发明第四个方面提供了获取上述的生物标志物组合物的方法，步骤至少包括，

获取受试者样品，并进行前处理；

将上述前处理的受试者样品进行GC-MS或者LC-MS进行检测，并收集数据；

分析上述收集数据，获取可行的标志物。

本发明第五个方面提供了生物标志物组合物诊断宫颈炎的方法，所述方法包括：

在受试者的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

在正常对照组的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

其中，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平和正常对照组样本的水平相比，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者具有宫颈炎。

本发明第六个方面提供了生物标志物组合物诊断宫颈癌的方法，所述方法包括：

在受试者的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

在正常对照组的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

其中，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平和正常对照组样本的水平相比，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者具有宫颈癌。

本发明第七个方面提供了生物标志物组合物区分宫颈炎和宫颈癌的方法，所述方法包括：

在受试者的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

在正常对照组的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

其中，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平和正常对照组样本的水平相比，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者具有宫颈癌。

本发明第八个方面提供了用于确定患有宫颈癌的受试者是否将对疗法有反应的方法，所述方法包括：

在受试者的样品中测定上述的一种或多种生物标志物组合物的水平；

将受试者样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平与对照样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平相比，受试者样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者将对所述疗法有反应。

本发明第九个方面提供了用于患有宫颈癌的受试者中监测治疗功效的方法，所述方法包括：

在开始所述治疗之前，在来自受试者的第一样品中测定上述一种或多种生物标志物组合物的水平；

在已给予所述治疗的至少一部分之后，在来自受试者的第二样品中测定上述一种或多种生物标志物组合物的水平；

将第一样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平与对应第二样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平相比较，第二样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者将对所述治疗有疗效。

本发明第十个方面提供了用于确定受试者是否具有或将发展宫颈癌的试剂盒，所述试剂盒包括上述生物标志物组合物。

说明书附图

图1：实施例15，以5'-尿苷酸二钠、组胺、3'-甲氧基鸟苷和苯基乳酸为标志物的ROC图；

图2：实施例16，以以5'-尿苷酸二钠、L-半胱氨酸、异柠檬酸、二磷酸尿苷葡糖、一磷酸腺苷、次黄苷5'—单磷酸、L-六氢吡啶羧酸、N-乙酰腐胺、蔗糖组合为标志物的ROC图；

图3：实施例17，以以组胺、苯基乳酸、柠康酸、L-2-氨基己二酸、3'-O-甲氧基鸟苷、β-D-葡萄糖胺、甘油、胆固醇硫酸酯组合为标志物的ROC图；

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。

此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。

如本文所用，以下术语的每一个具有与其在本部分中相关的含义。冠词"一个"和"一种"在本文用于指该冠词的一个或超过一个(即至少一个)的语法对象。例如，"要素"意指一个要素或超过一个要素。

如本文所用，术语“灵敏度”定义为测定(例如,方法,测试)性能的统计学量度，通过真阳性数除以真阳性和假阴性的和来计算。

如本文所用，术语“特异性”定义为测定(例如,方法,测试)性能的统计学量度，通过真阴性数除以真阴性和假阳性之和来计算。

如本文所用，术语“信息指示的”或“信息指示”指称标志物或标志物组的质量，及特别指称在阳性样品中发现标志物(或标志物组)的似然性。

如本文所用，术语“标志物”或“生物标志物”是与另一种表型状态(例如未患有疾病)相比，在取自一种表型状态(例如患有疾病)的受试者的样品中差别存在的有机生物分子。如果在不同组中生物标志物的平均或中位水平、例如表达水平经计算为统计学显著的，则生物标志物在不同的表型状态中差别存在。统计学显著性的常见检验特别包括t-检验、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和优势比。单独或组合的生物标志物提供受试者属于一种表型状态或另一种表型状态的相对风险的度量。因此，它们用作标志物，例如，用于疾病(预后和诊断)、药物的治疗功效(治疗诊断学)和药物毒性的标志物。

