一种苯妥英钠的快速检测方法与流程

本发明属于保健食品和药品快速检测领域，具体涉及一种苯妥英钠的快速检测方法。

背景技术：

苯妥英钠，白色粉末，无臭，味苦，分子式C₁₅H₁₁O₂N₂Na，是一种用于治疗癫痫的处方药。

癫痫是神经内科最常见的疾病之一，一种需要长期服药来控制发病的慢性病，患者在选择药物时更青睐那些“纯中药”“祖传秘方”治疗癫痫的中药制剂，认为副作用小，不法分子正是利用了患者的这一心理，在一些中药制剂中非法添加苯妥英钠。

2010年2月，中国抗癫痫协会会长李世绰会长向卫生部提交了《关于规范癫痫诊疗领域三大问题的建议》，其中就反映了社会上流行的“治癫痫”中药暗掺西药、危害患者的问题。《建议》中提供了数份来自不同医院近年来的调研结果，揭示出如下问题：

1.抗癫痫中药中暗掺西药的现象的存在已有较长的历史；

2.已有数十种抗癫痫中药被发现添加了西药成分，其中大量为医院制剂，用治疗药物监测（TDM）方法在45例服用“纯中药”的癫痫患儿血清中检测出1-5中常用的抗癫痫西药，其中苯妥英钠最多（42例）；

3.其他医师在考虑加用其他抗癫痫药时可能因不知中药制剂中的西药成分而重复用药，易产生过量和中毒。

抗癫痫的中药中添加苯妥英钠，而未在说明书中标明，导致患者服药不规范，西药抗癫痫药物在体内的浓度和种类无序，严重影响疗效，最终导致癫痫发作难以控制。这类药物由于个体诊所制剂，存在剂量不准，均匀度差，容易造成有的人无效，有的人中毒的情况；有些患者服用后出现过敏反应，出现皮疹、发热、血管炎等；有的病人花费巨额资金却由于剂量不足而癫痫控制不理想，有些患者由于同时服用相同的抗癫痫药物（正规药物）而甚至出现抗癫痫药物过量中毒。

抗癫痫药物中非法添加苯妥英钠严重损害中药的声誉，不利于我国中药文化的传承，严重损害癫痫患者的身体健康，市场急需进行有效的监管，因此，有必要立即开展行动，建立针对性的监督检验方法，为加强该类产品的监管提供有效的工具，从而实现保障患者权益，保护中医药健康良好的发展。

目前，在抗癫痫中成药和保健食品中是否添加苯妥英钠的检测方面主要有以下几种方法：

1、薄层色谱法

样品中的待测成分经过甲醇提取，所得供试品溶液与对照品溶液在硅胶板上经展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯254nm下检视。在展开剂的作用下，由于不同物质的迁移速度不同，不同物质在薄层色谱板上的不同位置以斑点的形式出现，根据待测样品是否在与对照品相应的位置出现斑点这一实验现象来判断待测样品中是否含有目标成分。如果供试品溶液薄层色谱图与苯妥英钠对照品相应位置出现斑点，则提示样品中可能含有苯妥英钠成分。

薄层色谱法的优点是不需要昂贵的分析仪器。该法缺点是：色谱分辨率较低，中成药成分复杂，干扰因素多，容易产生误判。

色谱展开和晾干所需时间较长，不足以满足快速测定的要求。薄层色谱板需要烘干并干燥存放，分离效果受环境因素影响较大，不适合现场检测。需要有固定的场所，不合适作流动性大的现场检测。对检测人员的专业技术要求较高，不适合基层人员现场操作。

2、高效液相色谱法

高效液相色谱法是常用的现代分析方法，在相同的色谱条件下，不同的物质有不同的色谱保留时间。在相同的色谱条件下苯妥英钠对照品溶液与样品提取所得供试品溶液分别进样，根据色谱保留时间可判断待测样品是否含有苯妥英钠成分。

高效液相色谱法的优点是色谱分离效率高、灵敏度高。但目前也存在以下缺点：仪器价格昂贵，样品前处理时间长，色谱柱易受污染，分析成本高；当共存成分的色谱峰保留时间与苯妥英钠色谱保留时间接近时容易造成误判；仪器对环境的要求高，需固定放置，不适合现场检测。

