一种20(R)-人参皂苷Rg3的质量标准检测方法与流程

本发明涉及一种中药原料药的检测方法，尤其涉及一种20(R)-人参皂苷Rg3原料药的质量检测方法。

背景技术：

肿瘤是机体遗传和环境致癌因素以协同的方式，引起遗传物质DNA损伤、突变，同时伴随有多个癌基因激活和肿瘤抑制基因失活，使正常细胞不断增生、转化而形成的新生物。其为一种以局部细胞异常增生为特征的全身性疾病。根据肿瘤对人体的危害程度不同，将其分成两大类：良性肿瘤和恶性肿瘤。恶性肿瘤细胞能向周围浸润蔓延，甚至扩散转移到其它器官组织，继续成倍增生，造成对人体生命极大的威胁。

随着人口老龄化及生态环境、生活方式的改变，预计在未来20-30年中，全球恶性肿瘤的发病率、死亡率有逐年上升的趋势。据统计，在最适合工作时期(35-60岁)，肿瘤在各种死因中居首位。在传染病得到控制的一些国家，心脑血管病和恶性肿瘤己分别占死亡原因的第一位和第二位。肿瘤的危害不言而喻，它给病者造成的痛苦，给家庭带来的精神以及经济负担，对社会生产力造成的影响难以估量，恶性肿瘤成为严重危害人类生命的疾病。

目前现代医学对肿瘤的治疗仍然是以手术治疗配合放、化疗为主，手术虽能去除原发病灶，但不能从根本上杜绝肿瘤细胞的再生和繁殖，而这正是日后肿瘤复发和转移的的根源，化疗和放疗虽能杀灭癌细胞，但不能对机体癌靶细胞作出选择识别，对大量的正常组织细胞同样具有毒害作用，常引起骨髓抑制、免疫功能低下等副反应，别外还有肠胃反应和肝、肾、心脏功能损害，使患者难以坚持治疗，并且化疗药物在治疗过程中出现的耐药性已成为目前临床治疗中的难题之一。因此，有必要寻求疗效好、毒副作用小的治疗方法和药物。中药以其药源广泛、价格低廉、应用历史悠久等优点正成为抗肿瘤药物研究的热点。

国内外研究经验表明，来自于天然的先导化合物很有希望成为治疗癌症的新药，而且天然产物药理筛选的命中率比合成化合物高。天然先导化合物的发现为新药的目标化合物提供了结构模式，从天然结构活性出发，经结构修饰、类似物的合成及系统的活性研究，总结结构与活性(毒性)的相关性，作为设计新药目标化合物的基础，是国际上研究天然活性成分的主要思路和方法。而我国丰富的药用植物为开发结构新颖、作用独特的抗癌新药提供了独特的来源。并且肿瘤的综合治疗中，中医中药也是我国具有特色的传统手段，中医药的抗肿瘤作用也已越来越受到人们的关注，从中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物成为肿瘤研究的热点。从细胞、分子水平验证并揭示中药及其复方的药效物质基础的研究正成为当今研究的重要动向。

人参是属于五加科人参属的植物，在中国、韩国、日本被广泛应用，已有2000多年历史，以预防疾病和延长寿命为主要使用目的。据《神农本草经》记载，人参有：“补五脏，安神经，定魂魄，止惊悸，除邪气，名目益智，久服轻身延年”的作用。现代医学研究表明人参的主要功效和作用有：对于神经中枢系统的作用，抗癌抗肿瘤作用，免疫功能调节作用，抗糖尿病的作用，增强肝功能作用，心脑血管障碍改善，抗动脉硬化作用，血压调节作用，以及更年期障碍和抗骨质疏松作用，抗疲劳，抗氧化，抑制衰老等。

人参皂苷作为人参主要有效成分，被广泛研究和使用，其中以20(R)-人参皂苷Rg3最为引人瞩目，其作为人参的主要有效成分，安全性良好，已经被制成抗肿瘤口服制剂应用于临床，作为注射剂被深入研究。

随着人们对药品质量要求的日益提高，现有的20-(R)-人参皂苷Rg3质量检测方法仅仅是对其进行定性鉴别、定量检测和一些理化检测，不能够满足人们对20-(R)-人参皂苷Rg3的安全性、可控性的要求。

为了保证20(R)-人参皂苷Rg3药物的质量和疗效，需要建立20(R)-人参皂苷Rg3原料药或制剂的质量标准，本发明在大量的实验基础上，公开了一种包括定性、定量、理化检测、溶剂残留检测等在内的20(R)-人参皂苷Rg3的质量检测方法，为质量控制提供依据。本方法检测项目全面、检验方法先进科学，满足药品质量检测的要求。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种原料药20(R)-人参皂苷Rg3的质量检测方法，方法主要用于20(R)-人参皂苷Rg3原料药及其制剂的质量控制，具有简便、稳定、重复性好的特点，有利于提高检验效率，确保了20(R)-人参皂苷Rg3原料药和制剂的治疗效果。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种原料药20(R)-人参皂苷Rg3的质量检测方法，包括如下步骤：1)鉴别20(R)-人参皂苷Rg3；2)测定20(R)-人参皂苷Rg3的含量；3)检测相关物质。

其中，步骤1)中所述鉴别20(R)-人参皂苷Rg3包括如下顺序进行的步骤：

1A)分别精密称定20(R)-人参皂苷Rg3对照品、原料药20(R)-人参皂苷Rg3，并分别加入到甲醇-水混合溶液中，配制成20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶液和20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液；

1B)吸取20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶液、20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液、甲醇-水的混合溶液，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水的混合溶液为展开剂，进行薄层色谱分析，展开后，晾干，再喷以显色剂，在90-120℃下加热直至样品斑点显色清晰，其中：供试品溶液所显示的主斑点的位置和颜色应与标准对照品溶液所显示的主斑点的位置和颜色相同，且与其它成分的斑点彼此分离；甲醇-水的混合溶液则在相应位置无斑点。

特别是，步骤1A)中所述甲醇-水的混合溶液中甲醇与水的体积比为50-95:50-5，优选为90:10；步骤1B)中所述展开剂为三氯甲烷-甲醇-水的混合溶液的下层溶液，三氯甲烷、甲醇、水的体积之比为40-85:40-10:20-5，优选为65:35:10；所述显色剂为质量百分比浓度为1-20％硫酸乙醇溶液，优选为10％。

尤其是，步骤1A)中所述20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶液的浓度为0.01-5mg/ml，优选为0.1mg/ml；所述20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液的浓度为0.01-5mg/ml，优选为0.1mg/ml。

特别是，步骤1A)中将20(R)-人参皂苷Rg3对照品与甲醇-水的混合溶液混匀后，进行超声处理，使20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶解完全，配制成所述的20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶液；步骤1A)中将原料药20(R)-人参皂苷Rg3与甲醇-水的混合溶液混匀后，进行超声处理，使20(R)-人参皂苷Rg3原料药溶解完全，配制成所述的20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液。

其中，步骤2)中所述测定20(R)-人参皂苷Rg3含量包括如下顺序进行的步骤：

2A)将精密称取的20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶于甲醇-水的混合溶液中，制成20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶液，其中，每1ml对照品溶液中含有0.01-0.2mg的20(R)-人参皂苷Rg3对照品；

2B)将精密称取原料药20(R)-人参皂苷Rg3溶于甲醇-水的混合溶液中，制成20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液，其中，每1ml供试品溶液中含有0.01-0.2mg的原料药20(R)-人参皂苷Rg3；

2C)精密吸取对照品溶液两份、供试品溶液一份，分别注入液相色谱仪，分别进行液相色谱测定；第一份对照品溶液的进样体积为5-20μl，第二份对照品溶液的进样体积为第一份进样体积的80％，供试品溶液进样体积与第一份对照品溶液进样体积相同；通过测定20(R)-人参皂苷Rg3峰面积，以样品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算原料药20(R)-人参皂苷Rg3含量。

特别是，步骤2A)中首先将精密称取的20(R)-人参皂苷Rg3对照品加入到甲醇-水的混合溶液中，进行超声处理，使其溶解完全，配制成20(R)-人参皂苷Rg3对照品母液，然后再加入甲醇-水的混合溶液，稀释成每1ml含0.01-0.2mg 20(R)-人参皂苷Rg3的20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶液。

特别是，步骤2B)中首先将精密称取的原料药20(R)-人参皂苷Rg3溶于甲醇-水的混合溶液中，超声处理，使其溶解，配制成原料药供试品母液，然后再加入甲醇-水的混合溶液，稀释成每1ml含有0.01-0.2mg 20(R)-人参皂苷Rg3的原料药供试品溶液。

