呼吸道腺病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法与流程

本发明属于医学检验领域，具体地公开了一种呼吸道腺病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法。

背景技术：

腺病毒(adenovirus)颗粒直径60～90nm，没有囊膜，20面体立体对称，衣壳由252个克微粒组成，其中240个壳微粒是六邻体(Hexon)，具有组特异性α抗原。腺病毒有6个种属52种不同血清型，其中约有1/3能引起如急性呼吸道感染、流行性角膜炎、急性出血性结膜炎、咽结膜炎、急性咽炎、膀胱炎、婴幼儿致死性肺炎等疾病。在我国，5岁以下儿童急性呼吸道疾病中约有5％是由腺病毒引起的，其中腺病毒引起的肺炎易导致严重的病症，腺病毒肺炎不仅可以引起心力衰竭、呼吸衰竭，还可以引起肺外受累，如脑炎、肝损害、心肌炎或心肌损害等，甚至导致死亡。腺病毒流行范围广，传播速度快，近年来在多个国家和地区爆发和流行，给人们的公共卫生安全带来了极大的威胁。在我国，3型和7型腺病毒是引起严重呼吸道感染的主要的两种腺病毒。目前尚无有效的疫苗进行预防，只能通过临床早期诊断，对症治疗降低呼吸道腺病毒的危害。

呼吸道腺病毒的早期诊断方法较多，主要有组织细胞培养技术、血清学、分子生物学三个领域技术。传统方法比较常用的包括细胞分离培养、血清IgM抗体ELISA检测、血清IgM抗体免疫荧光检测、PCR核酸检测。细胞分离培养是呼吸道腺病毒感染确定的金标准方法，但是由于时间长(超过5天)、实验条件要求高、操作人员技术要求高等缺点限制了其在临床诊断应用，目前该技术主要用在科研领域。血清学IgM抗体ELISA检测是临床应用较广的方法，通过检测血清中呼吸道腺病毒IgM抗体了解患者近期感染病毒的情况，对临床诊治有一定的帮助。但是很多呼吸道腺病毒患者是小于5岁的儿童，由于较多幼童的血管较细，而且对抽血有恐惧感，因此给临床医护人员操作带来一定的难度，给患者和家长带来心理压力和痛苦感受。血清IgM抗体免疫荧光检测应用也是通过检测血清中呼吸道腺病毒IgM抗体了解患者近期感染病毒的情况，该技术需要专业的人员和专门的荧光显微镜，这限制了其在临床的推广能力。PCR核酸检测是呼吸道腺病毒早期检测方法中灵敏度最高的方法，通过检测患者鼻咽喉部细胞中的呼吸道腺病毒判断感染情况。该技术需要专业的技术人员和专门荧光PCR扩增仪，基层医疗部门比较难开展该诊断方法。另外该技术需要采集患者咽喉部细胞，较容易引起患者不适造成反呕或者呕吐发生。

当呼吸道腺病毒通过呼吸道系统侵入人体，人体免疫系统开始启动第一道防线，是通过粘膜免疫进行防疫阻止呼吸道腺病毒在人体细胞定植。粘膜免疫主要是通过唾液产生病毒特异性的IgA抗体抵抗病毒侵染，因此病毒IgA抗体产生可以预示病毒感染情况发生。本发明是检测患者唾液中呼吸道腺病毒IgA抗体，是一种无创的检测技术，容易被患儿接受。而且采用的是快速层析法，检测时间小于30分钟，可以方便基层医疗部门和现场检测，提高医护人员的工作效率，尽早对症治疗，缩短患者康复进程。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的问题，本发明提供一种呼吸道腺病毒IgA抗体检测试纸条及其检测方法。

本发明首先提供了一种呼吸道腺病毒IgA抗体检测试纸条，包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、背板，所述的纤维素膜包括喷涂有呼吸道腺病毒六邻体蛋白抗原多肽片段的检测线和人IgA抗体的对照线。

进一步地，所述呼吸道腺病毒六邻体蛋白抗原多肽片段的氨基酸序列如序列表Seq ID NO.1所述。

进一步地，所述样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸均粘附在背板上。

进一步地，所述的标记垫含有抗人IgA抗体标记上胶体金，所述抗人IgA抗体包括羊抗人IgA多克隆抗体、鼠抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA单克隆抗体、兔抗人IgA多克隆抗体。

