一种用于微液滴荧光图像和光谱扫描的复用流式检测装置的制作方法

本发明属于光学检测技术领域，特别涉及一种用于微液滴荧光图像和光谱扫描的复用流式检测装置。

背景技术：

液滴微流控是21世纪兴起的微全分析技术。2001年，Quake等人首次采用T型通道微流控芯片形成单分散液滴，这种Bottom-up式的液滴生成方法显著提高了液滴的可操作性，促进了液滴微流控的快速发展(Thorsen T,Roberts R W,Arnold F H,et al.Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device[J].Physical review letters,2001,86(18):4163.)。微液滴作为一种微反应器具有没有交叉污染、产生频率高、反应速度快、匹配单细胞分析等优点。目前，针对微液滴的芯片在线分析技术具有分析速度快、通量高等优点，其中光学检测是微液滴在线分析的重要手段。

2007年，Schmidt等人设计了一种三明治结构的荧光光谱仪，CMOS图像传感器中每一个像素对应一种独立的颜色，待检测分子流经微流道时，可以得到完整的光谱图，但是该方法难以实现微液滴的光谱检测(Schmidt O,Bassler M,Kiesel P,et al.Fluorescence spectrometer-on-a-fluidic-chip[J].Lab on a Chip,2007,7(5):626-629.)。2010年美国哈佛大学Jeremy等人利用微液滴包裹转染了辣根过氧化物酶(HRP)基因的酵母细胞，并搭建光学系统检测HRP酶催化荧光反应的荧光强度作为基准，使用介电泳的方法剔除了不活跃的突变细胞株，但是该系统只能实现单一波长处荧光强度的检测，获得的信息量较低(Agresti J J,Antipov E,Abate A R,et al.Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107(9):4004-4009.)。2014年哈佛大学Alexander等人在同一芯片上实现了液滴生成、液滴阵列化，并识别出引用水内的细菌。通过抗原抗体结合将细菌连接在磁珠上，并用荧光染料标记细菌，利用CCD采集荧光图像判别引用水中细菌的数量。但是该系统无法获得发射光的光谱信息，难以应用于面向多目标的荧光编码检测方法(Golberg A,Linshiz G,Kravets I,et al.Cloud-enabled microscopy and droplet microfluidic platform for specific detection of Escherichia coli in water[J].PloS one,2014,9(1):e86341.)。

微液滴的产生和操控技术日渐成熟，然而对微液滴中组分进行高灵敏度检测的分析技术仍然相对薄弱，已报道的大多数液滴检测系统依赖于光学成像等低信息量的分析手段，限制了液滴微流控技术的进一步发展。例如，针对波长和荧光强度两个维度的复用荧光编码技术，仅仅得到单波长或某一窄波段内的荧光强度无法实现荧光解码，还需要对荧光信号进行宽波段的光谱扫描检测，但是现有的液滴检测系统难以同时得到荧光光谱和荧光图像信息，限制了荧光复用编码技术在液滴微流控领域内的应用。

综上，实现一种可用于微流控芯片流道中微液滴荧光图像和光谱扫描的复用流式检测装置很有必要，也具有广泛的应用前景。

技术实现要素：

为克服目前不能同时检测微液滴的荧光光谱和荧光图像信息的问题，满足荧光复用编码技术在微液滴内的应用需求，本发明提供了一种用于微液滴荧光图像和光谱扫描的复用流式检测装置。

该检测装置，包括微流控系统，用于微液滴的生成和聚焦；

物镜3位于待检测收缩流道2的上方，在物镜3的上方依次设有二色镜4和分光镜7，其中，二色镜4和分光镜7分别与水平方向成一定夹角；激光器6和扩束镜5位于二色镜4的一侧，且三者在同一水平面内的同一条直线上；EMCCD 9和滤光片8位于分光镜7的一侧，且三者在同一水平面内的同一条直线上；在分光镜7的上方设有透射型衍射光栅10，荧光分光光度计11位于透射型衍射光栅10上方；EMCCD 9和荧光分光光度计11分别连接至电脑。