3、高效液相色谱-质谱联用法

以高效液相色谱仪作为分离器，质谱仪作为分析器的高效液相色谱-质谱联用法适合于成分复杂、背景干扰严重的样品分析，这种分析方法可提高检测结果的可靠性。但高效液相色谱-质谱联用法是一种分析成本比高效液相色谱更高，操作更加复杂的分析方法。仪器对环境的要求更高，需要固定放置，不合适现场检测。目前这些检验只能在少数实验室中进行，不易推广使用。

综上所述，目前在中成药和保健食品中是否添加苯妥英钠的检测方面，尚缺一种灵敏度高，操作简单，进行快速筛查苯妥英钠的方法，对于药店和基础药检单位，开发中成药和保健食品中非法添加苯妥英钠的快速筛查方法，在监管现场对样品进行快速分析，为中成药和保健食品监管及时提供证据，打击不法分子的造假行为和保障人民群众的用药安全是非常必要的。

技术实现要素：

针对上述不足，本发明的目的在于提供一种使用方便，快速简便，灵敏度高的检测保健食品或药品中掺杂苯妥英钠的快速筛查方法及其所用检测卡。

本发明所采取的技术方案是：

一种苯妥英钠快速检测卡，包括检测卡底板，所述检测卡底板上依次设有并衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫，所述金标结合垫上设有苯妥英钠抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物，在所述包被膜上依次设有苯妥英钠偶联载体蛋白溶液印制的检测T线及用羊抗兔IgG溶液印制的质控C线。

优选的，所述金标结合垫为玻璃纤维或者聚酯膜，所述苯妥英钠抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物通过喷涂工艺吸附在玻璃纤维或者聚酯膜上。

优选的，所述包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述苯妥英钠偶联载体蛋白溶液及用羊抗兔IgG溶液印制通过喷涂工艺吸附在硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜上。

优选的，所述样品垫为玻璃纤维。

优选的，检测卡底板为PVC板。

优选的，所述的兔IgG-胶体金复合物的用量为0.3～0.5μg/cm²。

优选的，所述的苯妥英钠抗体-胶体金复合物的用量为0.4-0.6μg/cm²。

上述胶体金复合物是按照面积来涂布的，单位为cm²。

优选的，所述羊抗兔IgG的用量为0.03～0.05μg/mm。

优选的，所述的苯妥英钠偶联载体蛋白的用量为：0.05～0.1μg/mm。

优选的，苯妥英钠偶联的载体蛋白选自血蓝蛋白KLH或牛血清白蛋白BSA。

上述抗体或者抗原即苯妥英钠偶联载体蛋白直接喷在硝酸纤维素膜上的，按mm来计算。上述检测卡上各组分的用量都是经过研发总结出来的最佳浓度，在检测实际样品时，如果用量过多会出现假阳性，用量过少会出现假阴性。

优选的，苯妥英钠抗原及免疫原制备方法是：称取1 mg 5-二苯基-苯妥英-3 - ω-正戊酸加入到0.6ml的水中，滴加吡啶数滴至全部溶解，再加入1 mg碳二亚胺，分别缓慢滴加到1mL的10mg/mL的BSA和KLH碳酸盐缓冲液中溶解，室温搅拌2 h，反应完成后用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，8h换一次透析液，分别制得包被抗原（记为PHT-BSA）和免疫抗原（记为PHT-KLH）。

优选的，KLH和BSA均用0.01mol、pH9.6碳酸盐缓冲液溶解。

优选的，苯妥英钠抗体的制备方法是：用PHT-KLH免疫雌性小鼠，每只小鼠的免疫剂量为120ug/0.3mL，采用快速佐剂，背部皮下注射，初次免疫，免疫抗原与等体积费氏完全佐剂1:1 混合，充分混匀，3周后加强免疫；加强免疫时，免疫抗原与等体积费氏不完全佐剂1:1 混合，充分混匀，连续免疫2 次，每次间隔3 周，最后一次免疫后10～15 天端尾采血并分离血清，采用间接ELISA法测定多抗血清效价，结果测定抗体血清效价在1:8000-1:10000之间，收集腹水，先用硫酸铵法对腹水进行粗提，再用蛋白A亲和层析法进行纯化。

优选的，包被膜的制备方法是：用pH7.4，0.01M PBS缓冲液、10%-20%蔗糖将苯妥英钠抗原PHT-BSA稀释到0.5～1.0mg/ml，喷至硝酸纤维膜上，每300mm的喷量为30ul，为T线；羊抗兔稀释到0.3mg/ml～0.5mg/ml，每300mm的喷量为30ul，运转速度为80毫米/秒，泵压力100泵压力，移动长度290cm为C线，C、T线的间距为4.5mm，放45℃烘箱过夜12～18小时。