尤其是，步骤2A)、2B)中所述甲醇-水的混合溶液中甲醇与水的体积配比为50-95：5-50，优选为90:10；步骤2A)中所述20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶液的浓度为0.01-0.2mg/ml，优选为0.1mg/ml；步骤1B)中所述20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液的浓度为0.01-0.2mg/ml，优选为0.1mg/ml。

特别是，步骤2C)中所述液相色谱测定的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水为流动相；流速：0.5-1.5ml/min，优选为1.0ml/min；柱温为25-50℃，优选为30℃；蒸发光散射检测器检测，漂移管温度：60-200℃，优选为90℃；气体流速:1.0-4.0L/min，优选为2.2L/min；理论板数按20(R)-人参皂苷Rg3峰计算应在3000以上。

尤其是，步骤2C)所述液相色谱测定的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱尺寸为4.6mm×250mm，ODS2，5μm；所述流动相中甲醇与水的体积之比为50-95：5-50，优选为90:10。

特别是，步骤2C)中所述第一份对照品溶液、第二份对照品溶液、供试品溶液的进样体积分别优选为10μl、8μl、10μl。

其中，步骤3)中所述检测相关物质包括如下顺序进行的步骤：

3A)精密称取原料药20(R)-人参皂苷Rg3溶于三氯甲烷-甲醇-水的混合溶液中，制成每1ml含有原料药1-8mg的原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液；

3B)精密量取供试品溶液适量，用三氯甲烷-甲醇-水的混合溶液稀释，配制成每1ml中含原料药50-400μg的20(R)-人参皂苷Rg3供试品自身对照溶液；

3C)精密量取20(R)-人参皂苷Rg3供试品自身对照溶液3-15μl注入液相色谱仪，进行液相色谱检测灵敏度调节，使主成分20(R)-人参皂苷Rg3的色谱峰的峰高为满量程的10％-15％；

3D)再精密量原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液、20(R)-人参皂苷Rg3供试品自身对照溶液各3-15μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，则各杂质峰的峰面积的和与20(R)-人参皂苷Rg3供试品自身对照溶液的主峰的峰面积之比≤0.2-4。

特别是，步骤3A)、3B)中所述的三氯甲烷-甲醇-水的混合溶液为其下层溶液，三氯甲烷、甲醇、水的体积之比为40-85：40-10：20-5，优选为60:40:10；步骤3C)中所述中所述液相色谱测定的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水为流动相；流速：0.5-1.5ml/min，优选为0.8ml/min；柱温为25-50℃，优选为30℃；蒸发光散射检测器检测，漂移管温度:60-200℃，优选为90℃；气体流速:1.0-4.0L/min，优选为2.2L/min；理论板数按20(R)-人参皂苷Rg3峰计算在3000以上。

尤其是，步骤3C)所述液相色谱测定的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱尺寸为4.6mm×250mm，ODS2，5μm；所述流动相中甲醇与水的体积之比为50-95:5-50，优选为80:20。

其中，步骤3B)中所述20(R)-人参皂苷Rg3供试品自身对照溶液的浓度与20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液的浓度之比为3-7:100，优选为5:100。

特别是，步骤3D)中色谱图记录至主成份峰保留时间的3倍以上，优选为3倍。

特别是，所述原料药20(R)-人参皂苷Rg3的质量检测方法还包括步骤4)干燥失重检测，所述干燥失重检测包括：精密称定1.0-5.0g的原料药20(R)-人参皂苷Rg3，于105℃条件下进行干燥处理并称重，直至恒重；然后计算干燥减少的重量。

尤其是，所述称重至恒重是连续2次精密称重的重量之差，不得超过0.3mg。

特别是，所述原料药20(R)-人参皂苷Rg3的干燥失重不得过4.0％。

尤其是，按照中国药典2010年版一部附录IX G，检测原料药20(R)-人参皂苷Rg3的干燥失重。

特别是，所述原料药20(R)-人参皂苷Rg3质量检测方法还包括比旋度检测步骤，所述比旋度检测包括：将精密称定原料药20(R)-人参皂苷Rg3加入到溶剂中，制成比旋度检测液，其中每1ml比旋度检测液含有5-40mg的原料药20(R)-人参皂苷Rg3，然后将原料药20(R)-人参皂苷Rg3溶液置于比旋仪中进行测定。

其中，比旋度检测中所述溶剂选择吡啶、氯仿、甲醇或乙醇，优选为吡啶。

特别是，所述每1ml比旋度检测液含有20mg的原料药20(R)-人参皂苷Rg3。

尤其是，所述原料药20(R)-人参皂苷Rg3的比旋度为-12.5°至-17.5°。

特别是，所述原料药20(R)-人参皂苷Rg3的质量检测方法还包括步骤6)残留溶剂检测，其中所述残留溶剂检测为正丁醇残留检测。

其中，所述残留溶剂检测按照《中国药典》残留溶剂测定法(2010版二部附录ⅧP第二法)测定。

特别是，所述残留溶剂检测按照如下步骤进行测定：

6A)精密称定的正丁醇对照品适量，加入N,N-二甲基甲酰胺-水混合溶液中，摇匀，制成每1ml中含10-100μg的溶液；然后精密量取6ml，置20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得正丁醇对照品溶液及其顶空瓶；

6B)精密称定0.012g-0.12g的原料药20(R)-人参皂苷Rg3于另一20ml顶空瓶中，精密加入二甲基甲酰胺-水混合溶液6ml，密封瓶口，摇匀，即得原料药供试品溶液及其顶空瓶；

6C)顶空进样，顶空瓶于60-100℃下平衡20-45min后，分别精密量取正丁醇对照品溶液顶空瓶、原料药供试品溶液顶空瓶内气体各0.1-1ml，注入气相色谱仪，记录色谱图，以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算，即得原料药20(R)-人参皂苷Rg3中正丁醇残留量。

尤其是，所述原料药20(R)-人参皂苷Rg3中正丁醇残留量≤0.5％。

特别是，步骤6A)、6B)中所述N,N-二甲基甲酰胺-水混合溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为59-5:95-5，优选为30:70；步骤6C)所述的气相色谱测定的色谱条件如下：以聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度为30-50℃，维持14分钟，以每分钟35℃升温至230℃，维持2分钟；检测器温度200-450℃；进样口温度200-450℃；载气为氮气，流速为每分钟0.5-1.5ml，优选为每分钟1.0ml。顶空进样，顶空瓶平衡温度为60-100℃，优选为90℃；平衡时间为20-45分钟，优选为30分钟。理论塔板数以正丁醇峰计算应不低于10000。

尤其是，步骤6C)所述的气相色谱测定的色谱条件如下：以聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱，色谱柱规格为柱长为30m，内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm；所述检测器温度优选为270℃；进样口温度优选为250℃；顶空瓶平衡温度优选为90℃；平衡时间有选为30min。

特别是，所述原料药20(R)-人参皂苷Rg3的质量检测方法还包括步骤7)大孔吸附树脂有机残留物检测，所述大孔吸附树脂有机残留物包括测定正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯残留量。

其中，所述大孔吸附树脂有机残留物按照《中国药典》残留溶剂测定法(2010版二部附录ⅧP第二法)测定。

特别是，所述大孔吸附树脂有机残留物测定包括如下步骤：

7A)分别精密称取对照品正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯适量，加N，N-二甲基甲酰胺-水混合溶液，制成混合对照品溶液，其中每1ml混合对照品溶液中含对照品正己烷1-10μg、苯0.1-1μg、甲苯1-10μg、对二甲苯1-10μg、邻二甲苯1-10μg、苯乙烯1-10μg、1,2-二乙基苯1-10μg；

7B)精密吸取混合对照品溶液6ml，置于气相色谱仪的20ml顶空瓶中并密封，得混合对照品溶液及其顶空瓶；

7C)精密称取0.3-3g的原料药20(R)-人参皂苷Rg3，置于气相色谱仪的20ml顶空瓶中，精密加二甲基甲酰胺-水混合溶液6ml，密封瓶口，摇匀，得原料药供试品溶液及其顶空瓶；

7D)分别精密量取混合对照品溶液顶空瓶和原料药供试品溶液顶空瓶内气体各0.1-1ml，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，以供试品进样量与峰面积对数，按照外标两点法对数方程计算，得有机残留物含量。

