本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于研究RNA与蛋白相互作用的RNA pulldown方法及试剂盒。
背景技术：
RNA结合蛋白(RBPs)在转录后水平调节基因的表达起着重要的作用，具体的作用包括mRNA前体的剪接、多腺苷化和稳定性的维持，mRNA从细胞核向细胞质的运输，mRNA的定位和翻译等。RBPs在这些过程中的调节作用是通过结合新合成的或者成熟后的转录物的特定序列实现的。于此同时，有很多RBPs能够识别RNA中的特定核苷酸序列。为了研究RNA与蛋白的相互作用建立了很多方法，这些方法包括EMSA、SELEX技术、RNA footprinting、RNA免疫沉淀(RIP)和RNA pulldown技术。
RNA pulldown技术利用脱末端标记的RNA高效富集及鉴定RNA结合蛋白(RBPs)。此方法避免了抗体的使用，大大延伸了使用范围。随着RNA pulldown技术的不断完善，其在生命科学研究及医学领域中扮演的角色愈加重要。
Hirofumi等通过RNA pulldown技术从线虫的极少量的感觉神经元中分离出mRNA，随后通过芯片分析鉴定出了感觉神经元的基因表达谱。(KUNITOMO H,UESUGI H,KOHARA Y,et al.2005.Identification of ciliated sensory neuron-expressed genes in Caenorhabditis elegans using targeted pull-down of poly(A)tails.Genome Biol[J],6:R17.)
现如今的研究中，RNA pulldown研究的探针主要是合成生物素标记的单链探针，拓展了RNA的研究范围。Tsai等通过改进的RNA pulldown技术分析了长链非编码RNA(lincRNA)调节染色体状态和表观遗传。他们发现lincRNA HOTAIR作为至少两个组蛋白修饰复合体的脚手架。HOTAIR的5’端结合多梳抑制复合体2(PRC2)，3’端结合LSD1/CoREST/REST复合体，完成RNA介 导的RPC2和LSD1复合体的组装从而完成H3K27和H3K4两个位点的甲基化。(TSAI M C,MANOR O,WAN Y,et al.2010.Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.Science[J],329:689-693.)
上述RNA pulldown方法具有较明显的缺点：(1)实验中使用到的珠子(琼脂糖珠子或磁珠)与蛋白的非特异结合，容易造成实验结果的假阳性；(2)RNA探针与蛋白结合的特异性不高；(3)实验过程还会受到核酸酶污染的影响。
技术实现要素：
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种RNA pulldown方法及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种RNA pulldown方法，包含以下步骤：
S1、磁珠预处理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；
S2、制备探针-磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的RNA探针结合；
S3、提取并预处理细胞全蛋白：向提取的细胞全蛋白中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，收集上清；
S4、pulldown：将步骤S3收集的上清加入到步骤S2制备的探针-磁珠复合物中，加入含脱氧核糖核酸酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制剂的NT2buffer洗涤磁珠，得到蛋白-探针-磁珠复合物；
S5、RNP(蛋白-探针复合物)的收集：将步骤S4制得的蛋白-探针-磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育，收集上清即得RNP。
优选地，所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液。
优选地，所述TES中BSA的浓度为0.05-0.5wt％，寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L。
优选地，所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。
优选地，所述步骤S2制备探针-磁珠复合物的方法为：将含2-5μg生物素标记RNA探针的溶液在90℃放置2min，立即置于冰上2min，加入50μL RNA structure buffer和20μL DEPC水，室温放置20min制备得到二级结构的RNA探针；将其加入预处理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃温和旋转混合30-60min，去上清；用1×TES洗涤磁珠两次，去除TES。
优选地，所述步骤S3中预处理细胞全蛋白的方法为：向1.5×107个细胞提取获得的细胞全蛋白提取物中加入10μL DNase和3.2μL DNase Buffer，室温温和孵育1h；再加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30min；收集上清液为预处理的细胞全蛋白。
