测定gpr70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术、电化学传感器领域，特别是涉及测定受体和配基相互作用强度的新型电化学生物传感器的制备方法。
【背景技术】
[0002]G蛋白偶联受体(GPCR)是一类七次跨膜蛋白，它广泛分布在细胞表面，与其相互作用的分子称为配基。GPCR介导多种重要的生理功能，与很多疾病密切相关，是最重要的现代药物靶点家族。目前市场上约有50%的药物是以GPCR为靶点的筛选的。因此，GPCR分析方法和GPCR配体筛选方法的研宄是当今世界新药研宄的重点和热点。
[0003]目前，研宄受体与配基相互作用的测定方法主要有放射性配基结合试验、酶联免疫吸附法、液烁近邻检测、时间分辨荧光和荧光相关光谱学或者通过计算机软件模拟等技术手段。这些方法虽然具有高效、可靠和微量化等特点，但昂贵的测定成本、复杂的操作方法限制了其具体的应用。因此，研制出一种灵敏度高、操作简便、非放射性的检测方法对研宄受体-配基间的相互作用有重要的价值。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，发明了一种灵敏度高、操作方便、非放射性的检测受体-配基作用的传感器的制备方法。
[0005]本发明一种测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学生物传感器的制备方法，包括下述步骤:
[0006](I)将玻碳电极预处理后，取质量百分比浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴满处理后的玻碳电极表面，于45°C干燥3h使所述壳聚糖溶液形成包住玻碳电极的凝胶；
[0007](2)干燥后自然冷却至室温，再浸于浓度为lmol/L的NaOH溶液中5min，中和膜中醋酸，使壳聚糖在电极表面形成稳固结合，用超纯水清洗掉残留的NaOH溶液，之后以超纯水淋洗电极表面，并将其浸于超纯水中30min使NaOH离子彻底进入水中；
[0008](3)从超纯水中取出电极，自然晾干后置于纳米金溶胶中至少24h，得到纳米金电极；
[0009](4)将纳米金电极置于含GPR70受体蛋白的细胞粗提物中4°C自组装至少24h，即得单层修饰的纳米金电极；
[0010]所述GPR70受体蛋白提取通过下述方法制备:
[0011](I)CHO-Kl细胞的培养:CH0-K1置于含10%胎牛血清的F12K培养基中培养，待细胞长满培养皿80%时以1:6传代，剩余细胞离心重悬于含10%二甲基亚砜的胎牛血清中，冷存管依次置于4°C 1min — -20°C 30min — -80°C 16?18小时一液氮槽长期储存；
[0012](2)GPR70质粒的制备:通过NCBI网站查询GPR70基因全序列(AF337040.1)，进行单链oligo的设计及合成，加Hind III/Age I克隆位点，将合成好的序列装入载体并转化至感受态细胞DH5a，测序验证重组克隆中基因序列与要求相符；PCR产物酶切，连接到含有amp抗性的真核质粒pcDNA3.1-mycHis B的载体上，重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，通过氨苄青霉素培养基筛选挑取阳性克隆菌株，送测序验证，确认正确的片段已克隆入载体。置于LB液体培养基中扩大培养，使用去内毒素质粒抽提试剂盒提取质粒，用0D280 和 0D260 定量；
[0013](3)细胞转染及瞬时表达蛋白:CHO细胞复苏培养，调整细胞至最优生长状态，铺板，pcDNA3.1/my c-Hi s B-GPR70重组表达质粒转染CHO细胞，转染48h后，PBS洗板，收集细胞，加细胞裂解液破碎，1000g离心1min获得上清即含有目标蛋白，SDS-PAGE及WesternBlot检测。
[0014](5)再取硫堇/壳聚糖共聚物溶液滴加于上述单层纳米金修饰电极表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超纯水反复清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；然后置于纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4°C自组装至少24h，之后，超纯水冲洗后再置于含有膜受体蛋白的细胞粗提物中4°C自组装至少24h，最后置于浓度为lg/100mL的牛血清白蛋白溶液中37°C温育至少lh，以封闭非特异性位点，以含体积百分比为0.05%Tween-20的磷酸缓冲液清洗未结合的牛血清白蛋白，自然瞭干即得双层纳米金修饰的测定GPR70受体和其配基相互作用强度的电化学型生物传感器。
[0015]所述步骤(I)中玻碳电极预处理包括下述过程:
[0016]将玻碳电极依次分别用1.0“!11、0.34111、0.054111粒径的a-Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用!^03与H 20按照体积比为1:1配置的混合液、无水乙醇、超纯水清洗；在lmol/L H2SO4溶液中用扫描范围为-1.0?1.0V、扫描速度为0.lmV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至活化后的电极在10_3mol/LK3Fe (CN)6S液中的循环伏安曲线，扫描范围为0.6?一 0.1V，扫描速度为50mV/s，电极的循环伏安曲线的峰电位差应在80mV-64mV，最后置于氮气环境中干燥待用。
[0017]所述步骤(3)的纳米金溶胶通过下述方法得到:
[0018]①制备纳米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，取出后用水冲洗掉残留的酸液，再用蒸馏水浸泡24h，取出干燥后用含体积百分比为5%二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，之后用超纯水充分冲洗，烘干备用；
[0019]②根据Frens法取浓度为0.0 lg/1OOmL的氯金酸溶液100mL，加入浓度为lg/1OOmL的柠檬酸钠溶液4mL混勾，用HCl或K2CO3调节反应液pH值至7.0，置于微波炉中低火保持18min，自然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4°C避光保存备用。
[0020]所述步骤(5)的纳米金/辣根过氧化物酶溶液采用下述方法制备:用0.1MK2COJ节所述纳米金溶胶的pH值至7.0后，取ImL上述pH值为7.0的纳米金溶胶与ImL 2.0g/LpH7.4的磷酸盐缓冲溶液溶解的辣根过氧化物酶搅拌2h混匀，4°C静置18_24h。
[0021]所述步骤(5)的硫堇/壳聚糖共聚物溶液通过下述方法制备:将2.5mL质量体积百分比为2%的壳聚糖溶液加到320 μ L体积百分比为10%的戊二醛溶液中，混匀后加入0.0lM硫堇溶液200 μ L，最后加入体积百分比为2%的醋酸溶液至总体积为6mL，混匀后即可用于滴涂电极。
[0022]所述王水由浓HCl与浓HN03按照体积比为3: I的比例配置而成。
[0023]所述2.0g/L辣根过氧化物酶液的制备方法为:将0.02g辣根过氧化物酶溶于0.0lM pH值为7.4的磷酸缓冲液中。
[0024]所述自然晾干的双层纳米金修饰的测定GPR70与其配基相互作用强度的电化学型生物传感器保存于4°C PBS缓冲液中待用。
[0025]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0026]本发明的方法以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定GPR70 (GPCRs的一种)；以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于上述电极，并吸附GPR70构建了测定受体和配基相互作用强度的新型电化学生物传感器。该传感器灵敏度高，操作方便，无需放射性及荧光标记、能够实现快速定量检测。
【具体实施方式】
[0027]以下以用于测定GPR70受体和配基相互作用强度的新型电化学生物传感器的制备方法为实施例进行说明。
[0028]实施例1
[0029]1.玻碳电极的预处理:
[0030]将玻碳电极依次分别用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m粒径的a -Al2O3浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用1:1的HN