优选的，金标结合垫的制备方法是：

取半径为15nm～40nm的胶体金颗粒，调pH值到7.0-7.4，在搅拌下按10μg抗原/ml胶体金加入苯妥英钠抗体，最后每1ml加入100ul 10%的BSA使其稳定，在12000rpm/s离心30min，弃上清液，用100ul的0.01M pH8.5的Tris-HCl缓冲液，1‰～5‰ PVP-40，5%BSA，0.1 ‰-0.5‰NaN₃重悬，得到苯妥英钠抗体-胶体金复合物；

把苯妥英钠抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物重悬液用0.01M pH8.0的Tris-HCl缓冲液，1‰～5‰PVP-40，5%BSA，1‰～5‰TWEEN-20，0.1‰-0.5‰NaN₃稀释至8%～12%，取面积为25×30cm的玻璃纤维，每张涂布20ml～30ml，置烘箱，在37℃放置18～24小时；或者把苯妥英钠抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物每100ul用0.01M pH8.0的PBS、5%BSA，1 ‰-0.5‰NaN₃稀释至150～300ul，再加20%蔗糖，溶解混匀，用喷金设备喷至已处理过的聚酯膜或玻璃纤维上；所用的设备压力0.015～0.02MPa，喷金参数为0.05～0.2ul/mm，运转速度为80毫米／秒，喷至已处理过的聚酯膜或玻璃纤维上，聚酯膜或玻璃纤维处理方法为：把聚酯膜或玻璃纤维放在处理液为3‰～5‰ Tris，5%BSA，0.1 ‰～0.5‰NaN₃中浸泡2小时，液体应完全没过聚酯膜或玻璃纤维，置37℃烘箱12～18小时。

优选的，样品垫的制备方法为：取25×30cm玻璃纤维，每张涂布20ml～30ml涂布溶液为0.01M pH7.4的PBS，1%BSA，1%TritonX-100，0.1 ‰-0.5‰NaN₃，置烘箱37度18～24小时。

一种苯妥英钠的快速检测方法，包括下述步骤：

1)对待检测样品进行溶解处理；

2)利用上述所述的苯妥英钠快速检测卡进行检测。

优选的，步骤1）中，待检测样品为固体时，取0.5-2粒或片或丸或胶囊的量，加醇类有机溶剂1-3mL溶解，再加缓释剂稀释至总体积10ml后过滤，振摇不少于30秒，收集滤液；待检测样品为液体时，无需前处理，直接检测即可。

优选的，步骤1）待检测样品为固体时，根据不同剂型样品溶解方法如下：硬胶囊：旋开胶囊壳，取约1粒内容物；软胶囊：用剪刀剪开胶囊壳，挤出1粒内容物；片剂：压碎成粉末，取1片量；丸剂：取每次服用量的1/2，压碎或剪碎。

优选的，步骤1）中的有机溶剂为乙醇。

优选的，步骤1）中乙醇浓度为50%v/v，添加量为2mL溶解待检测样品。

优选的，步骤1）中的缓释剂为0.01M、pH7.4的PBS缓冲液。

本发明的有益效果是：

本发明所制备的苯妥英钠抗原和抗体具有更好的特异性。苯妥英钠偶联的载体蛋白选自血蓝蛋白KLH或牛血清白蛋白BSA。利用上述抗原去免疫小鼠得到的苯妥英钠抗体的效价更高，灵敏度更好。

本发明操作步骤简单，检测速度快，结果容易观察，可实现对大批量样品的快速筛查，大大降低检测成本，减少工作量，在食品药品监管中具有实际意义。

本发明针对待测样品成分复杂问题，对样品预处理方法进行优化，所需样品量少，仅需提取、稀释两步即可完成样品前处理。大大提高了检测通用性和检测效率。具有操作简单、专属性强、灵敏度高、准确度高、技术适用、环保安全等特点，可在现场对非法添加的苯妥英钠化学成分进行快速检测，符合推广应用的相关原则和要求。经过简单培训即可实施该方法，每个样品的检测时间小于15分钟，每次检测成本约为15～20元。该方法漏检率为0，误检率为0，正确率为100%，检出限小于10μg/g。适用于胶囊、片剂、丸剂、液体剂等中成药和保健食品的快速检测。