优选地，所述步骤S3提取细胞全蛋白的方法为：用PBS洗涤1.5×107个细胞一次；加入975μL RIP Buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL DTT溶液，匀浆器匀浆15-20次；4℃、1500g离心15min，收集上清即为细胞全蛋白提取物。
优选地，所述步骤S4pulldown的具体方法为：将步骤S3制备的细胞全蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入5μL RNase inhibitor、15μg poly(dI·dC)、5μL0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)溶液和2.5μL 0.5M EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)溶液；室温温和旋转孵育2h，收集磁珠；加入974μL NT2buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail、5μL DTT溶液和1μL RNase inhibitor，洗涤磁珠，再重复洗涤四次。本发明中选用EDTA作为脱氧核糖核酸酶的抑制剂。
优选地，所述步骤S5中RNP的收集方法为：向蛋白-探针-磁珠复合物中加入40μL Urea CHAPS buffer，4℃孵育5-10h，收集上清即为探针-蛋白复合物。
优选地，所述DTT溶液的浓度为100mM，所述PMSF溶液的浓度为10mg/mL。
一种RNA pulldown试剂盒，包含下述试剂：
磁珠及其处理试剂：2×TES溶液，链霉亲和素标记的磁珠，寡核苷酸随机引物；所述寡核苷酸随机引物的浓度为10-20μmol/L；
RNA处理试剂：DNase，DNase Buffer，RNase inhibitor；
蛋白提取及处理试剂：RIP buffer，Urea CHAPS buffer，protease inhibitor cocktail、DTT溶液、PMSF溶液；所述DTT溶液的浓度为100mM，所述PMSF 溶液的浓度为10mg/mL；
探针及结合处理试剂：RNA structure buffer，NT2buffer，poly(dI·dC)。
本发明针对目标区域设计特异性RNA探针，探针经过脱硫生物素标记；链霉亲和素偶联在磁珠上，并和脱硫生物素亲和结合；细胞全蛋白与磁珠-探针复合物孵育，作用蛋白分子可以和RNA探针特异性结合；经过洗涤可以将非特异性结合蛋白分子去除；最后，在洗脱液(针对链霉亲和素)进行洗脱，得到目的探针-蛋白复合物，再经过Western Blot或质谱鉴定蛋白质类型。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
①本发明通过预先使用BSA封闭磁珠，降低了磁珠与蛋白的非特异性结合；本发明通过预先使用寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠与基因组RNA的非特异性结合。BSA和寡核苷酸随机引物的大小正合适，既能封闭磁珠增强实验的特异性，又不会过大而影响探针与蛋白的结合。
②本发明采用脱氧核糖核酸酶预处理蛋白样品，采用未预处理的磁珠对蛋白样品进行预洗涤，除去蛋白样品内的体内DNA，防止其缠绕磁珠从而影响耦连在磁珠上的RNA探针与蛋白质的结合，再采用脱氧核糖核酸酶抑制剂灭活脱氧核糖核酸酶。本发明通过系统性核酸酶防护，防止核酸酶的污染，增加了实验的稳定性和可靠性，重复性好，简化了实验流程。
③本发明中磁珠首先与探针孵育，去除多余探针后再与蛋白孵育，较传统探针先与蛋白孵育再与磁珠孵育或探针、蛋白和珠子同时孵育极大的节约了磁珠的使用量，节约实验成本。本发明采用磁珠取代了琼脂糖珠，省掉离心的步骤，节约试验时间。同时，采用磁珠法洗涤取代了琼脂糖珠离心的步骤，可以使上清液去除的更加彻底，提高反应的特异性。
附图说明
图1为不同方法pulldown效果图。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本 发明中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
实施例1
以lincRNA HOTAIR探针对LSD1蛋白的pulldown效果为例来说明本发明，，探针经过脱硫生物素8-oxoG标记。探针的设计和标记方法是本领域技术人员所熟知的，在此不再赘述。链霉亲和素偶联在磁珠(BeaverBeadsTMStreptavidin，海狸生物科技有限公司)上，并和脱硫生物素亲和结合；细胞全蛋白与磁珠-RNA探针孵育，作用蛋白分子可以和探针特异性结合；经过洗涤可以将非特异性结合蛋白分子去除；最后，再用洗脱液(针对链霉亲和素)进行洗脱，得到目的探针-蛋白复合物，再经过Western Blot鉴定蛋白质类型。具体步骤如下：
S1、磁珠预处理
①取80μL含链霉亲和素的磁珠置于无RNase EP管中，加入1mL 1×TES洗涤磁珠；
②置于磁力架上去除TES洗涤液，向磁珠加入1mL含0.5％BSA和10μmol/L寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后置于磁力架上去除TES溶液。所述寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列。
S2、制备探针-磁珠复合物
