一种生物传感器及其制备方法和反应试剂与流程

本发明涉及生物检测仪器领域，具体涉及一种改进稳定性的生物传感器及其制备方法和反应试剂。

背景技术：

生物传感器(biosensor)，是一种利用生物活性物质选择性识别目标物质并将其浓度或含量转换为电信号进行检测的仪器。是由固定化的生物敏感材料作识别元件(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)、适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。

电化学生物传感器已经被广泛应用于体外诊断领域，这些仪器系统能检测体液中的生理物质，方便医生对病人状况分析和诊断，也有一些仪器系统应用到家庭使用，方便病人的自我监控，这些生理指标包括血糖、胆固醇、尿酸、甘油三酸酯、乳酸、酮体、酶类等。

目前生物传感器已经被广泛应用于临床检测中，而且有一些其中生物传感器产品已被广泛推广到家用的日常监测，成为普遍的日用消耗品，最普及的例子是便携式血糖测试系统。对于生物传感器的使用，尤其是家用，更是由于对储存环境条件和使用频率的限制，希望生物传感器产品有较宽松的存储环境要求以及较长的有效期。而对于储存环境条件和有效期的限制，其最主要的因素是反应试剂的稳定性。

反应试剂通常包括酶(也有一些无酶传感器)、电子传递介体、多聚物、缓冲液、表面活性剂、稳定剂等，其中影响稳定性的关键是酶和电子传递介体，通常需要添加稳定剂改善其稳定性。无论是酶还是电子传递介体，在较高的温度和湿度下，都会表现出不稳定，酶会渐渐丧失活性，电子传递介体可能会发生反应，造成测试结果的偏差，限制了产品的使用效期。目前生物传感器产品通常存放在带干燥剂的密封筒或袋中，保持环境的干燥性，以改善稳定性。但是存放容器的不是绝对密封的，而且容器取用重复开关，湿气也会逐渐进入，再加上热量也是比较难以隔绝，因此反应试剂的稳定性一直是业内的一个难题。

最常见的电子传递介体是铁氰化物，具有成本便宜和反应适配性好的特点，应用非常广泛。但是铁氰化物在较高的温度和湿度下，包括容器中的湿气、反应试剂中存留的水分、试剂中的亲水物质，会发生自我或交叉的氧化还原反应，产生和检测反应类似的中间产物，最终导致背景信号的增加，使检测反应信号假性升高，严重影响生物传感器的检测准确度。

公开(公告)号为US6911131B2、公开(公告)日为2005年06月28日的美国专利，披露了一种改进存储稳定性的生物传感器，其核心内容是在反应试剂中添加糖醇、金属盐、分子内含有至少一个羧基的有机酸或有机酸盐、或分子内含至少一个羧基和氨基的有机酸或有机酸盐中的任意一种或组合，并因此抑制随存储时间增加而增加的背景电流的升高。但是，发明人通过研究发现，该方法依然存在明显的背景电流随存储时间升高的现象。又如，公开(公告)号为US20130026050A1、公开(公告)日为2013年01月31日的美国专利，披露了改进铁氰化物性能的另一种方法，其核心内容是筛选出合适的铁氰化物的阳离子盐，该专利披露的阳离子是四甲基铵，并因此抑制因铁氰化物随存储时间增加而增加的背景电流的升高。但是四甲基铵有毒、加热易分解，加工过程不实用，而且发明人通过研究发现，该方法也依然存在明显的背景电流随存储时间升高的现象。

技术实现要素：

为克服上述现有技术存在的问题和缺陷，本发明的目的旨在提供一种具有良好存储稳定性的生物传感器，保证其在效期内的测试准确度。

为实现本发明的目的，发明人提供如下的技术方案：

发明人首先提供了一种生物传感器，其组成包括绝缘基板，附着在绝缘基板上的电极系统，所述的电极系统至少包括一条工作电极和一条对电极，覆盖在电极系统上面的反应试剂层，所述的反应试剂层应至少覆盖一个工作电极，以及位于电极系统和反应试剂层上面的反应室，所述的反应室由中隔层和覆盖层组成，且反应室具有透气孔，其中：所述的反应试剂层采用的反应试剂中含有咪唑或咪唑类衍生物中的一种或多种。