该检测装置的检测方法为：

利用流动聚焦原理在微芯片中生成微液滴，通过收缩流道2实现微液滴的聚焦，激光器6发射出的激光由扩束镜5扩束后，经二色镜4反射，由物镜3聚焦于收缩流道2中的单个微液滴1，微液滴内的荧光物质经激发后所发荧光由物镜3收集并透过二色镜4，经过分光镜7分为两束，一束经过滤光片8后成像于EMCCD 9，记录荧光图像，并将数据发送至电脑；另外一束经过透射型衍射光栅10后，不同波长的光衍射到不同方向形成频率谱带，由荧光分光光度计11采集实现光谱扫描，并将数据发送至电脑。

二色镜4与水平方向呈45°角；激发器6发出的光线经扩束镜5折射扩束为平行光，经二色镜4反射后呈竖直向下的光路，经过物镜3的透镜组聚焦于微液滴，微液滴内的荧光物质被激发产生的荧光透过二色镜4竖直向上传播。

分光镜7与水平方向呈45°角，将二色镜4透过的发射荧光分成水平和竖直方向上的两路光线，分别用于荧光图像和荧光光谱扫描检测。

本发明的有益效果为：

本发明能够实现微流控芯片流道中微液滴荧光图像和光谱扫描的复用流式检测，得到微液滴的完整光学信息，满足荧光复用编码技术在微液滴内的应用需求。同时，通过软件设计实现EMCCD数据读取与荧光光谱扫描同步进行，极大地提高了采集速度和检测通量。

附图说明

图1为微液滴生成及聚焦示意图。

图2一种用于微液滴荧光图像和光谱扫描的复用流式检测装置示意图。

标号说明：1-微液滴，2-收缩流道，3-物镜，4-二色镜，5-扩束镜，6-激光器，7-分光镜，8-滤光片，9-EMCCD，10-透射型衍射光栅，11-荧光分光光度计。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

微液滴作为微反应器，已经成功应用于蛋白质结晶、材料合成、分子与细胞生物学和分析化学等领域。下面结合微液滴内激光诱导荧光检测进一步说明本发明的具体实施方式。

一种实施方式为，微流控系统包含水相输入装置、油相输入装置和微芯片，用于微液滴1的生成和聚焦。

步骤1)微芯片的加工：

微芯片的加工在洁净工艺间中完成。利用MEMS光刻加工出光刻胶模具，首先对硅片基底进行清洗、烘干后，旋涂SU-8负性光刻胶，通过掩模板对光刻胶曝光，再通过显影剂处理得到光刻胶模具。然后翻模得到PDMS芯片，通过氧等离子体处理实现PDMS和玻璃的键合，构建出微液滴生成及聚焦的微流道。微芯片含有多进样入口，满足两相溶液的进样需求。通过完善微芯片设计，实现微液滴1的快速、稳定生成。

步骤2)微液滴生成及聚焦：

其中油相为硅油，水相为包含荧光物质等反应物的水溶液。采用气压泵或注射泵用于硅油和反应物水溶液的输入，水油两相液流在流道交汇处形成流动聚焦产生微液滴1，并通过收缩流道2实现微液滴1的聚焦，如图1所示。微液滴1是在微芯片中生成的油包水两相液滴，为了产生稳定的油包水液滴，可以在微芯片使用前通入疏水剂(如Aquapel)，使得微流道壁更容易被油相浸润；同时在油相中加入表面活性剂span以保证微液滴1的稳定性。并考察收缩流道2的尺寸对于微液滴1聚焦效果、流动速度的影响，在适配探测器检测速度的前提下尽量提高微液滴1在收缩流道2内的流动速度，改善微液滴1聚焦效果。

一种实施方式为，按照图2搭建光学检测系统并进行调试、优化参数设计。

激光器6发射出的激光由扩束镜5扩束后，经二色镜4反射，由物镜3聚焦于收缩流道2中的单个微液滴1，微液滴1内荧光物质经激发后所发荧光由物镜3收集并透过二色镜4，经过分光镜7分为两束，一束经过滤光片8成像于EMCCD 9，调整EMCCD 9的增益等参数，采集微液滴1的荧光图像。另外一束经过透射型衍射光栅10后，不同波长的光衍射到不同方向形成频率谱带，由荧光分光光度计11采集荧光信号，实现荧光光谱扫描。

电脑上装有控制软件，控制荧光图像数据读取与荧光光谱扫描的同步进行，并对所得荧光图像和荧光光谱扫描的数据进行处理。通过软件设计进一步提高数据采集速度和检测通量。