用于本发明的生物标志物组合物和方法的标志物的准确性可通过接收器工作特征曲线(“ROC曲线”)来表征。ROC是对于诊断标志物的不同可能的割点的真阳性率相对假阳性率的曲线。ROC曲线显示灵敏性和特异性之间的关系。即是说，灵敏性的增加将伴随特异性的降低。曲线越靠近ROC空间的左轴，然后顶缘，标志物越准确。相反地，曲线越靠近ROC图的45度对角线，标志物越不准确。ROC下的面积是标志物准确性的度量。标志物的准确性取决于标志物如何适当地将待测试的组分成具有所述疾病的组和不具有所述疾病的组。曲线下面积(称为“AUC”)为1表示完美的标志物，而面积为0.5表示有用性较差的标志物。因此，在一些实施方案中，本发明的生物标志物和方法的AUC大于约0.50、大于约0.60或大于约0.70。

如本文所用，术语“宫颈炎”，指和宫颈组织或子宫颈细胞相关的任何发炎性病变。包括但不限于宫颈息肉、宫颈糜烂、宫颈纳囊、黏液脓性宫颈炎、宫颈糜烂、宫颈管息肉、宫颈肥大和宫颈腺囊肿等疾病。

如本文所用，术语“宫颈癌”，指和宫颈组织或子宫颈细胞相关的任何癌症或癌症病变。包括但不限于子宫原位癌、扩散性癌、转移癌以及癌前状态(如，发育异常，包括CIN或SIL)。基于HPV型和宫颈癌以及癌前病变的相关性已将其分为高危型和低危型类别。低危HPV型包括6、11、42、43、44型，并且和增加的宫颈癌风险无关。相反地，高危HPV型，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型，和宫颈癌以及鳞状上皮内病变强烈相关。

如本文所用，术语"受试者"指称任何动物(例如,哺乳动物)，包括但不限于人，非-人灵长类动物，啮齿动物等，尤其是特定处理的受试者。一般而言，在说到人受试者时，术语"受试者"和"患者"在本文互换使用。

如本文所用，术语“标志物的水平”或“生物标志物的水平”是指在待测试的样品中存在的标志物的量。标志物的水平可以是绝对水平或量(例如μg/ml)或相对水平或量(例如相对信号强度)。

如本文所用，标志物的“更高水平”或“水平增加”是指大于用于评估标志物水平的测定法的标准误差的试验样品中的标志物水平，和优选为对照样品中标志物水平。

如本文所用，标志物的“更低水平”或“水平降低”是指小于用于评估标志物水平的测定法的标准误差的试验样品中的标志物的水平，和优选为对照样品中标志物水平。

如本文所用，术语“已知的标准水平”或“对照水平”是指标志物的公认的或预定的水平，其用于比较源自受试者的样品中的标志物的水平。

标志物的对照水平基于来自具有正常健康的受试者的样品中的标志物的水平。

在一些实施方式中，标志物的对照水平基于来自具有诊断宫颈炎和宫颈癌的一个或多个受试者的样品中的标志物的水平。

本发明也涉及用于诊断、疾病分期、预测、监测和治疗子宫颈癌的各种方法、试剂和试剂盒。

如本文所用的，术语"患者"或“受试者”是指人和非人动物，例如兽医学患者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在一个实施方案中，所述受试者是人。

如本文所用，术语"非-人动物"指称全部非-人动物包括，但不限于，脊椎动物，诸如啮齿动物，非-人灵长类动物，绵羊，牛，反刍动物，兔类动物，猪，山羊，马科动物，犬科动物，猫科动物，鸟类，等。

在一些实施方案中，受试者的体重指数(BMI)为小于约40kg/m2(例如约40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或约18kg/m²)。在其它实施方案中，受试者的体重指数(BMI)为大于约40kg/m²(例如约41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或约80kg/m²)。