本发明主要针对的是提高电子传递介体的稳定性，本发明的核心内容是反应试剂的构成。研究发现，咪唑或咪唑类衍生物能有效抑制电子传递介体潜在的氧化还原反应，从而显著改善生物传感器随存储时间增加而增加的背景电流升高的问题，从而提升生物传感器的储存稳定性，保证其在有效期内的测试准确度。反应试剂的组成包括电子传递介体和稳定剂，所述电子传递介体为铁氰化物，咪唑或咪唑类衍生物可作为稳定剂添加物加入；咪唑或咪唑类衍生物也可作为缓冲液加入。优选的是作为缓冲液加入。作为通用技术，反应试剂根据检测目标的不同，可以包括特定的反应酶；反应试剂根据需要，可以加入合适的表面活性剂、多聚物、缓冲液等其他组分，此处不再一一赘述。

本发明中，所述的绝缘基板的材质包括但不限于PET、PP、PVC、亚克力中的一种。

所述的电极系统，构建在绝缘基板上，电极系统至少包括工作电极和对电极；每个电极都有延伸导线延伸到基板的另外一端，形成连接触脚；延伸导线、连接触脚和反应电极材料可以相同，也可以不同。生物传感器测试片插入仪器后，测试片通过连接触脚和仪器连接器的连接实现两者的信号通讯。电极的材料包括但不限于石墨、银、金、铂、钯、ITO和IZO中的一种。

所述的反应试剂固定在电极系统上，至少覆盖工作电极。

所述的中隔层构建在电极系统上方，反应室区域镂空，结合覆盖层形成了反应室即进样通道，中隔层材料可以是带基材或不带基材的胶带，加工好后粘合上去；也可以是胶或聚合物浆料，通过丝网印刷上去；如电极上无其他绝缘材料隔开，中隔的材料必须是良好的绝缘材料。

所述的覆盖层在中隔层上方，和中隔层、基板构建成反应室即进样通道，以便通过虹吸作用自动进样。覆盖层可使用PET材料，优选透明的亲水处理过的材料，透明能帮助用户容易确认反应区进样状态，亲水能使进样更为顺畅，非反应室区域可以不透明，印刷进样标志和Logo，可用的材料如3M公司的9971亲水膜。

所述的反应室应有透气孔，以便形成虹吸作用，透气孔可以构建在绝缘基板或中隔层或覆盖层上。

作为优选，本发明中，所述的咪唑或咪唑类衍生物在反应试剂中的添加量为1mM～2M。更优选的是20mM～200mM。

作为优选，本发明中，所述的咪唑类衍生物包括并不限于下列：1-甲基咪唑、1-乙基咪唑、1-丙基咪唑、2,4-二甲基咪唑、2-甲基咪唑、2-乙基咪唑、4-甲基咪唑、1,2-二甲基咪唑、2-乙基-4-甲基咪唑和1-羟乙基-2-甲基咪唑等。

作为优选，本发明中，所述的反应试剂包括并不限于下述种类：葡萄糖反应试剂、胆固醇反应试剂、尿酸反应试剂、酮体反应试剂、乳酸反应试剂和血红蛋白反应试剂等。

作为优选，本发明中，所述的中隔层的厚度为0.025mm～0.5mm。作为更优选，中隔层的厚度为0.075mm～0.125mm。

本发明还提供了上述的一种生物传感器的制备方法，包括：

(1)在绝缘基板上形成电极系统，所述的电极系统至少包括一条工作电极和一条对电极，加工方法有：通过丝网印刷把特定的电极图案印刷到绝缘基板上，然后通过加热或红外或紫外干燥；或者电极材料通过溅射的方式附着在绝缘基板上，然后通过激光刻蚀的方式加工出特定的电极图案，

(2)反应试剂层通过点液、丝网印刷、喷墨打印或夹缝挤出方法加工固定到电极上，

(3)在电极系统和反应试剂层上贴合反应室的中隔层和覆盖层，制作完成，其中：以带基材或不带基材的胶带为中隔层材料，加工好后粘合在电极系统和反应试剂层上；或者以胶或聚合物浆料为中隔层材料，通过丝网印刷在电极系统和反应试剂层上。

本发明还提了一种生物传感器的反应试剂，所述反应试剂中含有咪唑或咪唑类衍生物中的一种或多种。

本发明的核心内容是反应试剂的构成，主要针对的是提高电子传递介体的稳定性。研究发现，咪唑或咪唑类衍生物能有效抑制电子传递介体潜在的氧化还原反应，从而显著改善生物传感器随存储时间增加而增加的背景电流升高的问题，从而提升生物传感器的储存稳定性，保证其在有效期内的测试准确度。