①将2-5μg大小300-1000bp的DNA探针用30μL DEPC水溶解，在90℃放置2min，立即置于冰上2min，加入50μLRNA structure buffer和20μL DEPC水，室温放置20min制备得到二级结构的RNA探针；
②将二级结构的RNA探针加入预处理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃旋转温和混合30min，置于磁力架上去上清；
③加入0.35mL 1×TES，25℃温和旋转洗涤磁珠5min，置于磁力架上去除洗涤液；
④重复步骤③一次。
S3、提取并预处理细胞全蛋白
S31、提取细胞全蛋白
①用PBS洗涤1.5×107个Hela细胞一次；
加入975μL RIP Buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL DTT溶液，匀浆器匀浆15-20次；4℃、1500g离心15min，收集上清即为细胞全蛋白提取物；所述DTT溶液的浓度为100mM，所述PMSF溶液的浓度为10mg/mL；。
S32、预处理细胞全蛋白
①向上述制备的细胞全蛋白提取物中加入10μL DNase、3.2μL DNase Buffer，室温25℃温和孵育1h；
②向蛋白样品中加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30min；
③磁力架上收集磁珠，将上清液预处理的细胞全蛋白转移到新的EP管中。
S4、pulldown
①将制备的细胞全蛋白加入到探针-磁珠复合物中，并加入472.5μL NT2buffer、5μL RNase inhibitor、15μg poly(dI·dC)、5μL 0.5M EDTA和2.5μL 0.5M EGTA；
②室温温和旋转孵育2h；
③磁力架上收集磁珠，去除上清液；
④加入974μL NT2buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail、5μL DTT溶液和1μL RNase inhibitor，洗涤磁珠，去除非特异性结合的蛋白，再重复洗涤四次，得到蛋白-探针-磁珠复合物；所述DTT溶液的浓度为100mM，所述PMSF溶液的浓度为10mg/mL；。
S5、RNP收集
①向蛋白-探针-磁珠复合物中加入40μL Urea CHAPS buffer，4℃孵育5-10h。
②磁力架上收集磁珠，上清即为探针-蛋白复合物，将上清RNP转移到新的EP管中。
③产物置于-80℃保存，供进一步Western Blot分析。
为了更好的说明本发明的效果，发明人还进行了两组对比实验。
对比例1使用PierceTMMagnetic RNA-Protein Pull-Down Kit方法，具体参见该试剂盒说明书。
对比例2使用Tsai等人报道的方法(TSAI M C,MANOR O,WAN Y,et al. 2010.Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.Science[J],329:689-693.)，具体步骤为：
(1)通过T7RNA聚合酶(Promega)利用生物素标记的RNA混合物(Roche)体外转录获得生物素标记的RNAs，通过不含RNase的DNase I(Promega)，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)对RNA产物进行分离纯化。取3μg生物素化RNA，90℃加热2min，放在冰上2min，换成RNA结构缓冲液(10mM Tris pH 7,0.1M KCl,10mM MgCl2)，然后置于室温20min使其形成正确的二级结构。
(2)107个HeLa细胞通过2mL PBS重悬，加入2mL细胞核分离缓冲液(1.28M sucrose；40mM Tris-HCl pH 7.5；20mM MgCl2；4％Triton X-100)和6mL的水置于冰上20min，期间经常混匀。细胞核可以通过2,500g离心15min获得。细胞核沉淀重悬在1mLRIP缓冲液(150mM KCl,25mM Tris pH 7.4,0.5mM DTT,0.5％NP40,1mM PMSF and protease Inhibitor(Roche Complete Protease InhibitorCocktail Tablets)中。重悬的细胞核通过组织匀浆器进行15-20次机械匀浆，核膜和碎片通过13,000转，离心10min进行分离。
(3)将折叠的RNA和1mg Hela细胞核提取物在RIP中混匀，在室温中孵育1h，取洗过的生物素化的琼脂糖珠子(Invitrogen)加入每个结合反应的体系中，在室温中进一步孵育1h。珠子在Handee spin柱子中洗5次，加入SDS缓冲液煮沸和Western Blot检测。
使用本发明实施例和对比例的方法分别验证lincRNA HOTAIR探针对LSD1蛋白的pulldown效果。泳道1为10％input组；泳道2为LacZ组，使用LacZ RNA探针作为阴性对照；泳道3为pulldown组，使用实验组RNA探针。图1A为本发明方法pulldown效果图；图1B为按照对比例1所述方法pulldown效果图；图1C为按照对比例2所述方法pulldown效果图。可见本发明相对于对比例1方法具有更高的蛋白富集效率，相对于对比例2所述的方法的Western Blot的条带拖尾现象更少，条带更亮，说明本试剂盒蛋白富集效率更高，灵敏度高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。