本文所用的术语“样品”是指自受试者分离的类似细胞或组织的收集物，以及在受试者内存在的组织、细胞和流体。术语“样品”包括来自受试者的任何体液(例如血液、淋巴、妇科流体、囊液、尿液、眼泪和通过支气管灌洗和/或腹膜冲洗收集的流体)或细胞。在一个实施方案中，从受试者取出所述组织或细胞。在另一实施方案中，所述或细胞存在于所述受试者内。其它受试者样品包括泪滴、血清、脑脊液、粪便、痰和细胞提取物。在一个实施方案中，生物学样品包含来自测试受试者的蛋白分子。在另一实施方案中，生物学样品可包含来自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。

术语"测定"意指包括检测样品中标志物的存在或不存在、定量测定样品中标志物的量、和/或确定生物标志物的类型的方法。测量可通过本领域已知的方法和本文进一步描述的那些方法实现。

如本文所用的，术语"调节"的各种形式意图包括刺激(例如增加或增量调节特定的反应或活性)和抑制(例如降低或减量调节特定的反应或活性)。

试剂盒是包含特异性检测本发明的标志物的至少一种试剂例如探针、引物或抗体的任何制品(例如包装或容器)，所述制品作为用于进行本发明的方法的一个单位来推销、分配或销售。在某些实施方案中，试剂盒可包括基质，例如包含本发明的一种或多种标志物的捕获试剂和/或与本发明的一种或多种标志物结合的捕获试剂的基质。在一些实施方案中，这样的试剂盒包含用于使用质谱测定标志物的水平的使用说明书。

标志物组合物

本发明第一个方面提供了一种用于诊断宫颈炎和宫颈癌的生物标志物组合物，至少包括5'-尿苷酸二钠、组胺、3'-甲氧基鸟苷、苯基乳酸一种或几种的组合。

术语“标志物”即生物标志物，可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。生物标志物是生物体受到严重损害之前，在不同生物学水平(分子、细胞、个体等)上因受环境污染物影响而异常化的信号指标。它可以对严重毒性伤害提供早期警报。这种信号指标可以是细胞分子结构和功能的变化、可以是某一生化代谢过程的变化或生成异常的代谢产物或其含量，可以是某一生理活动或某一生理活性物质的异常表现，可以是个体表现出的异常现象，可以是种群或群落的异常变化，可以是生态系统的异常变化。

在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物是5'-尿苷酸二钠。在一个实施方案中，生物标志物组合物是组胺。在一个实施方案中，生物标志物组合物是3'—甲氧基鸟苷。在一个实施方案中，生物标志物组合物是苯基乳酸。

在本发明的其它方面，超过一种标志物，例如多种标志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多种标志物，可用于本发明的生物标志物组合物。例如，在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物包括5'-尿苷酸二钠和组胺。在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物包括5'-尿苷酸二钠和3'—甲氧基鸟苷。在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物包括5'-尿苷酸二钠和苯基乳酸。在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物包括组胺和3'-甲氧基鸟苷。在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物包括组胺和苯基乳酸。在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物包括3'-甲氧基鸟苷和苯基乳酸。在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物包括5'-尿苷酸二钠、组胺和3'-甲氧基鸟苷。在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物包括5'-尿苷酸二钠、组胺和苯基乳酸。在一个实施方案中，用于本发明生物标志物组合物包括5'-尿苷酸二钠、组胺、3'-甲氧基鸟苷和苯基乳酸。

在一种优选的实施方式中，所述用于诊断宫颈炎和宫颈癌的生物标志物组合物的P值小于0.05。

阈值(P值)：统计学上的量，代表结果显著性。P值<0.05代表随机误差产生这种结果的概率小于0.05。

本发明第二个方面提供了一种用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括：5'-尿苷酸二钠、L-半胱氨酸、异柠檬酸、二磷酸尿苷葡糖、一磷酸腺苷、次黄苷5'-单磷酸、L-六氢吡啶羧酸、N-乙酰腐胺、蔗糖一种或几种的组合。