尤其是，步骤7A)、7C)中所述N，N-二甲基甲酰胺-水混合溶液中N，N-二甲基甲酰胺与水的体积配比为5-95:95-5，优选为20:80；步骤7D)中所述的气相色谱测定的色谱条件如下:以聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱；柱温为程序升温：初始温度为40℃，维持8分钟，以每分钟15℃升温至200℃，维持3分钟；检测器温度200-450℃，优选为220℃；进样口温度200-450℃，优选为200℃；载气为氮气，流速为每分钟0.5-1.5ml，优选为每分钟1.0ml。顶空进样，顶空瓶平衡温度为60-100℃，优选为90℃；平衡时间为20-45min，优选为30min。理论塔板数以邻二甲苯峰计算应不低于20000，各待测峰之间的分离度应符合规定。

特别是，步骤7D)中所述的气相色谱测定的色谱条件如下:以聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱，色谱柱规格为：柱长为30m，内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm。

尤其是，20(R)-人参皂苷Rg3原料药中含苯不得过0.0002％，含正己烷、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯和1,2-二乙基苯均不得过0.002％。

本发明的有益效果体现在以下方面：

1、本发明方法专属性强，灵敏度高，检测灵敏度高，可满足微量杂质的检出要求，其中正丁醇残留溶剂的检测限达到12.5μg/ml；大孔吸附树脂有机残留物正己烷的检测限达到0.5μg/ml、苯的检测限达到0.085μg/ml、甲苯的检测限达到0.125μg/ml、对二甲苯的检测限达到0.0625μg/ml、邻二甲苯的检测限达到0.05μg/ml、苯乙烯的检测限达到0.0375μg/ml、1,2-二乙基苯的检测限达到0.0375μg/ml。

2、本发明方法定量准确度高、精密度和重复性好；原料药20(R)-人参皂苷Rg3含量测定过程中样品浓度在10.06～100.60μg/ml之间线性关系良好；含量测定的RSD值小于2.0％，方法重复性好、精密度高；正丁醇溶剂残留检测过程中，正丁醇浓度在25.0μg/ml-100.0μg/ml之间，线性关系良好、精密度高，稳定性好，方法重复性好。

3、本发明方法操作简便、操作过程稳定、重复性好，检验效率提高，检测成本降低，提高经济效益。

4、本发明方法提高了20(R)-人参皂苷Rg3原料药及制剂的质量的可控性，可以检测规模性生产，确保了20(R)-人参皂苷Rg3原料药和制剂的质量及疗效。

附图说明

图1是本发明20(R)-人参皂苷Rg3原料药鉴别的薄层色谱显色图，其中A为阴性样品；B为批号为20140501供试品；C为批号为20140502供试品；D为批号为20140503供试品；E为对照品；

图2是本发明原料药含量测定专属性试验的阴性对照色谱图；

图3是本发明原料药含量测定专属性试验的对照品色谱图；

图4是本发明原料药含量测定专属性试验的供试品色谱图；

图5是本发明20(R)-人参皂苷Rg3含量测定的标准曲线图；

图6是本发明20(R)-人参皂苷Rg3中残留溶剂检测正丁醇线性关系图；

图7是本发明20(R)-人参皂苷Rg3中大孔吸附树脂有机残留物正己烷线性关系图；

图8是本发明20(R)-人参皂苷Rg3中大孔吸附树脂有机残留物苯线性关系图；

图9是本发明20(R)-人参皂苷Rg3中大孔吸附树脂有机残留物甲苯线性关系图；

图10是本发明20(R)-人参皂苷Rg3中大孔吸附树脂有机残留物对二甲苯线性关系图；

图11是本发明20(R)-人参皂苷Rg3中大孔吸附树脂有机残留物邻二甲苯线性关系图；

图12是本发明20(R)-人参皂苷Rg3中大孔吸附树脂有机残留物苯乙烯线性关系图；

图13是本发明20(R)-人参皂苷Rg3中大孔吸附树脂有机残留物1,2-二乙基苯线性关系图；

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述20(R)-人参皂苷Rg3的质量检测方法，以下实施例包括了本发明的20(R)-人参皂苷Rg3的鉴别方法、含量测定、相关物质检测方法。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

本发明实施例所使用的仪器与试药为：

超声波清洗机(型号：LTA-1000S；佛山市林泰超声清洗设备科技有限公司)；

岛津高效液相色谱仪(SPD-20A，日本)；7890气相色谱仪(Agilent，美国)；

蒸发光散射检测器(ELSD 2000，美国ALLtech生产)；薄层板(青岛海洋化工厂)；

色谱柱(以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，型号：Hypersil ODS2，4.6mm×150mm×5μm，4.6mm×250mm×5μm，广州市自力色谱科仪有限公司)；

供试品：20(R)-人参皂苷Rg3原料药样品3批(批号：20140501、20140502、20140503，大连富生天然药物开发有限公司生产)；白色固体粉末、味微苦。

20(R)-人参皂苷Rg3对照品(纯度＞98％，购自中国药品生物制品检定研究院，批号：110804-200603)；

甲醇(色谱纯，Fisher公司)；双蒸水(临用现制)；其他试药均为分析纯。

试验例1 20(R)-人参皂苷Rg3的鉴别

1、制备供试品溶液

分别取批号为20140501、20140502、20140503的原料药20(R)-人参皂苷Rg3样品适量，研细后分别称取20(R)-人参皂苷Rg3样品(10.21mg、10.14mg、10.17mg)，置于100mL的容量瓶中，加入甲醇-水混合溶液适量，摇匀后置于超声仪进行超声处理60min，溶解，其中所述甲醇-水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10；接着冷却至室温(15-35℃)；然后加入甲醇-水混合溶液至容量瓶刻度线，摇匀，分别得到3个原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液(标记为20140501供试品溶液、20140502供试品溶液、20140503供试品溶液)。

2、制备对照品溶液

精密称取20(R)-人参皂苷Rg3对照品(10.01mg)，置于100mL的容量瓶中，加入甲醇-水混合溶液，溶解均匀，制成每1ml含0.1mg20(R)-人参皂苷Rg3的20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶液，其中其中所述甲醇-水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10。

3、薄层色谱法鉴别

吸取步骤1制备的3个供试品溶液、步骤2制备的对照品溶液、甲醇溶液各10μL，分别点样于同一硅胶G薄层板上，以体积比为65:35:10的三氯甲烷-甲醇-水下层溶液为展开剂，置于层析展开缸中进行薄层色谱处理，然后取出硅胶G薄层板，晾干，喷以显色剂(10％硫酸乙醇溶液)，在105℃加热至斑点显色清晰，显色结果如图1所示，其中供试品与对照品在相同位置有同样的显色斑点且显示相同颜色，Rf值为0.59，与其它成分的斑点得到很好的分离；阴性样品(即甲醇溶液)在相应位置无斑点。

试验例2 20(R)-人参皂苷Rg3含量测定

1、溶液配制

精密称取20(R)-人参皂苷Rg3对照品(10.06mg)，置于100ml容量瓶内，接着加入甲醇-水混合溶液，超声溶解，制成20(R)-人参皂苷Rg3对照品溶液，其中，每1ml对照品溶液中含有0.1006mg的20(R)-人参皂苷Rg3；甲醇-水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10；

精密称取20(R)-人参皂苷Rg3原料药(10.11mg)，置于100ml容量瓶内，接着加入甲醇-水混合溶液，超声溶解，制成20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液，其中，每1ml供试品溶液中含有0.1011mg的20(R)-人参皂苷Rg3；甲醇--水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10；

以甲醇--水混合溶液(其中甲醇与水的体积之比为90:10)为阴性对照溶液。

2、测定法

分别吸取对照品溶液8μl、10μl及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录20(R)-人参皂苷Rg3面积(A)，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，以甲醇-水(50-95：5-50，优选为90：10)为流动相，流速为0.5-1.2ml/min(优选为1.0mL/min)，柱温25-50℃(优选为30℃)；采用蒸发光散射检测器检测，漂移管温度:60-200℃(优选为90℃)；气体流速:1.0-4.0L/min(优选为2.2L/min)；理论板数按20(R)-人参皂苷Rg3峰计算应在2000-6000之间(优选不低于3000)。

以供试品进样量与峰面积对数，按照外标两点法对数方程计算供试品中20(R)-人参皂苷Rg3的含量。3、专属性试验

同时吸取阴性对照溶液、对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行测定，记录20(R)-人参皂苷Rg3峰面积，见图2、3、4。

测定结果表明：阴性对照溶液色谱图上没有呈现与20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰保留时间一致的色谱峰；20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液中其他色谱峰可与20(R)-人参皂苷Rg3峰达基线分离，且分离度大于1.5；按20(R)-人参皂苷Rg3峰计算，理论塔板数为3000以上，并且杂质尽快出峰，杂质出峰时间短，缩短检测时间，表明本发明的系统专属性、适用性好。