附图说明

图1是本发明提供的检测试卡结构示意图；

图2是本发明提供的检测卡判定结果为阴性时示意图；

图3是本发明提供的检测卡判定结果为阳性时示意图；

图4是本发明提供的检测卡判定结果为无效时示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1 苯妥英钠抗原、免疫原以及抗体的制备

1)苯妥英钠抗原及免疫原制备方法是：

称取1 mg 5-二苯基-苯妥英-3 - ω-正戊酸加入到0.6ml的水中，滴加吡啶数滴至全部溶解，再加入1 mg碳二亚胺，分别缓慢滴加到1mL的10mg/mL的BSA和KLH中（BSA和KLH均用0.01mol、pH9.6碳酸盐缓冲液溶解），室温搅拌2 h，反应完成后用0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液透析3天，8h换一次透析液，分别制得包被抗原和免疫抗原。

2）苯妥英钠抗体制备方法是：

用苯妥英钠免疫抗原免疫雌性小鼠，每只小鼠的免疫剂量为120ug/0.3mL，采用快速佐剂，背部皮下注射，初次免疫，免疫抗原与等体积费氏完全佐剂1:1 混合，充分混匀，3周后加强免疫；加强免疫时，免疫抗原与等体积费氏不完全佐剂1:1 混合，充分混匀，连续免疫2 次，每次间隔3 周，最后一次免疫后10 ～ 15 天端尾采血并分离血清，采用间接ELISA法测定多抗血清效价，结果测定抗体血清效价在1:8000-1:10000之间，收集腹水，先用硫酸铵法对腹水进行粗提，再用蛋白A亲和层析法进行纯化。

实施例2 苯妥英钠的快速检测卡

苯妥英钠的快速检测卡，包括PVC板和PVC板5上依次衔接的样品垫1、金标结合垫2、包被膜3和吸水垫4组成，见图1，样品垫1压在金标结合垫2的1/2～1/3 左右，金标结合垫2压在包被膜3的0.1～0.2cm，T线距离包被膜3下端7mm～7.5mm，C线距离包被膜3上端7mm～7.3mm，C、T间距为4.5mm，吸水垫压在包被膜1～2mm处。

其中：金标结合垫为吸附苯妥英钠抗体-胶体金复合物和兔-胶体金复合物的玻璃纤维棉，在包被膜上依次用苯妥英钠偶联载体蛋白的溶液印制的直线式隐性检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐性质控线C线，两条线平行排列。

所述的包被膜为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述的兔IgG-胶体金复合物的用量为0.3～0.5μg/cm²，优选0.25～0.45μg/cm²，所述的苯妥英钠抗体-胶体金复合物的用量为0.4～0.6μg/ cm²，优选0.4μg/mm，所述的羊抗兔IgG的浓度为4mg/ml，所述羊抗兔IgG的用量为0.03～0.05μg/mm。

实施例3 苯妥英钠的快速检测卡的制备方法

该检测卡的制备方法是在PVC板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫。包括下列步骤：

其中：

1）包被膜的制备方法是：

用pH7.4，0.01M PBS缓冲液、10%-20%蔗糖将苯妥英钠抗原稀释到0.5～1.0mg/ml，喷至硝酸纤维膜上，每300mm的喷量为30ul，为T线；羊抗兔稀释到0.3mg/ml～0.5mg/ml，每300mm的喷量为30ul，运转速度为80毫米/秒，泵压力100泵压力，移动长度290cm为C线，C、T线的间距为4.5mm，放45℃烘箱过夜12～18小时。

2）金标结合垫的制备方法是：

用高纯水将1%的氯金酸稀释成0.01%，放入磁力搅拌子，置于恒温磁力搅拌加热套上煮沸，剧烈沸腾后每100ml一次性迅速加入0.7ml的0.1mol/L的柠檬酸三钠，继续煮沸，至颜色保持红色不再发生改变停止加热，冷却至室温后补足损失的水，合格的胶体金应该透亮，无杂质和漂浮物，可保存一个月不发生改变。