在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括5'-尿苷酸二钠。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括L-半胱氨酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括异柠檬酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括二磷酸尿苷葡糖。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括一磷酸腺苷。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括次黄苷5'-单磷酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括L-六氢吡啶羧酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括N-乙酰腐胺。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括蔗糖。

在本发明的其它方面，超过一种标志物，例如多种标志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多种标志物，可用于本发明的生物标志物组合物。例如，在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括5'-尿苷酸二钠和L-半胱氨酸的组合。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括5'-尿苷酸二钠和异柠檬酸的组合。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括5'-尿苷酸二钠和二磷酸尿苷葡糖的组合。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括5'-尿苷酸二钠和一磷酸腺苷。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括5'-尿苷酸二钠和次黄苷5'-单磷酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括5'-尿苷酸二钠和L-六氢吡啶羧酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括5'-尿苷酸二钠和N-乙酰腐胺。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括5'-尿苷酸二钠和蔗糖。

在一种最优选的实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括：5'-尿苷酸二钠、L-半胱氨酸、异柠檬酸、二磷酸尿苷葡糖、一磷酸腺苷、次黄苷5'-单磷酸、L-六氢吡啶羧酸、N-乙酰腐胺、蔗糖的组合。

在一种优选的实施方式中，所述用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物的P值小于0.05。

阈值(P值)：统计学上的量，代表结果显著性。P值<0.05代表随机误差产生这种结果的概率小于0.05。

本发明第三个方面提供了一种用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括：组胺、苯基乳酸、柠康酸、L-2-氨基己二酸、3'-O-甲氧基鸟苷、β-D-葡萄糖胺、甘油、胆固醇硫酸酯的组合。

在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括苯基乳酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括柠康酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括L-2-氨基己二酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括3'-O-甲氧基鸟苷。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括β-D-葡萄糖胺。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括甘油。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括胆固醇硫酸酯。

在本发明的其它方面，超过一种标志物，例如多种标志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多种标志物，可用于本发明的生物标志物组合物。例如，在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺和苯基乳酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺和柠康酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺和L-2-氨基己二酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺和3'-O-甲氧基鸟苷。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺和β-D-葡萄糖胺。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺和甘油。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺和胆固醇硫酸酯。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸和柠康酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸和L-2-氨基己二酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸和3'-O-甲氧基鸟苷。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸和β-D-葡萄糖胺。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸和甘油。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸和胆固醇硫酸酯。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸、柠康酸和L-2-氨基己二酸。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸、柠康酸和3'-O-甲氧基鸟苷。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸、柠康酸和β-D-葡萄糖胺。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸、柠康酸和甘油。在一种实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸、柠康酸和胆固醇硫酸酯。

在一种最优的实施方式中，所述用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括组胺、苯基乳酸、柠康酸、L-2-氨基己二酸、3'-O-甲氧基鸟苷、β-D-葡萄糖胺、甘油、胆固醇硫酸酯的组合。

本发明的第四个方面提供了一种获取上述生物标志物组合物的方法，其步骤至少包括，

获取受试者样品，并进行前处理；

将上述前处理的受试者样品进行GC-MS或者LC-MS进行检测，并收集数据；

分析上述收集数据，获取可行的标志物。

本发明中采用血浆学代谢组学的方法来筛查并鉴定获取生物标志物组合物。

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后迅速崛起的一门新兴学科，已成为系统生物学的重要组成部分。代谢组学是研究生物体系受外部刺激或扰动后所产生的内源性代谢物整体及其变化规律的科学，是探明生物体系代谢途径的研究方法细胞内许多生命活动发生于代谢层面，如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等，机体内任何生理或病理改变都离不开代谢过程及其组分的变化。