4、线性关系考察

4-1)精密吸取“1、溶液配制”步骤制成的对照品溶液，以甲醇-水混合溶液(甲醇与水的体积之比为90:10)逐级稀释，制成浓度为10.06μg/ml、20.12μg/ml、40.24μg/ml、80.48μg/ml、100.60μg/ml的20(R)-人参皂苷Rg3标准对照品溶液，作为线性考察用溶液；

4-2)分别精密吸取上述20(R)-人参皂苷Rg3标准对照品溶液各20μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行液相色谱测定，记录20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰，测定结果如表1所示。以峰面积的对数值为纵坐标，以样品浓度对数值为横坐标，由色谱工作站自动绘制标准曲线(见图5)，并计算得线性回归方程：Y＝3.2141X–1.235，R²＝0.999，N＝5。表明样品浓度在10.06～100.60μg/ml之间线性关系良好。

表1 20(R)-人参皂苷Rg3对照品线性关系考察测定结果

5、稳定性试验

5-1)精密称取原料药20(R)-人参皂苷Rg3(10.03mg)，置于100ml容量瓶内，接着加入甲醇-水混合溶液，超声溶解，制成20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液，其中，每1ml供试品溶液中含有0.1003mg的原料药20(R)-人参皂苷Rg3；甲醇--水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10；

5-2)分别于0，2，4，8，12小时精密吸取步骤5-1)制成的供试品溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行液相色谱测定，记录20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰，20(R)-人参皂苷Rg3峰面积的RSD为1.7％，表明供试品溶液在12小时内稳定，测定结果如表2所示。

表2稳定性试验结果

6、精密度试验

分6次精密吸取“1、溶液配制”步骤制成的对照品溶液10μl/次，重复进样6次，分别注入高效液相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行液相色谱测定，记录20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰，20(R)-人参皂苷Rg3峰面积的RSD为1.7％，表明本发明方法仪器测定20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液的精密度高，结果见表3。

表3仪器精密度试验结果

7、重复性试验

7-1)分6次分别精密称取批号：20140501的原料药20(R)-人参皂苷Rg3，精密称量的原料药的重量见表4，将6份原料药分别置于6个100ml容量瓶内，接着加入甲醇-水混合溶液，超声溶解，制成6份20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液，其中，甲醇--水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10；

7-2)分别精密吸取“1、溶液配制”步骤中的对照品溶液8μl、10μl及7-1)步骤中6份20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行液相色谱测定，记录20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰，以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算供试品中20(R)-人参皂苷Rg3的含量，并计算含量的RSD值。

原料药中20(R)-人参皂苷Rg3含量与含量的RSD值如表4。结果表明，含量的RSD值小于2.0％，方法重复性良好。

表4重复性试验结果

8、回收率试验

8-1)分别精密称取批号：20140501；含量为95.1％的20(R)-人参皂苷Rg3原料药9份，每份约12.50mg，分别置于9个250ml的容量瓶中，原料药重量见表5，分成3组，每组3份；

8-2)向每组原料药中分别添加20(R)-人参皂苷Rg3对照品，得到回收率试验供试品，其中：第一组中20(R)-人参皂苷Rg3对照品的添加量约为12.30mg/份；第二组中20(R)-人参皂苷Rg3对照品的添加量约为9.60mg/份；第三组中20(R)-人参皂苷Rg3对照品的添加量约为14.50mg/份；

8-3)将甲醇-水混合溶液分别加入到容量瓶中并定容，超声溶解，过滤，得9份回收率试验供试液，其中，甲醇--水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10；

8-4)分别精密吸取“1、溶液配制”步骤中的对照品溶液8μl、10μl及8-3)步骤中9份回收率试验供试液各10μl，注入液相色谱仪，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行液相色谱测定，记录20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰，以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算回收率试验供试液中20(R)-人参皂苷Rg3的重量，并计算回收率，结果见表5。

表5回收率测定结果

9、方法耐用性试验

9-1)精密称取批号为20140501的原料药20(R)-人参皂苷Rg3(10.40mg)至100ml量瓶中，加入甲醇-水混合溶液，超声溶解，定容至刻度，制成浓度为0.1040mg/ml的原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品液，备用，其中甲醇-水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10；

9-2)分别精密吸取“1、溶液配制”步骤中的对照品溶液8μl、10μl及上述20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液10μl，分别注入采用表6所示的色谱柱的高效液相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行液相色谱测定，记录20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰的出峰时间(即保留时间)、分离度、色谱柱柱效，其中，色谱柱Hypersil ODS C18(4.6×150mm，5μm，大连，依利特)；YGW C18(4.6×150mm，5μm，大连，科瑞)；Chromatorex ODS C18(4.6×150mm，5μm，大连，科瑞)；测定结果如表6。

不同的色谱柱对20(R)-人参皂苷Rg3的保留时间不同，但分离度都大于1.5，理论板数大于3000，满足定量分析条件，说明该含量测定方法耐用性良好。

表6 20(R)-人参皂苷Rg3测定方法耐用性试验结果

试验例3相关物质测定

1、溶液配制：

1-1)精密称取20(R)-人参皂苷Rg3原料药(40.03mg)，置10ml量瓶中，加混合溶液三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1)适量，超声处理使溶解，并用混合溶液三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1)稀释至刻度，制成每1ml含4.003mg 20(R)-人参皂苷Rg3原料药的相关物质测定供试品溶液。

1-2)精密量取步骤1-1)配制的供试品溶液5ml，置100ml量瓶中，加混合溶液三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1)稀释至刻度，摇匀，作为相关物质测定供试品自身对照品溶液，此自身对照品溶液浓度相当于供试品溶液浓度的5％。

1-3)取混合溶液三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1)作为阴性对照溶液。

2、测定法：

2-1)色谱系统条件：色谱柱Hypersil ODS-C18，5μm，250×4.6mm；甲醇：水(80:20)为流动相，流速：0.8ml/min；柱温为30℃；蒸发光散射检测器，漂移管温度：90℃，气体流速：2.2L/min；进样量：5μl。

2-2)精密量取步骤1-2)制备的20(R)-人参皂苷Rg3供试品自身对照溶液5μl注入液相色谱仪，进行液相色谱检测灵敏度调节，使主成分20(R)-人参皂苷Rg3的色谱峰的峰高为满量程的10％-15％；

2-3)再精密量取步骤1-1)制备的原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液及步骤1-2)制备的供试品自身对照溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液的主峰面积。

3、专属性试验

精密量取步骤1-2)制备的供试品自身对照溶液5μl注入液相色谱仪，进行液相色谱检测灵敏度调节，使主成分20(R)-人参皂苷Rg3的色谱峰的峰高为满量程的10-15％；再分别精密量取步骤1-2)中的自身对照品溶液、阴性对照溶液各5μl，注入液相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行测定。

测定结果表明：在相关物质测定自身对照品溶液的色谱图上，有20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰，在阴性对照溶液色谱图上的相应位置则无人参皂苷Rg3色谱峰干扰，证明本方法专属性良好。

4、20(R)-人参皂苷Rg3检出限

4-1)精密称取步骤1-2)制备的20(R)-人参皂苷Rg3相关物质测定自身对照品溶液(1ml)，以混合溶液三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1)逐级稀释，制得浓度为10ng/μl的20(R)-人参皂苷Rg3检出限测定液；

4-2)精密吸取人参皂苷Rg3检出限测定液10μl，注入高效液相色谱仪，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行测定，记录色谱图，计算信噪比(S/N≥3)。本法的最低检出限为0.1μg。

5、方法耐用性试验

精密量取1-1)制备的20(R)-人参皂苷Rg3相关物质测定供试品溶液5μl，分别注入采用表7所示的色谱柱的高效液相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行测定，记录色谱图，记录20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰的出峰时间(即保留时间)、分离度、色谱柱柱效，其中，色谱柱Hypersil ODS C18(4.6×250mm，5μm，大连，依利特)；Diamonsil C18(4.6×250mm，5μm，迪马公司)；测定结果如表7。

不同的色谱柱对20(R)-人参皂苷Rg3中有关物质的保留时间不同，但分离度都大于1.5，理论板数大于3000，满足定量分析条件，说明该测定方法耐用性良好。

表7 20(R)-人参皂苷Rg3限度测定方法耐用性试验结果

6、三批样品有关物质检查

6-1)分别精密称取批号：20140501、20140502、20140503的20(R)-人参皂苷Rg3原料药各40.11mg、40.02mg、40.08mg，分别置于3个10ml量瓶中，加混合溶液三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1)适量，超声处理使溶解，并用混合溶液三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1)稀释至刻度，制成原料药20(R)-人参皂苷Rg3相关物质测定供试品溶液；

