本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种肝癌乏氧的分子标志物PKM2及其在精准诊断试剂盒中的应用，包括通过该生物分子标志物在肝癌乏氧表型高危人群的筛选、肝癌乏氧水平的诊测、肝癌乏氧靶向治疗及状况监测、肝癌乏氧指导用药的监测及肝癌乏氧治疗预后检测等领域的应用。
背景技术：
：肝癌是我国和东南亚地区的多发病和常见病。尤其在我国，每年约有12万人死于此病，约占全世界每年肝癌总死亡人数的42％。近年来，肝癌在我国的发病率还有逐渐增高的趋势。目前，我国肝癌的发病率已由恶性肿瘤的第三位升至第二位，在城市仅次于肺癌，在农村仅次于胃癌。肝癌具有起病隐匿、潜伏期长、高度恶性、进展快、侵袭性强、易复发转移、预后差等特点，肝癌的早期诊断和临床治疗疗效均不是十分理想。肝癌乏氧休眠是指肝脏肿瘤组织内部或其小/微转移灶处由于肿瘤乏氧微环境的形成，导致肝癌细胞周期进入G0～G1期静止状态但仍具有增殖潜能。肝癌细胞乏氧休眠现象临床上非常普遍，但各种治疗方案干预后乏氧表型的癌细胞休眠激活是导致肝癌复发和转移的主要根源。许多肝癌患者临床上经组合方案治疗后，体内已无明显癌灶，但在血液、骨髓、淋巴等其他部位存在乏氧休眠的小/微残余癌灶。部分患者在原发癌治疗前，癌细胞转移和乏氧休眠可能早已经发生。由于乏氧表型的原发癌能释放新生血管抑制因子或转移灶特质性的乏氧微环境，使肝癌乏氧休眠临床较为常见，表现为原发肝癌根治不久，整个肝脏、肺、骨骼等多处乏氧休眠的微/小转移灶暴发性生长。由于乏氧休眠的癌细胞对传统放化疗均不敏感、数量较少，且常规临床手段(如X线、超声、CT、MR及PET等)难以有效检测。近年来，虽然有部分研究者认为检测骨髓中DTC(散播肿瘤细胞)和外周血CTC(循环肿瘤细胞)有可能相对地反映患者全身肿瘤乏氧休眠状况，但不容回避的是：骨髓DTC检测在预测转移性复发时存在负相关失效，而CTC半衰期太短(1～2.4h)且易快速凋亡。更何况，各种富集DTC和CTC方法均有缺点：基于大小分离受限于肿瘤细胞大小可变且白细胞会堵塞滤孔，免疫磁珠阳性筛选会漏选不表达靶抗原的DTC和CTC。另外，目前国内外对肝癌乏氧休眠细胞的精准检测还没有报道，这说明，基础研究与临床诊疗实践对肝癌细胞乏氧休眠认知和探究还十分有限，亟需建立可特异精准甄别和靶向肝癌乏氧休眠细胞的特异分子标志物。问题的关键在于，肝癌乏氧休眠细胞是一群数量极少且难以检测的静止细胞。迄今为止，国内外尚缺乏一种特异的分子标志物可以将肝癌乏氧休眠细胞与快速增殖的肝癌细胞或正常肝组织细胞区别开来。由于在体外条件下进行乏氧培养能诱导肿瘤细胞进入静止休眠状态，绝大多数细胞乏氧应激后处于细胞周期G1/G0时相，并且能显著诱导肿瘤细胞进行代谢重编程，出现一些全新的代谢表型。这些现象综合提示，体外乏氧培养可以诱导癌细胞进入休眠状态。通过乏氧培养筛选制备癌细胞乏氧结合的特异抗体，继而基于乏氧特异结合的抗体通过鉴定其相应抗原蛋白，可以挖掘出肝癌休眠细胞乏氧表型的特异分子标志物。我们通过细胞常氧扣除筛选结合乏氧正向筛选，从噬菌体抗体库中淘筛到对肝癌细胞乏氧特异结合的人源抗体。用ProteinLbeads对其抗原亲和富集免疫沉淀后LCMS/MS质谱鉴定发现，乏氧特异结合抗体对应的抗原蛋白为肿瘤代谢标志分子：丙酮酸激酶转录变异体2(PyruvatekinaseIsoformM2，PKM2)。免疫组化染色表明，PKM2在中、高分化肝细胞肝癌组织呈阳性结合，而与低分化肝癌组织和癌旁非瘤肝组织无结合。最为重要的是，PKM2在肝细胞肝癌和混杂肝内胆管癌的乏氧坏死组织区域呈现出强阳性结合，在肝癌组织微血管匮乏的氧供不足区域也呈强阳性结合，从而综合表现出乏氧特异的结合谱症。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种肝癌乏氧表型特异的分子标志物PKM2，以及肝癌乏氧诊断试剂盒，以及该肝癌乏氧分子标志物和肝癌乏氧诊断试剂盒在肝癌乏氧表型高危人群的筛选、肝癌乏氧水平诊测、肝癌乏氧靶向治疗及状况监测、肝癌乏氧指导用药的监测及肝癌乏氧治疗预后检测等领域的应用。