代谢组学的研究样本可以是生物体液(如血浆、尿液、唾液等)、细胞提取物、细胞培养液和组织等。其中心任务包括检测、量化和编录生物内源性代谢物质的整体及其变化规律，并且通过这种变化规律探究所发生的生物学事件或过程的本质。代谢组学的研究对象是相对分子质量1000Da以下的小分子物质，包括：糖类、氨基酸、脂类、有机酸、肉碱等。

代谢组学的研究，一般包括样品的采集及制备、代谢物组数据的采集、预处理、多变量统计分析和代谢途径分析等步骤：获取生物样本、样品前处理、进行分析测试技术的分析处理、靶向或非靶向分析、数据预处理、多元变量分析和可能的生物标志物的确定。

样品的采集和制备是代谢组学研宄中的最初始的步骤，也是最重要的步骤之一。可应用于代谢组学研宄的体液除常见的血液(血清、血浆)和尿液外，还包括：脑脊液，腹水，羊水，精液，消化液，肺吸气等。

目前，常用的分析测试技术为以核磁共振谱(NMR)、质谱(MS)为核心的分析技术以及色谱与波谱联用技术，包括：NMR、LC-NMR或LC-NMR-MS、LC-MS和GC-MS等。NMR技术具有无偏向性、无损伤样品等特点，但该技术灵敏度低、检测动态范围窄。MS及MS/MS技术具有较高的灵敏度和专属性，可以实现多个化合物的同时快速检测和定量分析。

数据预处理与分析：在代谢组学研究中，海量数据的预处理、分析和管理需要专门的数学、统计学和生物信息学工具。其中，NMR谱数据需要首先把谱信号分成很多小单元(bins)，然后进行基线校正和整合,降低水抑制效应带来的变异和尿素的交叉驰豫效应；基于MS的分析方法，是对一定质荷比(zw/z)范围进行全扫描的基础上，将获得的数据分成若干小窗，方便计算机分区域进行峰匹配。

由于生物样品中代谢物组分复杂、含量差异大，高含量化合物容易掩盖低含量化合物的变化，往往使一些含量较低但具有重要生物学意义的代谢物组分不能被识别。因此，需要对数据进行标度化，以消除不同代谢物的尺度差异。

多元变量分析：也称多变量分析或者多元统计分析，主要研究多个变量的集合之间的关系以及具有这些变量的个体之间的关系。简单地说，就是研究n个观测对象集合之间特征的方法，其中对每个对象观测p个因素(变量)。观测对象的集合可以是整个集合，也可以是取自较大集合的一个或多个子集；可以是固定的，也可以是随机的；可以是类型变量，也可以是数量变量；数量变量可以是连续的，也可以是离散的；并且变量集本身可以是取自较大变量集合的一个或多个子集。

在一种实施方式中，所述受试者样品可以是固体、液体，也可以是细胞、微生物等。

在一种实施方式中，当所述受试者样品为固体时，所述具体前处理的方法为：将100mg固体溶于400μL提取试剂，加入钢珠进行研磨，所述研磨的条件为30Hz，7分钟；然后进行离心，取上清。

若要进行GC-MS测试，可进行浓缩干燥。所述浓缩干燥的步骤为将上清中加入20mg/ml的甲氧胺，在60℃下干燥30min，然后加入试剂BSTFA下进行衍生化处理2小时后，进行测试。

若要进行LC-MS测试，则只需将上清液进行浓缩干燥，加入100μL乙腈进行复溶，经过滤塞，可直接进行LC-MS测试。

在一种实施方式中，所述受试者样品为液体时，例如血清、尿液等。所述具体前处理的方法为：100μL液体加入400μL甲醇中，进行斡旋混匀，高速离心，取上清液，进行测试。

若要进行GC-MS测试，可进行浓缩干燥。所述浓缩干燥的步骤为将上清中加入20mg/ml的甲氧胺，在60℃下干燥30min，然后加入试剂BSTFA下进行衍生化处理2小时后，进行测试。