反应试剂的组成通常包括酶(也有一些无酶传感器)、电子传递介体、多聚物、缓冲液、表面活性剂和稳定剂等。酶的作用是特异性的和被检测物反应；电子传递介体从酶和被检测物的反应中获取电子，并扩散到电极上释放电子，并形成信号，该信号可以被测试仪捕获；缓冲液保证一个合适的反应环境；表面活性剂能够优化反应条件，并促进样本扩散；多聚物能形成网架结构，并一定程度上固定酶。

根据检测项目的不同，可以选择不同的酶，如检测血糖可以选用葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶；检测乳酸，可以选择乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶；检测尿酸，可以选择尿酸氧化酶，也可以选择不用酶的无酶尿酸传感器；检测β-羟丁酸，可以使用β-羟丁酸脱氢酶等等；另有些需要两种或多种酶的参数，如检测胆固醇，需要胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶的组合；一些氧化酶和过氧化物酶的组合进行检测等。

代表性的电子传递介体有二茂铁衍生物，如二茂铁甲酸；铁氰化物，如铁氰化钾；钌络合物，如六氨三氯化钌；普鲁士蓝；甲基蓝；麦尔多兰；甲基吩嗪硫酸甲酯盐类化合物；2,6-二氯靛酚；醌类化合物；钴、镍络合物；四硝唑类化合物；萘酚氯；4-氨基安替比林等等。铁氰化物因其成本便宜，水溶性和反应适配性好，应用非常广泛，本发明主要针对该电子传递介体的生物传感器作出研究。

多聚物包括粘合剂和填充剂等。粘合剂可以是黄原胶、明胶、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素等；填充剂可以是纤维素类，如微晶纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、磷灰石、气化二氧化硅、高岭土、蒙脱石、壳聚糖、环糊精、海藻酸钠、糖苷、PMMA、琼脂、明胶、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、PEO、PVA、PVP/VA等等。

可供选择的表面活性剂有：聚乙二醇辛基苯基醚类，如Triton X-100；聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，如Tween 20；胆酸衍生物类，如3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐、脱氧胆酸钠；十二烷基聚乙二醇醚，如Brij 35；季铵盐类，如十六烷基三甲基溴化铵；糖苷类，如十二烷基-β-D-麦芽糖苷；聚-(氧代-1，2-乙二亚甲基)-α-壬基苯基-ω-羟基类，如TERGITOL(TM)NP-40，等。

可供选择的缓冲液也很多，由于酶的活性和稳定区间限制，选择的缓冲液的pH值范围通常在3～11之间。典型的缓冲液有：醋酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、TES、BES、HEPES、PIPES、MOPS、Bicine、Tris、CHES、MES、ADA、CAPS、EPPS、POPSO、CAPS等。

上述的反应试剂的各个组分可根据检测物质的需要进行组合，电子传递介体优先选用成本便宜、水溶性好、反应适配性好的铁氰化物。本发明的核心是反应试剂中包括稳定剂，所述稳定剂为咪唑或咪唑类衍生物的一种或几种组合；咪唑或咪唑类衍生物也可作为缓冲液加入反应试剂。优选作为缓冲液添加，这是因为通常试剂中需要包含缓冲液控制pH值以便达到最适反应环境，但是如加入其他缓冲液，其缓冲液组分可能会导致电子介体不稳定；而咪唑或咪唑类衍生物作为缓冲液添加，同时发挥缓冲液和稳定剂的作用，即能减少加入其他缓冲液造成的稳定性风险，同时也可以节省加入其他缓冲液的成本。本发明的一个实施例也验证了这个观点。

作为优选，本发明的反应试剂中，所述的咪唑或咪唑类衍生物在反应试剂中的使用浓度区间为1mM～2M。更优选的是20mM～200mM。

作为优选，本发明的反应试剂中，所述的咪唑类衍生物包括并不限于下列：1-甲基咪唑、1-乙基咪唑、1-丙基咪唑、2,4-二甲基咪唑、2-甲基咪唑、2-乙基咪唑、4-甲基咪唑、1,2-二甲基咪唑、2-乙基-4-甲基咪唑和1-羟乙基-2-甲基咪唑等。