6-2)分别精密量取步骤6-1)配制的供试品溶液各5ml，分别置于3个100ml量瓶中，加混合溶液三氯甲烷-甲醇-水(6:4:1)稀释至刻度，摇匀，作为相关物质测定供试品自身对照品溶液，此自身对照品溶液浓度相当于步骤6-1)供试品溶液浓度的5％；

6-3)精密量取步骤6-2)制备的相关物质测定供试品自身对照溶液5μl注入液相色谱仪，进行液相色谱检测灵敏度调节，使主成分20(R)-人参皂苷Rg3的色谱峰的峰高为满量程的10％-15％；

6-4)再精密量取步骤6-1)制备的原料药相关物质测定供试品溶液及步骤6-2)制备的相关物质测定供试品自身对照溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，记录20(R)-人参皂苷Rg3色谱峰以及杂质峰面积，并计算杂质峰面积之和，结果如表8。

表8 20(R)-人参皂苷Rg3三批样品检测结果

试验例4 20(R)-人参皂苷Rg3干燥失重检测

按照《中国药典一部》(2010年版)附录ⅧL(干燥失重测定法)测定原料药20(R)-人参皂苷Rg3的干燥失重，具体方法如下：精密称取原料药20(R)-人参皂苷Rg3(1.0g)，平铺于事先干燥至恒重的称量瓶中，接着置于105℃条件下，在常压状态下进行干燥处理并称重，直至连续2次精密称重至恒重，计算干燥失重，减失的重量不得超过4.0％。

试验例5 20(R)-人参皂苷Rg3比旋度检测

按照《中国药典一部》(2010年版)附录ⅦE(旋光度测定法)测定原料药20(R)-人参皂苷Rg3的比旋度，具体方法如下：精密称取原料药20(R)-人参皂苷Rg3(200.5641mg)，置10ml容量瓶中，加入吡啶，溶解，制成比旋度检测液，其中，每1ml比旋度检测液中含有20.05641mg的原料药20(R)-人参皂苷Rg3；然后将比旋度检测液置于比旋仪(上海精密科学仪器有限公司)中进行测定，读取比旋度检测液的旋光度(a)，采用相同的方法读取旋光度3次，取3次的平均值，按照公式(Ⅰ)计算原料药20(R)-人参皂苷Rg3的比旋度α，计算结果原料药20(R)-人参皂苷Rg3的比旋度α为-12.5°至-17.5°。

[α]^tD＝100α/lc(Ⅰ)

其中：D为钠光谱的D线；t为测定温度，℃；l为测定管的长度，dm；α为测得的旋光度；C为100ml溶液中含有被测物质的重量，g(按干燥品或无水物计算)。

试验例6 20(R)-人参皂苷Rg3正丁醇溶剂残留检测

1、溶液配制

1-1)精密称定的正丁醇对照品(500.03mg)，置于100ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，制得正丁醇对照品母液，然后精密量取1ml正丁醇对照品母液，置于100ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，制得正丁醇对照品溶液；最后精密量取6ml正丁醇对照品溶液置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得正丁醇对照品溶液及其顶空瓶。

1-2)精密称定原料药20(R)-人参皂苷Rg3(0.06g)，置于20ml顶空瓶中，精密加入二甲基甲酰胺溶液6ml，密封瓶口，摇匀，得原料药供试品溶液及其顶空瓶。

1-3)精密量取二甲基甲酰胺溶液6ml，密封瓶口，即得阴性对照溶液及其顶空瓶；

其中：步骤1-1)、1-2)、1-3)中所述N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为30:70。

2、测定法

2-1)顶空进样，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30分钟；

2-2)分别精密量取正丁醇对照品溶液顶空瓶和供试品溶液顶空瓶内气体各1ml，分别注入气相色谱仪，记录色谱图和正丁醇峰面积，测定的色谱条件如下：

以聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm(广州，菲罗门公司)；柱温为程序升温：初始温度为50℃，维持14分钟，以每分钟35℃升温至230℃，维持2分钟；检测器温度270℃；进样口温度250℃；载气为氮气，流速为每分钟1.0ml。

以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算，即得原料药20(R)-人参皂苷Rg3中正丁醇残留量。理论塔板数以正丁醇峰计算应不低于10000。本品含正丁醇不得过0.5％。

3、专属性试验

吸取阴性对照溶液顶空瓶、正丁醇对照品溶液顶空瓶和原料药供试品溶液顶空瓶内气体各1ml，注入气相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行测定，记录色谱图。

测定结果表明：正丁醇对照品溶液的色谱图上，有正丁醇色谱峰；在阴性对照溶液色谱图上的相应位置，无色谱峰干扰；供试品溶液的色谱图中，正丁醇出峰时间处，无杂质峰干扰；证明本方法专属性良好。

4、检测限

精密称定的正丁醇对照品(500.02mg)，置于100ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液，摇匀，制得正丁醇对照品母液，然后精密量取0.25ml正丁醇对照品母液，置于100ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液，摇匀，制得正丁醇对照品溶液，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为30:70；然后精密量取6ml正丁醇对照品溶液置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得正丁醇检测限测定液和正丁醇检测限测定液顶空瓶。

按照“2、测定法”操作及进行气相色谱测定，记录色谱图和正丁醇峰面积，计算信噪比(S/N≥3)。经验证，正丁醇的检测限为12.5μg/ml。

5、定量限

精密称定的正丁醇对照品(500.02mg)，置于100ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液，摇匀，制得正丁醇对照品母液，然后精密量取0.5ml正丁醇对照品母液，置于100ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液，摇匀，制得正丁醇对照品溶液，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为30:70；然后精密量取6ml正丁醇对照品溶液置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得正丁醇定量限测定液和正丁醇检定量测定液顶空瓶。

按照“2、测定法”操作及进行气相色谱测定，记录色谱图和正丁醇峰面积(见表9)，计算信噪比(S/N≥10)。经验证，正丁醇的定量限为25μg/ml。

表9正丁醇溶剂残留定量限考察数据表

6、线性关系考察

6-1)精密称定的正丁醇对照品(500.05mg)，置于100ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液中，摇匀，制得正丁醇对照品母液，然后精密量取2ml正丁醇对照品母液，置于100ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液，摇匀，制得正丁醇对照品溶液；最后精密量取6ml正丁醇对照品溶液置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得正丁醇对照品溶液和正丁醇对照品溶液顶空瓶。

6-2)精密吸取正丁醇对照品母液，以N,N-二甲基甲酰胺溶液逐级稀释，制成浓度如表10所示的正丁醇标准对照品溶液，作为线性考察用溶液；

其中：N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为30:70。

6-3)分别精密量取不同的正丁醇标准对照品溶液各6ml并分别置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得不同浓度的正丁醇标准对照品溶液和正丁醇标准对照品溶液顶空瓶；

6-4)分别精密量取不同浓度的正丁醇标准对照品溶液顶空瓶内气体各1ml，分别注入气相色谱仪，按照“2、测定法”操作及进行气相色谱测定，记录色谱图和正丁醇峰面积，并以正丁醇峰面积为纵坐标，正丁醇浓度为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线为Y＝0.9981X+5.8871，R＝0.9991，N＝5(表10，图6)。结果表明，正丁醇在浓度在25.0μg/ml-100.0μg/ml之间，线性关系良好。

表10正丁醇线性关系考察数据表

7、精密度

分别精密吸取“1、溶液配制”步骤制得的正丁醇对照品溶液的顶空气体6次，每次1ml，分别注入气相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行气相色谱测定，记录正丁醇色谱峰，正丁醇峰面积的RSD为2.4％，表明本发明方法仪器测定正丁醇溶液的精密度高，结果见表11。

表11精密度考察数据表

8、稳定性

从步骤“1、溶液配制”制备的100ml正丁醇对照品溶液中分5次分别精密量取6ml正丁醇对照品溶液，分别置于5个20ml顶空瓶中，密封瓶口；然后分别于0、2、4、6、8小时，精密吸取其中一瓶的顶空瓶内气体1ml，注入气相色谱仪中，按照“2、测定法”操作并进行气相色谱测定，记录正丁醇色谱峰，正丁醇峰面积的RSD为2.4％，表明本发明方法仪器测定正丁醇的溶液稳定性好，在8小时内稳定，测定结果如表12所示。