若要进行LC-MS测试，则只需将上清液进行浓缩干燥，加入100μL乙腈进行复溶，经过滤塞，可直接进行LC-MS测试。

在一种实施方式中，所述受试者样品为微生物时，所述处理方式与细胞的处理方式一样。

本发明第五个方面提供了生物标志物组合物诊断宫颈炎的方法，所述方法包括：

在受试者的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

在正常对照组的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

其中，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平和正常对照组样本的水平相比，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者具有宫颈炎。

在一种实施方式中，所述受试者的组织样本可以流体样本或组织样本。所述流体样本可以是体液，所述体液包括，例如，血液、淋巴液、腹水、妇科分泌液、子宫液、子宫冲洗收集液、子宫渗出液、子宫颈渗出液、胆囊液、胸膜液、尿液和通过阴道冲洗收集的液体等。

所述对照样品可以是健康受试者的样品。

本发明第六个方面提供了生物标志物组合物诊断宫颈癌的方法，所述方法包括：

在受试者的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

在正常对照组的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

其中，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平和正常对照组样本的水平相比，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者具有宫颈癌。

在一种实施方式中，所述受试者的组织样本可以流体样本或组织样本。所述流体样本可以是体液，所述体液包括，例如，血液、淋巴液、腹水、妇科分泌液、子宫液、子宫冲洗收集液、子宫渗出液、子宫颈渗出液、胆囊液、胸膜液、尿液和通过阴道冲洗收集的液体等。

所述对照样品可以是健康受试者的样品。

本发明第七个方面提供了生物标志物组合物区分宫颈炎和宫颈癌的方法，所述方法包括：

在受试者的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

在正常对照组的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

其中，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平和正常对照组样本的水平相比，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者具有宫颈癌。

本发明第八个方面提供了用于确定患有宫颈癌的受试者是否将对疗法有反应的方法，所述方法包括：

在受试者的样品中测定上述的一种或多种生物标志物组合物的水平；

将受试者样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平与对照样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平相比，受试者样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者将对所述疗法有反应。

本发明第九个方面提供了用于患有宫颈癌的受试者中监测治疗功效的方法，所述方法包括：

在开始所述治疗之前，在来自受试者的第一样品中测定上述一种或多种生物标志物组合物的水平；

在已给予所述治疗的至少一部分之后，在来自受试者的第二样品中测定上述一种或多种生物标志物组合物的水平；

将第一样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平与对应第二样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平相比较，第二样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者将对所述治疗有疗效。

本发明第十个方面提供了用于确定受试者是否具有或将发展宫颈癌的试剂盒，所述试剂盒包括上述生物标志物组合物。

试剂盒用于评估患者是否患宫颈炎的试剂盒。所述“试剂盒”是指包含至少一种用于特异性地检测本发明生物标志物表达的试剂，例如抗体、核酸探针等的任何产品(例如，包装盒或容器)。所述试剂盒包含一种用于评估本发明标记物表达的试剂。所述试剂盒包含一种用于评估本发明标记物表达的试剂，和可还包含一或多种上述试剂。

在本发明的任何方法和试剂盒中，获自受试者的样品中本发明的标志物的水平可通过各种众所周知的技术和方法中任一种来测定，其将样品中的本发明的标志物转化成可检测和定量的部分。这样的方法的非限制性实例包括使用用于检测蛋白质的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法、免疫印迹法、但报纸印迹法、RNA印迹法、电子显微术、质谱法、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法、基于血液的定量测定法、基于尿液的定量测定法、流式细胞术、DNA杂交、陈列分析等和其组合或亚组合分析样品。

试剂盒可以作为进行本发明方法的单位形式推销、分发或销售。此外，试剂盒可包含描述试剂盒和其使用方法的说明书。

本发明的试剂盒可进一步包括用于培养获自受试者的样品的试剂。

在一种优选的实施方式中，试剂盒经设计用于人类受试者。

本发明通过以下实施例作进一步说明，实施例不应解释为进一步限制。本申请全文所引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及附图，明确地通过引用以其整体结合到本文中。