进一步地，所述试纸条检测人唾液标本。

进一步地，所述唾液标本通过将无菌脱脂棉放置于待测对象舌下，吸附唾液后再用注射器挤压出的方法获得。

本发明还提供了所述试纸条的检测呼吸道腺病毒IgA抗体的方法：采集待测对象唾液标本，并利用该唾液标本与所述试纸条接触进行检测。

进一步地，所述唾液标本的采集方法为：将无菌脱脂棉放置于待测对象舌下，吸附唾液后再用注射器挤压出唾液标本。

进一步地，所述无菌脱脂棉用棉线捆绑。

本发明的有益效果为：

本发明通过无菌脱脂棉采集唾液标本，再将唾液标本用注射器挤出，通过呼吸道腺病毒IgA抗体快速层析纸条检测唾液中的IgA抗体，实现快速诊断患者感染呼吸道腺病毒的目的。本方法操作简单，结果快速，适合各级医疗机构快速诊断呼吸道腺病毒感染。采集标本无侵 入性，避免传统的采血和采集鼻咽拭子给病人带来不适，也提高医护人员的工作效率，提高呼吸道腺病毒诊断在临床上推广率。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明检测唾液中呼吸道腺病毒IgA抗体的试纸条结构示意图。

图2为注射器挤压唾液示意图。

图3为胶体金纸条测试示意图。

图4为本发明试纸条检测呼吸道腺病毒IgA抗体的阳性示意图。

图5为本发明试纸条检测呼吸道腺病毒IgA抗体的阴性示意图。

图6为本发明试纸条检测呼吸道腺病毒IgA抗体的无效示意图。

具体实施方式

【实施例1】呼吸道腺病毒IgA抗体诊断试剂条制备

1、原料来源：羊抗人IgA抗体购自Sigma公司，人IgA抗体购自广州市诺思生物科技有限公司。呼吸道腺病毒六邻体蛋白抗原多肽片段的序列为：Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Val Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Val Leu(Seq ID NO.1)，总共46个氨基酸，委托上海吉尔生化公司负责合成，纯度大于98％，冻干保存。

2、羊抗人IgA抗体胶体金标记垫制备

在pH值6.8-7.0溶液内，羊抗人IgA抗体与胶体金颗粒标记形成羊抗人IgA抗体胶体金标记物(标记量为25ug/ml)，封闭液成分为PEG20000和BSA蛋白。将胶体金标记物喷涂到玻璃纤维膜上，稀释参数为30cm²/ml，并在湿度15％，温度30℃条件下干燥12小时以上，制备的胶体金标记垫密封备用。

3、硝酸纤维素膜包被

用包被液稀释人IgA抗体、呼吸道腺病毒六邻体蛋白抗原多肽片段，其中人IgA抗体的浓度为1.5mg/ml，呼吸道腺病毒六邻体蛋白抗原多肽片段浓度为1mg/ml。如附图1，将两者均匀喷涂到NC膜上，其中人IgA抗体喷到NC膜上C位置，呼吸道腺病毒六邻体蛋白抗原多肽片段喷到NC膜上T位置。将喷涂好的NC膜放置在湿度10-30％，温度20-35℃条件下烘干处理12小时以上，烘干好的NC膜密封备用。

4、组装、切条

结合附图1示意图，将吸水纸4、硝酸纤维素膜3、胶体金标记垫2、玻璃纤维膜1按顺序黏贴在pvc背板5上，然后调整切条机参数进行切条，切成4mm宽度的试纸条。

【实施例2】无菌脱脂棉制备

采购直径为2cm的医用脱脂棉球，捆绑上长度为8-10cm的棉线。将处理好的棉球放置高压锅中，压力条件121℃30分钟，高压后放置烤箱中干燥，温度100℃，时间4小时，干燥后的棉球铝箔袋真空密封。

【实施例3】唾液标本采集

本发明是将无菌脱脂棉放置到幼儿的舌下，棉线暴露在口外，口含3-5分钟。如附图2，将棉球22，放置到注射器21中，然后装上注射器推动杆，轻缓推动，获得唾液标本23，用2ml小管保存。

【实施例4】标本测试

结合附图3说明，将呼吸道腺病毒IgA纸条放置到装有唾液标本的小管中，样品垫端接触唾液标本，放置15-30分钟，然后肉眼观察结果。

如果唾液标本中含有呼吸道腺病毒IgA抗体，会与标记垫中的羊抗人IgA抗体胶体金标记物(C线)结合，上行到NC膜上的呼吸道腺病毒六邻体蛋白抗原多肽片段检测线(T线)特异结合，形成红色条带(附图4)。如果标本中没有含有相应的呼吸道腺病毒IgA抗体，羊抗人IgA抗体胶体金标记物会越过检测线(T线)，继续上行到对照线与人IgA抗体(C线)结合，在对照线上形成红色条带(附图5)。如果对照线(C线)没有形成红色条带，说明试纸条失效，结果不可靠(附图6)。

【实施例5】本发明呼吸道腺病毒IgA胶体金诊断方法与荧光PCR方法结果对比

选取临床标本60例，分别采集患者的唾液标本和咽拭子标本，分别用呼吸道腺病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与荧光PCR方法进行测试，结果如表1：

表1本发明的呼吸道腺病毒IgA抗体检测试纸条诊断方法与荧光PCR方法比较结果

本发明呼吸道腺病毒IgA胶体金诊断方法与荧光PCR方法比较，灵敏度达到95.00％，特异性95.00％，可以符合临床检测的条件。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神 和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。