根据本发明的一个方面，研究发现PKM2在肝癌组织样本中乏氧坏死区(或微血管匮乏区)含量比肝癌组织非坏死区(或微血管丰富区)和正常肝组织样本中的含量显著高，显示PKM2高表达与肝脏肿瘤的乏氧休眠水平存在着密切的相关性。因此，本发明提出PKM2作为肝癌乏氧的特异分子标志物，并提供含有该肝癌分子标志物PKM2的诊断试剂盒，以及该分子标志物或诊断试剂盒在肝癌乏氧诊断、治疗及状况监测、预后监测中的应用。本发明提供的肝癌乏氧的特异分子标志物PKM2，是一种激酶蛋白，其编码基因的核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>2所示。本发明的另一目的在于基于上述基因和多肽序列，配合其它检测试剂或治疗药物，在制备用于精准诊断和靶向治疗乏氧表型的肝脏肿瘤药物中的应用。根据本发明的一个方面，本发明涉及前述的肝癌乏氧特异分子PKM2的基因或多肽序列作为标志物在制备肝癌乏氧高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，是通过检测被试者组织样本、血液、胆汁和尿液中的PKM2蛋白的含量，并与正常水平PKM2含量相比较，以进行肝癌乏氧高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。前述的肝癌乏氧分子标志物PKM2的基因或多肽序列作为标志物在制备肝癌乏氧高危人群筛选、诊断、药物设计、治疗及状况监测、预后监测的试剂盒中及药物中的应用，可把被试者血清、尿液、胆汁和组织样本中PKM2的含量通过总RNA提取、反转录、定量PCR进行检测。前述的诊断肝癌乏氧的诊断试剂盒包括：(1)组织样本、血液、胆汁和尿液中总RNA提取试剂；每20mg组织或200ul血液或400ul尿液100ul胆汁，使用：组分使用量(毫升)Trizol1氯仿0.2异丙醇0.575％乙醇1(2)反转录试剂；组分每个反应体系使用量(微升)5Xprimescriptbuffer2primescriptRTenzymemixI1OligodTprimer(50uM)0.5PKM2RTprimer0.5RNasefreedH2O补齐至10(3)定量PCR试剂；引物包括PKM2和GPDH对照，共2对引物；(4)正常健康人体肝脏组织cDNA(PKM2反转录引物反转录)作为阴性对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。前述的诊断肝癌乏氧的诊断试剂盒结果分析时检测样本和阴性对照间比较采用t检验，P＜0.05为差异显著，判为标本检测阳性。前述检测试剂盒所用对照为GPDH，其引物序列如下：GPDH上游引物序列：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′(SEQIDNO.3)GPDH下游引物序列：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′(SEQIDNO.4)。前述检测试剂盒所检测PKM2，其引物序列如下：PKM2上游引物序列：5′-ATGTCGAAGCCCCATAGTGAA-3′(SEQIDNO.5)PKM2下游引物序列：5′-TGGGTGGTGAATCAATGTCCA-3′(SEQIDNO.6)。本发明为肝癌乏氧的诊断和治疗提供了一种新的特异分子标志物PKM2。该分子标志物可作为标志物应用于制备诊断试剂盒中。使用该分子标志物及含有该分子标志物的诊断试剂盒诊断乏氧表型肝癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有较高的特异性、灵敏性和方便大量筛查的特点。该分子标志物适合应用于肝癌乏氧高危人群的筛选、肝癌乏氧水平的鉴定、肝癌乏氧靶向治疗及状况的监测、肝癌乏氧指导用药的监测和肝癌乏氧预后监测等诸多基础研究和临床实践领域。附图说明图1为PKM2在乏氧肝癌组织样本中和在普通肝癌组织及在正常肝组织样本中的含量检测。