实施方式

实施方式1：实施方式1提供了一种用于诊断宫颈炎和宫颈癌的生物标志物组合物，至少包括5'-尿苷酸二钠、组胺、3'-甲氧基鸟苷、苯基乳酸一种或几种的组合。

实施方式2：实施方式2提供了一种用于诊断宫颈炎的生物标志物组合物，包括：5'-尿苷酸二钠、L-半胱氨酸、异柠檬酸、二磷酸尿苷葡糖、一磷酸腺苷、次黄苷5'—单磷酸、L-六氢吡啶羧酸、N-乙酰腐胺、蔗糖一种或几种的组合。

实施方式3：实施方式3提供了用于诊断宫颈癌的生物标志物组合物，包括：组胺、苯基乳酸、柠康酸、L-2-氨基己二酸、3'-O-甲氧基鸟苷、β-D-葡萄糖胺、甘油、胆固醇硫酸酯一种或几种的组合。

实施方式4：实施方式4提供了获取权利要求实施方式1至实施方式3所述的生物标志物组合物的方法，步骤至少包括，

获取受试者样品，并进行前处理；

将上述前处理的受试者样品进行GC-MS或者LC-MS进行检测，并收集数据；

分析上述收集数据，获取可行的标志物。

实施方式5：实施方式5提供了生物标志物组合物诊断宫颈炎的方法，所述方法包括：

在受试者的组织样本中测定实施方式2所述生物标志物组合物的水平；

在正常对照组的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

其中，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平和正常对照组样本的水平相比，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者具有宫颈炎。

实施方式6：实施方式6提供了实施方式3所述的生物标志物组合物诊断宫颈癌的方法，所述方法包括：

在受试者的组织样本中测定实施方式3所述生物标志物组合物的水平；

在正常对照组的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

其中，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平和正常对照组样本的水平相比，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者具有宫颈癌。

实施方式7：实施方式7提供了实施方式1所述的生物标志物组合物区分宫颈炎和宫颈癌的方法，所述方法包括：

在受试者的组织样本中测定实施方式1所述生物标志物组合物的水平；

在正常对照组的组织样本中测定上述生物标志物组合物的水平；

其中，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平和正常对照组样本的水平相比，受试者样本中所述生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者具有宫颈癌。

实施方式8：实施方式8提供了用于确定患有宫颈癌的受试者是否将对疗法有反应的方法，所述方法包括：

在受试者的样品中测定实施方式3所述的一种或多种生物标志物组合物的水平；

将受试者样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平与对照样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平相比，受试者样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者将对所述疗法有反应。

实施方式9：实施方式3提供了用于患有宫颈癌的受试者中监测治疗功效的方法，所述方法包括：

在开始所述治疗之前，在来自受试者的第一样品中测定实施方式2中所述一种或多种生物标志物组合物的水平；

在已给予所述治疗的至少一部分之后，在来自受试者的第二样品中测定实施方式3中所述一种或多种生物标志物组合物的水平；

将第一样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平与对应第二样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平相比较，第二样品中的一种或多种生物标志物组合物的水平的差异指示所述受试者将对所述治疗有疗效。

实施方式10：实施方式10提供了用于确定受试者是否具有或将发展宫颈癌的试剂盒，所述试剂盒包括如实施方式3所述的一种或多种生物标志物组合物。

具体实施例

分组：分为慢性宫颈炎组、急性宫颈炎组、宫颈癌组；

选取1500个受试者，其中患有宫颈癌500人；患有慢性宫颈炎500人；患有急性宫颈炎500人。

一、获取标志物

步骤：1、获取受试者血液，并进行前处理：100μL液体加入400μL甲醇中，进行斡旋混匀，高速离心，取上清液，进行浓缩干燥，加入100μL乙腈进行复溶，经过滤塞，可直接进行UHPLC-QQQ-MS测试；收集UHPLC-QQQ-MS数据，进行多元变量统计分析。