作为优选，所述的反应试剂种类包括并不限于：葡萄糖反应试剂、胆固醇反应试剂、尿酸反应试剂、酮体反应试剂、乳酸反应试剂和血红蛋白反应试剂等。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明在反应试剂中引入咪唑或咪唑类衍生物作为稳定剂加入或缓冲液加入。咪唑或咪唑类衍生物能有效抑制电子传递介体潜在的氧化还原反应，从而显著改善生物传感器随存储时间增加而增加的背景电流升高的问题，从而提升生物传感器的储存稳定性，保证其在有效期内的测试准确度。

实验测试结果表明，本发明的反应试剂对照没有添加咪唑或咪唑类衍生物的反应试剂在65℃下的2周加速老化后背景电流(0mg/dL)相比室温背景电流升高幅度明显要少，说明本发明在提高生物传感器的稳定性方面有实效。

附图说明

图1A和图1B是本发明一种生物传感器的结构分解示意图和结构完整示意图。

图2A-2D为本发明反应试剂A～D的血糖测试片加速老化测试在样本浓度为0mg/dL下的背景电流曲线图。

图3是本发明反应试剂A～D的血糖测试片加速老化和室温对照5秒背景电流的柱形比对图。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

如图1A和图1B所示，一种生物传感器，其组成包括绝缘基板，绝缘基板的材质为PET，附着在绝缘基板上的电极系统，所述的电极系统包括一条工作电极和一条对电极，电极材料是石墨，每个电极都有延伸导线延伸到基板的另外一端，形成连接触脚(使用时，生物传感器产品即测试片插入仪器后，测试片通过连接触脚和仪器连接器的连接实现两者的信号通讯)，覆盖在电极系统上面的反应试剂层，所述的反应试剂层覆盖工作电极，以及位于电极系统和反应试剂层上面的反应室，所述的反应室由中隔层和覆盖层组成，中隔层的厚度为0.125mm，覆盖层采用3M公司的9971亲水膜，且反应室具有透气孔，以便形成虹吸作用，其中：所述的反应试剂层采用反应试剂B(咪唑缓冲液)，反应试剂B如下制备：

取咪唑0.6808g，溶于80g水，用1M盐酸调节pH值到6.2。加入以下物质，依次溶解：

明胶(Sigma G7041)：0.0500g，

羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)：1.0000g，

聚乙二醇(Sigma 95904)：0.5000g，

Triton X-100：0.2000g，

铁氰化钾：3.2900g，

葡萄糖氧化酶(Amano，GO-AM)：600KU，

等全部加完且完全溶解后，加纯化水定容到100mL，备用。

生物传感器制备方法如下：

(1)通过丝网印刷把特定的电极图案印刷到绝缘基板上，然后加热干燥，电极系统附着到绝缘基板上，

(2)反应试剂B通过点液方式分配到丝网印刷制作的石墨电极上，然后于温度55℃下烘干15分钟，反应试剂层固定加工到电极上，

(3)在电极系统和反应试剂层上贴合反应室的中隔层和覆盖层，制作完成，得到一种血糖测试片，其中：以带基材的胶带为中隔层材料，加工好后粘合在电极系统和反应试剂层上。

实施例2

本实施例结构和加工过程同实施例1，但反应试剂不同，所述的反应试剂层采用反应试剂C(对照+咪唑)，反应试剂C如下制备：

在80g纯化水中加入无水磷酸氢二钠0.2626g、无水磷酸二氢钠0.9778g；完全溶解后加入咪唑0.6808g，溶解后用用1M盐酸调节pH值到6.2。并加入以下物质，依次溶解：

明胶(Sigma G7041)：0.0500g，

羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)：1.0000g，

聚乙二醇(Sigma 95904)：0.5000g，

Triton X-100：0.2000g，

铁氰化钾：3.2900g，

葡萄糖氧化酶(Amano，GO-AM)：600KU，

等全部加完且完全溶解后，加纯化水定容到100mL，备用。

然后按照实施例1制备方法制作成生物传感器，得到一种血糖测试片。

实施例3

本实施例结构和加工过程同实施例1，但反应试剂不同，所述的反应试剂层采用反应试剂D(对照+1-甲基咪唑)，反应试剂D如下制备：

在80g纯化水中加入无水磷酸氢二钠0.2626g、无水磷酸二氢钠0.9778g；完全溶解后加入1-甲基咪唑0.8210g，溶解后用用1M盐酸调节pH值到6.2。并加入以下物质，依次溶解：