具体实施方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但下述实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围，下面实施例中未提及的具体实验方法，按照常规实验方法进行。实施例1：PKM2在肝癌组织样本中和正常组织样本中的含量检测本实施例主要步骤如下：1、组织样本中总RNA的提取获得肝癌患者放疗或术后的组织样本，同时获得淋巴结清扫术的患者切除的组织样本作为对照。提取前述组织样本的总RNA于无DNA和无RNA酶污染的1.5毫升离心管中。组织样本中提取总RNA的试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司。提取的总RNA通过使用ThermNanoDrop2000c分光光度计，测定260/280nm紫外波长的比值进行的浓度测定。2、定量检测组织样本中的PKM2(1)反转录RNA得到cDNA单链按照下表1配置反转录体系，配置过程在冰上进行。配置好的体系在PCR仪上进行反转录。反应条件为38摄氏度15分钟，85摄氏度5秒；表1表1中X表示加入的RNA体积由RNA浓度来确定，本实验中为X＝500ng/RNA浓度。前述反转录试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司；(2)QPCR定量检测按照下表2配置QPCR反应液，以cDNA稀释液为实时定量PCR模板，引物终浓度为400nM，反应总体积为50μl。实时定量PCR仪器可使用AppliedBiosystems公司的ABI实时定量PCR仪。经确认，使用其它仪器的时候，也不会得到完全相近的结果。本发明示例使用AppliedBiosystems公司的ABI系统。每个样本重复三到四次。在溶解曲线基本符合要求无非特异性扩增的情况下，参考操作手册，采用thresholdcycle(Ct)方法获得相对表达量，以GPDH为内参。具体程序参看表3；表2表3(3)数据分析用前述方法可测得样品中目标PKM2和参照的Ct值水平求得目标PKM2在组织中的相对含量。用GPDH为参照矫正PKM2的量，通过QPCR检测中经典的2-ΔCt的方法表示组织样本中PKM2的水平(-ΔCt为目标PKM2与对照的Ct值之差)。3、组织样本中PKM2水平诊断肝癌乏氧表型如图1，与正常对照组织样本中PKM2的低含量相比，放疗后肝癌患者组织样本中的PKM2含量相对较高，且普遍显著高于正常组织样本的平均值，放疗后肝癌患者样本平均值约为正常样本的平均值的近4倍，差异有统计学意义。实施例2：肝癌乏氧诊断试剂盒的应用本实施例主要步骤如下：1、组织样本、血液、胆汁和尿液中总RNA的提取按照每20mg组织或100ul胆汁或200ul血液或400ul尿液使用1mL的Trizol试剂的量处理组织样本、血液、胆汁、尿液，吹打均匀后转移到无RNA酶的1.5mlEp管中；向匀浆中加入1/5体积的氯仿，振荡离心管至溶液乳化成乳白状，无分相，12000rpm4℃离心15min；吸取上清至新管，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃2h沉淀；12000rpm4℃离心10min；弃上清，沿管壁轻轻加入1ml75％乙醇，轻洗EP管，12000rpm4℃离心2min；弃上清，短暂离心，用枪吸去剩余上清，置于通风橱内晾干；加入适量DEPC水，用枪吹打使沉淀溶解；定量：电泳检测抽提质量，紫外分光光度计检测OD260/OD280和样品浓度；得到组织样本、血液、胆汁、尿液中总RNA，放置-80℃保存。2、检测组织样本、血液、胆汁、尿液中的PKM2相对正常肝脏组织表达量变化使用试剂盒中试剂，按照实施例1中反应体系与条件，使用试剂盒中正常健康人体肝脏组织cDNA作为QPCR定量检测中的对照cDNA，检测肝癌患者癌组织样本、血液、胆汁、尿液中的PKM2相对正常人肝脏组织表达量变化，分析检测结果，样本和对照间比较采用t检验，P＜0.05为差异显著，判为检测样本阳性。本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页1 2 3