表12稳定性考察数据表

9、重复性

9-1)精密称取原料药20(R)-人参皂苷Rg3(批号：20140501)6份，原料药的重量见表13，将6份原料药分别置于6个20ml顶空瓶内，接着加入二甲基甲酰胺溶液6ml，密封瓶口，摇匀，即得供试品溶液及其顶空瓶，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为30:70。

9-2)分别精密吸取“1、溶液配制”步骤中的正丁醇对照品溶液和步骤9-1)中制备的供试品溶液顶空瓶内气体各1ml，注入气相色谱仪，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行气相色谱测定，记录正丁醇色谱峰，计算样品中正丁醇的含量，并计算含量的RSD值。

正丁醇对照品溶液正常检出，原料药供试品溶液中正丁醇含量与含量的RSD值如表13。结果表明，含量的RSD值小于2.0％，方法重复性良好。

表13重复性数据考察数据表

10、回收率试验

10-1)将精密称定的正丁醇对照品(500.02mg)置于100ml容量瓶后加入N,N-二甲基甲酰胺溶液，摇匀，制得正丁醇对照品母液；接着分别精密量取0.8ml、1.0ml、1.2ml正丁醇对照品母液，分别置于3个100ml容量瓶内，并加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，制得正丁醇对照品溶液A、B、C，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为30:70；

10-2)精密称定原料药20(R)-人参皂苷Rg3(批号20140501)9份，分成3组，每组的取样量分别约为0.48g、0.60g、0.72g(如表14)，并分别添加步骤10-1)中制备的正丁醇对照品溶液各6ml，密封瓶口，摇匀，即得供试品溶液和供试品溶液顶空瓶，其中组1中添加正丁醇对照品溶液A；组2添加正丁醇对照品溶液B；组3添加正丁醇对照品溶液C。

10-3)分别精密吸取“1、溶液配制”步骤中的对照品溶液顶空气体1ml与步骤10-2)步骤中制备的正丁醇供试品溶液顶空瓶内气体各1ml，注入气相色谱仪中，按照“2、测定法”操作并进行气相色谱测定，记录正丁醇色谱峰，以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算，正丁醇的量、回收率，结果如表14。

表14正丁醇回收率试验数据表

试验例7 20(R)-人参皂苷Rg3大孔吸附树脂有机残留物检测

1、溶液配制

1-1)分别精密称定对照品正己烷(5000.02mg)、苯(500.06mg)、甲苯(5000.01mg)、对二甲苯(5000.04mg)、邻二甲苯(5000.05mg)、苯乙烯(5000.10mg)、1,2-二乙基苯(5000.11mg)，置于同一容量瓶(1000ml)内，并加入N,N-二甲基甲酰胺溶液，摇匀，得混合对照品母液；然后精密量取1ml混合对照品母液，置于1000ml容量瓶内，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，得混合对照品溶液；最后精密量取6ml混合对照品溶液置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，得混合对照品溶液及其顶空瓶。

1-2)精密称定原料药20(R)-人参皂苷Rg3(1.5g)，置于20ml顶空瓶中，精密加入N,N-二甲基甲酰胺溶液6ml，密封瓶口，摇匀，即得供试品溶液和供试品溶液顶空瓶。

1-3)精密量取N,N-二甲基甲酰胺溶液6ml，密封瓶口，即得阴性对照溶液和阴性对照溶液顶空瓶。

其中：步骤1-1)、1-2)、1-3)中所述N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为20:80。

2、测定法

2-1)顶空进样，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30分钟；

2-2)分别精密量取混合对照品溶液顶空瓶和供试品溶液顶空瓶内气体各1ml，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，测定的色谱条件如下：

以聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱(柱长为30m，内径为0.25mm，膜厚度为0.25um)；柱温为程序升温：初始温度为40℃，维持8分钟，以每分钟15℃升温至200℃，维持3分钟；检测器温度220℃；进样口温度200℃；载气为氮气，流速为每分钟1.0ml。以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算，即得原料药20(R)-人参皂苷Rg3中大孔树脂残留物的残留量。理论塔板数以邻二甲苯峰计算应不低于20 000，各待测峰之间的分离度应符合规定。

本品含苯不得过0.0002％，含正己烷、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯和1,2-二乙基苯均不得过0.002％。

3、专属性试验

吸取阴性对照溶液顶空瓶、混合对照品溶液顶空瓶和原料药供试品溶液顶空瓶内气体各1ml，注入液相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行测定，记录色谱图。

测定结果表明：在混合对照品溶液的色谱图上，有正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯色谱峰；在阴性对照溶液色谱图上的相应位置，无色谱峰干扰；供试品溶液的色谱图中，在相应的出峰时间处，无杂质峰干扰；证明本方法专属性良好。

4、检测限

4-1)分别精密称取对照品正己烷(5000.12mg)、苯(850.13mg)、甲苯(1250.08mg)、对二甲苯(620.50mg)、邻二甲苯(500.01mg)、苯乙烯(375.01mg)、1,2-二乙基苯(375.04mg)，分别置于7个1000ml容量瓶内，接着分别加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，分别制得正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1、2二乙基苯的对照品母液A，然后分别精密量取1ml相应的7种对照品母液A，分别置于7个100ml容量瓶内，并加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，分别制得相对应的7种对照品母液B；然后分别精密量取1ml相应的7种对照品母液B，分别置于7个100ml容量瓶内，并加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，制得相应的7种对照品母液；最后分别精密量取7种对照品母液各6ml，分别置于7个20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得7种对照品溶液和对照品溶液顶空瓶，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为20:80。

4-2)按照“2、测定法”操作，精密吸取上述7种对照品溶液顶空瓶内气体各1ml，注入气相色谱仪，进行气相色谱测定，记录色谱图和色谱峰峰面积，计算信噪比(S/N≥3)。经验证，正己烷的检测限为0.5μg/ml、苯的检测限为0.085μg/ml、甲苯的检测限为0.125μg/ml、对二甲苯的检测限为0.0625μg/ml、邻二甲苯的检测限为0.05μg/ml、苯乙烯的检测限为0.0375μg/ml、1,2-二乙基苯的检测限为0.0375μg/ml。

5、定量限

5-1)分别精密称取正己烷对照品(2500.22mg)、苯(250.11mg)、甲苯(500.03mg)、对二甲苯(500.50mg)、邻二甲苯(500.01mg)、苯乙烯(500.01mg)、1,2-二乙基苯(500.02mg)，分别置于7个1000ml容量瓶内，并分别加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，分别制得正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1、2二乙基苯的对照品母液A，然后分别精密量取1ml相应的7种对照品母液A，分别置于7个1000ml容量瓶内，并加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，分别制得相应的7种对照品母液；然后分别精密量取7种对照品母液各6ml，分别置于7个20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得7种对照品溶液和对照品溶液顶空瓶，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为20:80。

5-2)按照“2、测定法”操作，精密吸取上述7种对照品溶液顶空瓶内气体各1ml，注入气相色谱仪，进行气相色谱测定，记录色谱图和色谱峰峰面积(见表15)，计算信噪比(S/N≥10)。经验证，正己烷的定量限为2.5μg/ml、苯的定量限为0.25μg/ml、甲苯的定量限为0.5μg/ml、二甲苯的定量限为0.5μg/ml、苯乙烯的定量限为0.5μg/ml、1,2-二乙基苯的定量限为0.5μg/ml。

表15有机残留物定量限考察数据表

6、线性关系考察

6-1)将分别精密称取对照品正己烷(1003.40mg)、甲苯(995.90mg)、对二甲苯(993.83mg)、邻二甲苯(1017.41mg)、苯乙烯(996.60mg)、1,2-二乙基苯(989.90mg)分别置于6个100ml容量瓶；接着精密称取对照品苯(988.56mg)并置于10ml容量瓶内；然后分别加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至相应的刻度，摇匀，制得相对应的单一对照品母液A(即正己烷、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1、2二乙基苯、苯的对照品母液A)，

6-2)分别精密量取各单一对照品母液A各1ml，置于同一容量瓶(100ml)内，并加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，制得混合对照品母液B；

6-3)精密量取混合对照品母液B 5份，体积为2.5ml、3.75ml、5ml、7.5ml、10ml，分别置于5个100ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液，摇匀，制得相应的5个浓度的混合对照品母液(浓度数据见表16-22)，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为20:80；

6-4)最后分别精密量取上述5个浓度的混合对照品母液各6ml，置于5个20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得5个浓度的混合对照品溶液和对照品溶液顶空瓶。