明胶(Sigma G7041)：0.0500g，

羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)：1.0000g，

聚乙二醇(Sigma 95904)：0.5000g，

Triton X-100：0.2000g，

铁氰化钾：3.2900g，

葡萄糖氧化酶(Amano，GO-AM)：600KU，

等全部加完且完全溶解后，加纯化水定容到100mL，备用。

然后按照实施例1制备方法制作成生物传感器，得到一种血糖测试片。

比较例

本比较例结构和加工过程同实施例1，但反应试剂不同，所述的反应试剂层采用反应试剂A(对照)，反应试剂A如下制备：

纯化水：80g，

无水磷酸氢二钠：0.2626g，

无水磷酸二氢钠：0.9778g，

明胶(Sigma G7041)：0.0500g，

羧甲基纤维素钠(Sigma C5678)：1.0000g，

聚乙二醇(Sigma 95904)：0.5000g，

Triton X-100：0.2000g，

铁氰化钾：3.2900g，

葡萄糖氧化酶(Amano，GO-AM)：600KU，

加入以上物质，依次溶解，等全部加完且完全溶解后，加纯化水定容到100mL，备用。

然后按照实施例1制备方法制作成生物传感器，得到一种血糖测试片。

实验例

将实施例1-3和比较例制作而成的四种血糖测试片做检测。每种血糖测试片分成两部分，一部分存储于带干燥剂的密封试剂筒中放置在室温作为测试对照；另一部分存储于带干燥剂的密封试剂筒中放置于65℃烘箱中加速老化，65℃烘箱中加速老化后的测试片相当于室温存储很长时间。两周后，65℃烘箱中加速老化的测试片取出，和放置在室温的测试片一起测试，共测试3个浓度：0mg/dL,100mg/dL,450mg/dL。比较例和实施例的测试结果见图2A、图2B、图2C、图2D和图3及如下表格：

比较例的结果：

实施例1的结果：

实施例2的结果：

实施例3的结果：

上述表格的表明，从加速老化测试数据可见，三种添加咪唑或咪唑衍生物的实施例反应试剂B、C、D相比于比较例反应试剂A，在温度65℃下2周加速老化后背景电流(0mg/dL)相比室温背景电流升高幅度明显要少，这点在100mg/dL,450mg/dL浓度上也明显的体现出来，其中以实施例1反应试剂B表现最好。

可见，反应试剂中加入咪唑或咪唑衍生物能有效抑制电子传递介体潜在的氧化还原反应，从而显著改善生物传感器随存储时间增加而增加的背景电流升高的问题，从而提升生物传感器的储存稳定性，保证其在有效期内的测试准确度。其中，作为优选，咪唑或咪唑的衍生物可作为缓冲液添加。

图2A～2D为反应试剂A～D的测试片加速老化测试在样本浓度为0mg/dL下的背景电流曲线图，三角形数据点的曲线为温度65℃下2周加速老化后的曲线，正方形数据点为存储在室温作为对照的曲线。可见三种添加咪唑或咪唑衍生物的实施例反应试剂B，C，D相比对照例反应试剂A，65℃2周加速老化后的曲线比室温对照曲线升高明显要少，其中B表现最好。

图3为反应试剂A～D的血糖测试片加速老化和室温对照5秒背景电流的柱形比对图。由图可见，三种添加咪唑或咪唑衍生物的实施例反应试剂B，C，D相比对照例反应试剂A，65℃2周加速老化后比室温对照5秒背景电流的升高明显要少，其中B升高最少。

实施例4-12

其他同实施例1，不同之处在于将咪唑替换为下列物质中的一种：

1-乙基咪唑(反应试剂中的浓度为1mM)、1-丙基咪唑(反应试剂中的浓度为5mM)、2,4-二甲基咪唑(反应试剂中的浓度为20mM)、2-甲基咪唑(反应试剂中的浓度为100mM)、2-乙基咪唑(反应试剂中的浓度为200mM)、4-甲基咪唑(反应试剂中的浓度为50mM)、1,2-二甲基咪唑(反应试剂中的浓度为1M)、2-乙基-4-甲基咪唑和1-羟乙基-2-甲基咪唑(反应试剂中的浓度为2M)。

经试验，至少可以达到与实施例1一样的技术效果，不再赘述。尤为明显的是，实施例6-9，也就是咪唑类衍生物在反应试剂中的使用浓度区间为20mM～200mM时，咪唑类衍生物有效抑制电子传递介体潜在的氧化还原反应的效果更好，更好的解决了生物传感器随存储时间增加而增加的背景电流升高的问题，从而使生物传感器的储存稳定性更佳，保证了生物传感器在有效期内的测试准确度。