取半径为15nm～40nm的胶体金颗粒，调pH值到7.0-7.4，在搅拌下按10μg抗原/ml胶体金加入苯妥英钠抗体，最后每1ml加入100ul 10%的BSA使其稳定，在12000rpm/s离心30min，弃上清液，用100ul（初始胶体金体积的十分之一）的0.01M pH8.5的Tris-HCl缓冲液，1‰～5‰ PVP-40，5%BSA，0.1 ‰-0.5‰NaN₃重悬，得到苯妥英钠抗体-胶体金复合物，置4℃可放2个月左右。

把苯妥英钠抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物重悬液用0.01M pH8.0的Tris-HCl缓冲液，1‰～5‰PVP-40，5%BSA，1‰～5‰TWEEN-20，0.1‰-0.5‰NaN₃稀释至8%～12%，取面积为25×30cm的玻璃纤维，每张涂布20ml～30ml，置烘箱，在37℃放置18～24小时；或者把苯妥英钠抗体-胶体金复合物和兔IgG-胶体金复合物每100ul用0.01M pH8.0的PBS、5%BSA，1 ‰-0.5‰NaN₃稀释至150～300ul，再加20%蔗糖，溶解混匀，用喷金设备喷至已处理过的聚酯膜或玻璃纤维上；所用的设备压力0.015～0.02MPa，喷金参数为0.05～0.2ul/mm，运转速度为80毫米／秒，喷至已处理过的聚酯膜或玻璃纤维上，聚酯膜或玻璃纤维处理方法为：把聚酯膜或玻璃纤维放在处理液为3‰～5‰ Tris，5%BSA，0.1 ‰～0.5‰NaN₃中浸泡2小时，液体应完全没过聚酯膜或玻璃纤维，置37℃烘箱12～18小时。

3）制备样品垫

取25×30cm玻璃纤维，每张涂布20ml～30ml涂布溶液为0.01M pH7.4的PBS，1%BSA，1%TritonX-100，0.1 ‰-0.5‰NaN₃，置烘箱37度18～24小时。

实施例4 苯妥英钠的快速检测方法

1）该苯妥英钠的快速检测方法，依次包括下述步骤：

对需检测的产品加醇类有机溶剂溶解，再加PBS缓释剂稀释后过滤，收集滤液。

其中：不同剂型样品溶解方法如下：

硬胶囊：旋开胶囊壳，取约1粒内容物；

软胶囊：用剪刀剪开胶囊壳，挤出约1粒内容物；

片剂：压碎成粉末，取约1片量；

丸剂：取每次服用量的1/2左右，压碎或剪碎。

向上述样品的任意一种中加入有机溶剂，有机溶剂的使用量以浸没待测样品为宜，本发明选用2mL的使用量，基本上可覆盖不同剂型样品的需要。较优的醇类有机溶剂是乙醇，浓度在50%v/v左右即可。可以促进待检测产品的溶解，同时不干扰后续实验。

为保证提取完全，振摇时间需不少于30秒，以适应各种剂型的需要。

通过实验发现，滴加至苯妥英钠胶体金试纸条上的滤液，若有机溶剂的终浓度大于50%，则苯妥英钠胶体金试纸条不能正常使用，因而需加入1mL以上的PBS缓冲液进行稀释。同时，考虑到提取液在过滤过程中需损耗一定的溶液，因此本发明加PBS缓冲液进行稀释至总体积为10mL，既确保试纸的灵敏度，又保证有足够的提取液进行加样。

液体剂型：无需前处理，直接检测。

2）将步骤1）收集的滤液滴加于苯妥英钠胶体金层析检测卡上，开始计时，3～5min后，根据胶体金试纸条的检测T线和控制C线的显色，判断待测样品为阳性或阴性。

3） 步骤2）所述的胶体金检测试纸上的控制C线和检测T线均显色，则判断为阴性（见图2），即待测样品中未添加苯妥英钠化学成分；胶体金检测试纸上的控制线C线显色，检测线T不显色，则判断为阳性（见图3），即待测样品中含有苯妥英钠化学成分；胶体金检测试纸上的控制线C和检测线T均不显色，或只出现检测线T显色，则说明实验无效（见图4），应用新的胶体金检测试纸重新检测。

本发明方法具有操作简单、专属性强、灵敏度高、准确度高、技术适用、环保安全等特点，可在现场对非法添加的苯妥英钠化学成分进行快速检测，符合推广应用的相关原则和要求。经过简单培训即可实施该方法，每个样品的检测时间小于15分钟，每次检测成本约为15～20元。该方法漏检率为0，误检率为0，正确率为100%，检出限小于10μg/g。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。