6-5)按照“2、测定法”操作，分别精密吸取上述5个浓度的混合对照品溶液顶空瓶气体1ml，注入气相色谱仪，进行气相色谱测定，记录色谱图和色谱峰峰面积，并以峰面积对数为纵坐标，样品浓度的对数为横坐标，按照外标两点法对数方程分别绘制正己烷、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1、2二乙基苯、苯的标准曲线。

6.1正己烷线性关系

标准曲线为Y＝38.113X-40.117，R＝0.9963，N＝5(表16，图7)。表明正己烷在浓度为2.50850μg/ml-10.03400μg/ml之间，线性关系良好。

表16正己烷线性关系考察数据表

6.2苯线性关系

标准曲线为Y＝48.272X-3.9504，R＝0.9934，N＝5(表17，图8)。表明苯在浓度为0.24712μg/ml-0.98856μg/ml之间，线性关系良好。

表17苯线性关系考察数据表

6.3甲苯线性关系

标准曲线为Y＝42.885X-10.871，R＝0.9944，N＝5(表18，图9)。表明甲苯在浓度为2.48975μg/ml-9.95900μg/ml之间，线性关系良好。

表18甲苯线性关系考察数据表

6.4对二甲苯线性关系

标准曲线为Y＝44.695X-12.85，R＝0.9955，N＝5(表19，图10)。表明对二甲苯在浓度为2.48456μg/ml-9.93831μg/ml之间，线性关系良好。

表19对二甲苯线性关系考察数据表

6.5邻二甲苯线性关系

标准曲线为Y＝37.577X-8.0107，R＝0.9960，N＝5(表20，图11)。表明邻二甲苯在浓度为2.54350μg/ml-10.17406μg/ml之间，线性关系良好。

表20邻二甲苯线性关系考察数据表

6.6苯乙烯线性关系

标准曲线为y＝29.983x-0.5896，R＝0.9953，N＝5(表21，图12)。表明苯乙烯在浓度为2.49150μg/ml-9.96600μg/ml之间，线性关系良好。

表21苯乙烯线性关系考察数据表

6.7 1,2-二乙基苯线性关系

标准曲线为Y＝46.08X-7.0118，R＝0.9964，N＝5(表22，图13)。表明1,2-二乙基苯在浓度为2.47250μg/ml-9.89000μg/ml之间，线性关系良好。

表22 1,2-二乙基苯线性关系考察数据表

7、精密度

分别精密吸取“1、溶液配制”步骤制成的混合对照品溶液的顶空气体6次，每次1ml，分别注入气相色谱仪中，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行气相色谱测定，记录正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯色谱峰，峰面积的RSD依次为2.3％、9.1％、3.3％、4.3％、4.8％、3.4％、6.4％，表明本发明方法仪器测定溶液的精密度高，结果见表23。

表23精密度考察数据表

8、稳定性

从步骤“1、溶液配制”制备的1000ml混合对照品溶液中中分5次分别精密量取6ml混合对照品溶液，分别置于5个20ml顶空瓶中，密封瓶口；然后分别于0、2、4、6、8小时，精密吸取其中一瓶的顶空瓶内气体1ml，分别注入气相色谱仪中，按照“2、测定法”操作并进行气相色谱测定，记录正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯色谱峰，峰面积的RSD值依次为7.6％、7.2％、4.2％、6.4％、7.2％、4.4％、6.8％，表明本发明方法的溶液稳定性好，在8小时内稳定，结果见表24。

表24稳定性考察数据表

9、重复性

9-1)精密称取原料药20(R)-人参皂苷Rg3(批号：20140501)6份，原料药的重量见表25，将6份原料药分别置于6个20ml顶空瓶内，接着加入二甲基甲酰胺溶液6ml，密封瓶口，摇匀，得供试品溶液及其顶空瓶，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为20:80。

9-2)精密吸取“1、溶液配制”步骤中配制的混合对照品溶液顶空瓶内气体与步骤9-1)中配制的供试品溶液顶空瓶内气体各1ml，注入气相色谱仪，按照“2、测定法”步骤中的色谱系统条件进行气相色谱测定，记录色谱峰，并计算样品中正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯的含量，并计算含量的RSD值。原料药中大孔吸附树脂有机残留物含量与含量的RSD值如表25。RSD值小于2.0％，表明方法重复性良好。

表25重复性数据考察数据表

10、回收率试验

10-1)精密称定对照品正己烷(5000.02mg)、苯(500.06mg)、甲苯(5000.01mg)、对二甲苯(5000.04mg)、邻二甲苯(5000.05mg)、苯乙烯(5000.10mg)、1,2-二乙基苯(5000.11mg)，置于同一1000ml容量瓶内，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，精密量取6ml，置顶空瓶中，密封，得混合对照品母液，然后分别精密量取0.8ml、1.0ml、1.2ml混合对照品母液，置于3个100ml容量瓶内，分别加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，制得混合对照品溶液A、B、C，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为20:80；

10-2)精密称定原料药20(R)-人参皂苷Rg3(批号20140501)9份，分成3组，称样量见表26，分别添加步骤10-1)中制备的混合对照品溶液A、B、C各6ml，密封瓶口，摇匀，即得原料药供试品溶液及其顶空瓶，其中组1中添加混合对照品溶液A；组2添加混合对照品溶液B；组3添加混合对照品溶液C。

10-3)分别精密吸取步骤10-1)中配制的混合对照品溶液B的顶空气体1ml、步骤10-2)中制备的原料药供试品溶液顶空瓶内气体1ml，注入气相色谱仪，按照“2、测定法”操作、进行气相色谱测定，记录正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯的色谱峰，分别计算回收率正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯回收率结果分别如表26、27、28、29、30、31、32。

表26正己烷回收率试验数据表

表27苯回收率试验数据表

表28甲苯回收率试验数据表

表29对二甲苯回收率试验数据表

表30邻二甲苯回收率试验数据表

表31苯乙烯回收率试验数据表

表32 1,2-二乙基苯回收率试验数据表

11、三批样品中大孔吸附树脂有机残留物测定

11-1)分别精密称取批号：20140501、20140502、20140503的原料药20(R)-人参皂苷Rg3各1504.11mg、1502.02mg、1500.08mg，分别置于20ml顶空瓶中，精密加入N,N-二甲基甲酰胺溶液6ml，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为20：80，密封瓶口，摇匀，即得供试品溶液和供试品溶液顶空瓶。

11-2)精密吸取“1、溶液配制”步骤中的混合对照品溶液顶空瓶内气体与步骤17-1)中供试品溶液顶空瓶内气体各1ml，注入气相色谱仪，按照“2、测定法”中的色谱系统条件进行气相色谱测定，记录色谱峰，并计算样品中正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1,2-二乙基苯含量。结果如表31。

表31三批样品残留溶剂测定数据表

实施例1原料药20(R)-人参皂苷Rg3的制备

栽培人参粗粉500g，用80℃热水提取三次，每次热水用量为4000ml，每次浸提4小时；合并提取液，过滤；浓缩提取液至2500ml，用等体积正丁醇萃取5次，合并萃取液；浓缩萃取液至干，以1000ml水溶解，过滤；滤液过大孔吸附树脂柱，依次以水、30％乙醇、50％乙醇洗脱，收集50％乙醇流分；浓缩，用500ml 80％乙醇重结晶三次，将所得沉淀干燥，粉碎，得20(R)-人参皂苷Rg3约2.2g。原料药20(R)-人参皂苷Rg3为白色固体粉末；味微苦。

实施例2原料药20(R)-人参皂苷Rg3质量标准检测

1、20(R)-人参皂苷Rg3含量测定

1-1)取20(R)-人参皂苷Rg3对照品适量，研细后，精密称定20(R)-人参皂苷Rg3对照品(10mg)，加入甲醇-水混合溶液，超声溶解，配制成每1ml含0.1mg人参皂苷Rg3的人参皂苷Rg3对照品溶液；

1-2)取实施例1制备的20(R)-人参皂苷Rg3原料药适量，研细后精密称取人参皂苷Rg3样品(22.1mg)，置于100mL的容量瓶中，加入甲醇-水混合溶液适量，摇匀，溶解后置于超声仪进行超声处理60min，接着冷却至室温(15-35℃)后加入甲醇-水混合溶至容量瓶刻度线，摇匀，制成每1ml含0.1mg原料药20(R)-人参皂苷Rg3的原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液；

1-3)分别吸取对照品溶液8μl、10μl及供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录20(R)-人参皂苷Rg3面积(A)，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，以甲醇-水(90：10)为流动相，流速为1.0mL/min，柱温30℃；采用蒸发光散射检测器检测，漂移管温度:90℃；气体流速:2.2L/min；理论板数按20(R)-人参皂苷Rg3峰计算应在2000-6000之间(优选不低于3000)；