采用UHPLC-QQQ-MS定量验证后发现宫颈炎组，与正常人组相比，特异高表达物质有：5'-尿苷酸二钠、组胺、3'-甲氧基鸟苷、苯基乳酸。对数据进行t检验，以T-test的p值(阈值<0.05)来确定差异性表达代谢物，

标志物组合物诊断区分宫颈炎和宫颈癌

实施例1以5'-尿苷酸二钠为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.5455，诊断灵敏度为89.66％，特异度为50％。

实施例2以组胺为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.7853，诊断灵敏度为68.97％，特异度为13.64％。

实施例3以3'-甲氧基鸟苷为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.7457，诊断灵敏度为45.45％，特异度为13.79％。

实施例4以苯基乳酸为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.7226，诊断灵敏度为89.66％，特异度为45.45％。

实施例5以5'-尿苷酸二钠和组胺为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.8025，诊断灵敏度为86.36％，特异度为31.03％。

实施例6以5'-尿苷酸二钠和3'-甲氧基鸟苷为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.7445，诊断灵敏度为54.55％，特异度为6.89％。

实施例7以5'-尿苷酸二钠和苯基乳酸为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.7884，诊断灵敏度为63.64％，特异度为13.79％。

实施例8以组胺和3'-甲氧基鸟苷为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.8339，诊断灵敏度为77.27％，特异度为17.24％。、

实施例9以组胺和苯基乳酸为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.8464，诊断灵敏度为86.36％，特异度为20.69％。

实施例10以3'-甲氧基鸟苷和苯基乳酸为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.7351，诊断灵敏度为72.73％，特异度为20.69％。

实施例11以5'-尿苷酸二钠、组胺和3'-甲氧基鸟苷为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.8664，诊断灵敏度为93.81％，特异度为13.41％。

实施例12以5'-尿苷酸二钠、组胺和苯基乳酸为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.8495，诊断灵敏度为68.18％，特异度为10.34％。

实施例13以5'-尿苷酸二钠、3'-甲氧基鸟苷和苯基乳酸为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.8088，诊断灵敏度为54.55％，特异度为3.44％。

实施例14以组胺、3'-甲氧基鸟苷和苯基乳酸为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.8511，诊断灵敏度为81.82％，特异度为17.24％。

实施例15以5'-尿苷酸二钠、组胺、3'-甲氧基鸟苷和苯基乳酸为标志物

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为0.8699，诊断灵敏度为86.36％，特异度为13.79％。

二、诊断宫颈炎

分组：分为正常组、慢性宫颈炎组、急性宫颈炎组；

选取1500个受试者，其中正常健康500人；慢性宫颈炎500人；急性宫颈炎500人。

实施例16以5'-尿苷酸二钠、L-半胱氨酸、异柠檬酸、二磷酸尿苷葡糖、一磷酸腺苷、次黄苷5'—单磷酸、L-六氢吡啶羧酸、N-乙酰腐胺、蔗糖组合为标志物。

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为1，诊断灵敏度为100％，特异度为0％。

三、诊断宫颈癌

分组：分为正常组、宫颈癌；

选取1000个受试者，其中正常健康500人；宫颈癌500人。

实施例17以组胺、苯基乳酸、柠康酸、L-2-氨基己二酸、3'-O-甲氧基鸟苷、β-D-葡萄糖胺、甘油、胆固醇硫酸酯组合为标志物。

经过ROC曲线(受试者工作特征曲线)测试，可知AUC(ROC曲线下的面积)为1，诊断灵敏度为100％，特异度为0％。

前述的实例仅是说明性的，用于解释本公开的特征的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。而且在科技上的进步将形成由于语言表达的不准确的原因而未被目前考虑的可能的等同物或子替换，且这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的权利要求覆盖。