本发明实施例中甲醇-水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10，以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算，原料药20(R)-人参皂苷Rg3中20(R)-人参皂苷Rg3含量为92.3％。

2、20(R)-人参皂苷Rg3鉴定

2-1)称取经过研磨处理的实施例1制备的原料药20(R)-人参皂苷Rg3样品(10mg)，置于10mL的容量瓶中，加入甲醇-水混合溶液(90:10，即甲醇-水混合溶液中甲醇与水的体积之比为90:10)适量，摇匀，超声处理60min，溶解；冷却至室温(15-35℃)后加入甲醇-水混合溶液至刻度线，摇匀，得到原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液；

2-2)取研细的20(R)-人参皂苷Rg3对照品(10mg)，加入甲醇-水混合溶液，配制成每1ml含1mg20(R)-人参皂苷Rg3的甲醇-水混合溶液对照品溶液；

2-3)吸取上述供试品溶液、对照品溶液、甲醇-水混合溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为65：35：10的三氯甲烷-甲醇-水下层溶液为展开剂，置于层析展开缸中进行薄层色谱处理，然后取出硅胶G薄层板，晾干，喷以显色剂(10％硫酸乙醇溶液)，在105℃加热至斑点显色清晰。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显示相同颜色斑点，Rf值为0.59，与其它成分的斑点得到很好分离；阴性样品(即甲醇-水混合溶液)在相应位置无斑点。

3、相关物质检测

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱Hypersil ODS-C18，5μm，250×4.6mm；以甲醇：水(80:20)为流动相，流速：0.8ml/min；柱温为30℃；蒸发光散射检测器，漂移管温度：90℃，气体流速：2.2L/min；进样量：5μl。

3-1)取研细的实施例1制备的20(R)-人参皂苷Rg3原料药(55.2mg)于50mL的容量瓶中，加入三氯甲烷-甲醇-水的混合溶液适量，摇匀，超声处理60min，冷却至室温(15-35℃)后加入三氯甲烷-甲醇-水的混合溶液至容量瓶刻度线，摇匀，制成每1ml约含1mg原料药20(R)-人参皂苷Rg3的原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液；

3-2)精密量取供试品溶液5ml于100ml容量瓶中，用三氯甲烷-甲醇-水的混合溶液定量至刻度，制成每1ml中约含人参皂苷Rg3 50μg的溶液，作为20(R)-原料药20(R)-人参皂苷Rg3自身对照溶液；

3-3)精密量取20(R)-人参皂苷Rg3供试品自身对照溶液5μl注入液相色谱仪，进行液相色谱检测灵敏度调节，使主成分20(R)-人参皂苷Rg3的色谱峰的峰高为满量程的10％-15％；

3-4)再精密量取原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液、20(R)-人参皂苷Rg3供试品自身对照溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，则各杂质峰的峰面积之和与20(R)-人参皂苷Rg3供试品自身对照溶液的主峰的峰面积之比≤4。

4、干燥失重

按照2015年版《中国药典四部》通则0831(干燥失重测定法)测定。具体如下：

精密称取实施例1制备的1.0g 20(R)-人参皂苷Rg3原料药，平铺于事先干燥至恒重的称量瓶中，接着置于105℃条件下，在常压状态下进行干燥处理并称重，直至连续2次精密称重至恒重，计算干燥失重，减失的重量不得超过4.0％。干燥失重结果为1.9％，符合原料药20(R)-人参皂苷Rg3干燥失重的质量要求。

5、比旋度测定

按照《中国药典四部》(2015年版)通则0621(旋光度测定法)测定原料药20(R)-人参皂苷Rg3的比旋度，具体方法如下：

精密称取实施例1制备的原料药20(R)-人参皂苷Rg3(200.5641mg)，置10ml容量瓶中，加入吡啶，溶解，制成比旋度检测液，其中，每1ml比旋度检测液中含有20.05641mg的原料药20(R)-人参皂苷Rg3；然后将比旋度检测液置于比旋仪(上海精密科学仪器有限公司)中进行测定，读取比旋度检测液的旋光度(a)，采用相同的方法读取旋光度3次，取3次的平均值，按照公式(Ⅰ)计算原料药20(R)-人参皂苷Rg3的比旋度α，计算结果原料药20(R)-人参皂苷Rg3的比旋度α为-15.5°。

[α]^tD＝100α/lc(Ⅰ)

其中：D为钠光谱的D线；t为测定温度，℃；l为测定管的长度，dm；α为测得的旋光度；C为100ml溶液中含有被测物质的重量，g(按干燥品或无水物计算)。

6、溶剂残留

6-1)精确称取研细的、实施例1制备的、原料药20(R)-人参皂苷Rg3样品(0.06g)，置于20ml顶空瓶中，精密量取二甲基甲酰胺溶液(6.0ml)，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为30:70；加入到顶空瓶中，密封振摇，溶解，得原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液及其顶空瓶；

6-2)精密称定正丁醇对照品(500.06mg)，置于100ml容量瓶内，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，制得正丁醇对照品母液，其中N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为30:70；然后精密量取6ml正丁醇对照品母液置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，即得正丁醇对照品溶液及其顶空瓶。

6-3)分别精密量取原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液顶空瓶、正丁醇对照品溶液顶空瓶内气体各1ml，顶空进样，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30分钟，注入气相相色谱仪，测定，记录色谱图。测定的色谱条件如下：

以聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱，柱长为30m，内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm(广州，菲罗门公司)；柱温为程序升温：初始温度为50℃，维持14分钟，以每分钟35℃升温至230℃，维持2分钟；检测器温度270℃；进样口温度250℃；载气为氮气，流速为每分钟1.0ml。

以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算，即得原料药20(R)-人参皂苷Rg3中正丁醇残留量。理论塔板数以正丁醇峰计算应不低于10000。本品含正丁醇不得过0.5％。正丁醇残留测定结果为未检出，符合原料药20(R)-人参皂苷Rg3中正丁醇残留的质量要求。

7、大孔吸附树脂有机残留物测定

7-1)精密称取研细的实施例1制备的原料药20(R)-人参皂苷Rg3样品(1.5006g)，置于20ml顶空瓶中，精密量取二甲基甲酰胺溶液(6.0ml)，加入到顶空瓶中，密封振摇，溶解；即得原料药20(R)-人参皂苷Rg3供试品溶液及其顶空瓶；

7-2)分别精密称定正己烷(5000.02mg)、苯(500.06mg)、甲苯(5000.01mg)、对二甲苯(5000.04mg)、邻二甲苯(5000.05mg)、苯乙烯(5000.10mg)、1,2-二乙基苯对照品(5000.11mg)，置于同一个容量瓶(1000ml)内，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，制得混合对照品母液A；然后精密量取1ml混合对照品母液A于1000ml容量瓶内，接着加入N,N-二甲基甲酰胺溶液至刻度，摇匀，制得混合对照品母液；然后精密量取6ml混合对照品母液置于20ml顶空瓶中，密封瓶口，得混合对照品溶液及其顶空瓶。

7-3)精密量取N,N-二甲基甲酰胺溶液6ml，密封瓶口，即得阴性对照溶液及其顶空瓶，其中，N,N-二甲基甲酰胺溶液中N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为20:80。

7-4)分别精密量取混合对照品溶液顶空瓶、阴性对照溶液顶空瓶和供试品溶液顶空瓶内气体各1ml，顶空进样，顶空瓶平衡温度为90℃，平衡时间为30分钟，分别注入气相色谱仪，记录色谱图，测定的色谱条件如下：

以聚乙二醇为固定相，采用弹性石英毛细管柱(柱长为30m，内径为0.25mm，膜厚度为0.25μm)；柱温为程序升温：初始温度为40℃，维持8分钟，以每分钟15℃升温至200℃，维持3分钟；检测器温度220℃；进样口温度200℃；载气为氮气，流速为每分钟1.0ml。以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算，即得原料药20(R)-人参皂苷Rg3中大孔树脂残留物的残留量。理论塔板数以邻二甲苯峰计算应不低于20000，各待测峰之间的分离度应符合规定，阴性对照溶液色谱图无干扰。

以供试品的进样量与峰面积的对数，按照外标两点法对数方程计算。本品含苯不得过0.0002％，含正己烷、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯和1,2-二乙基苯均不得过0.002％。有机残留物测定结果均为未检出，符合原料药20(R)-人参皂苷Rg3中有机残留物的质量要求。