癌细胞内过氧化氢检测比色/荧光纸芯片的制备的制作方法

本发明涉及低成本、易于携带且可视化的癌细胞内过氧化氢分析检测技术领域，更具体的说是一种能够用于癌细胞内过氧化氢检测的比色/荧光纸芯片的制备。

背景技术：

过氧化氢，是活性氧簇中稳定性最好的一种，它是重要的胞内信号分子，主要调节DNA损坏，蛋白质合成及细胞凋谢等。低浓度下，过氧化氢作为普遍存在的胞内第二信使可以激活信号桥促使细胞的增殖，分化和迁移，对细胞起到调节保护作用。然而，当过氧化氢的浓度过度表达时，就会引起DNA碱基的修改，如嘌呤和嘧啶的氧化和链的断裂等，从而引起细胞的变异甚至产生癌变。因此细胞内过氧化氢高灵敏、高可信度的检测显得尤为重要。

除了一些传统的方法，最近在纳米酶研究方面产生了一些新的传感方法，纳米酶是具有类酶性质的纳米粒子，而纳米铈是具有很好类酶活性的一类。当纳米铈与过氧化氢混合时，它的颜色由白色变为了橘黄色。因此，基于颜色改变的过氧化氢的直接检测被报道。然而，比色生物传感器只能够对被测物进行直观的、可视化测定，因其灵敏度低，只能进行半定量或定性检测。而荧光检测作为一种发展成熟的检测方法，因其灵敏度高、操作简单、专一等优点被广泛应用在生物检测和临床医学中。过氧化氢会替代吸附在纳米铈表面的DNA，从而产生荧光信号的“关-开”。两种方法的结合不仅达到了高灵敏、直观的检测，还使得检测结果的可信度得到大大的提高。

而微流控纸芯片，因其低消费，易携带，可控等特点，被广泛应用在各种生物传感器中。而中空通道纸芯片因其避免了样品在通道中样品挥发严重、流通缓慢等问题，引起了广大研究者越来越多的关注。中空通道使荧光和比色的方法有效结合在一起，不仅解决了灵敏度和直观性检测的问题，而且有望在资源匮乏或偏远地区得到广泛的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种长有二氧化铈的中空通道微流控纸芯片，通过比色/荧光检测的方法，从而实现癌细胞内低含量过氧化氢的快速、灵敏且可视化检测。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种新型的中空通道比色/荧光纸芯片的制备，其特征是包括以下步骤：

（1）在计算机上设计如附图1所示的荧光/比色纸芯片的疏水蜡打印区域和亲水工作区域；

（2）通过蜡打印机将步骤（1）中设计的纸芯片打印上疏水图案，随后将得到的纸芯片于120-150 ºC下加热1-2 min，使蜡融化，形成疏水层；

（3）利用激光切割机，对步骤（2）中得到的纸芯片进行切割，将灰色区域切掉，制备孔洞；

（4）在步骤（3）中所得纸芯片的亲水区域1上生长二氧化铈；

（5）将生物相容性好的荧光物质修饰的DNA、适配体链及癌细胞固定到步骤（4）所得的纸芯片上，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点；

（6）在步骤（5）所得的纸芯片亲水区域2上埋伏储备液；

（7）将步骤（6）所得的纸芯片按箭头方向折叠，进行可视化比色检测；随后放入荧光设备中，在一定的激发波长和发射波长下进行精确荧光测定。

本发明所设计的中空通道纸芯片的具体尺寸如附图2所示，右侧纸芯片的亲水区域1和加样区直径为6 mm，亲水区域2的直径为4 mm，左侧纸芯片灰色区域为与右侧纸芯片的亲水区域完全对应的孔洞，连接两个孔洞的是长为4 mm，宽为2 mm的亲水通道。

本发明所述在步骤（3）中所得纸芯片的亲水区域1上生长二氧化铈，具体步骤如下：

将相同体积的20.0 mM的氯铂酸和10.0 mM 的硼氢化钠溶液混合后，迅速吸取20.0 μL滴加到纸芯片的工作区域，室温下生长10 min，用二次水彻底冲洗，在室温下干燥；接下来将0.374 g 硝酸铈、0.09 g 六亚甲基四胺及0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮溶解在16 mL蒸馏水中，混匀，将混合物转移到50 mL高压釜中，之后，将生长有Pt纳米粒子层的纸芯片浸入高压釜中，并在180 ºC下保持100 min，然后冷却到室温，将纸芯片取出后，用乙醇和二次水彻底清洗，最后60 ºC真空干燥。

本发明所述的生物相容性好的荧光物质为：量子点：石墨烯量子点，掺杂的石墨烯量子点，碳点，氮掺杂、氮硫掺杂碳点；金属团簇：金簇，银簇，铜簇，金银簇。

本发明所述的在纸芯片亲水区域2上埋伏的储备液为10 µL癌细胞的相应刺激物血管内皮细胞生长因子佛波酯。

本发明所述的样品的测定步骤，将步骤（6）所得的纸芯片按箭头方向折叠，进行样品的测定，绘制灰度与癌细胞浓度的标准曲线，实现可视化比色测定；随后放入荧光设备中，在一定的激发波长和发射波长下进行样品的测定，绘制荧光强度与癌细胞浓度的标准曲线，实现精确荧光测定。

本发明的有益效果：

（1）纸上生长二氧化铈，实现了比色/荧光双模式的联用，从而实现了癌细胞中低含量过氧化氢的灵敏、快速及可视化检测。

（2）通过精巧地设计中空通道纸芯片，避免了刺激物与癌细胞的长期接触。

附图说明

图1：纸芯片的疏水蜡打印图案；

图2：纸芯片的尺寸及折叠方式。

具体实施方式

实施例1

MCF-7细胞内过氧化氢检测比色/荧光纸芯片的制备：

（1）在计算机上设计如附图1所示的比色/荧光纸芯片的疏水蜡打印区域和亲水工作区域，右侧纸芯片的亲水区域1和加样区直径为6 mm，亲水区域2的直径为4 mm，左侧纸芯片灰色区域为与右侧纸芯片的亲水区域完全对应的孔洞，连接两个孔洞的是长为4 mm，宽为2 mm的亲水通道；

（2）通过蜡打印机将步骤（1）中设计的纸芯片打印上疏水图案，随后将得到的纸芯片于120-150 ºC下加热1-2 min，使蜡融化，形成疏水层；

（3）利用激光切割机，对步骤（2）中得到的纸芯片进行切割，将灰色区域切掉，制备孔洞；

（4）在步骤（3）中所得纸芯片的亲水区域1上生长二氧化铈，亦即将相同体积的20.0 mM的氯铂酸和10.0 mM 的硼氢化钠溶液混合后，迅速吸取20.0 μL滴加到纸芯片的工作区域，室温下生长10 min，用二次水彻底冲洗，在室温下干燥；接下来将0.374 g 硝酸铈、0.09 g 六亚甲基四胺及0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮溶解在16 mL蒸馏水中，混匀，将混合物转移到50 mL高压釜中，之后，将生长有Pt纳米粒子层的纸芯片浸入高压釜中，并在180 ºC下保持100 min，然后冷却到室温，将纸芯片取出后，用乙醇和二次水彻底清洗，最后60 ºC真空干燥；

（5）将生物相容性好的石墨烯量子点修饰的DNA、适配体链及MCF-7细胞固定到步骤（4）所得的纸芯片上，随后用牛血清白蛋白封锁活性位点；

（6）在步骤（5）所得的纸芯片亲水区域2上埋伏10 µL癌细胞的相应刺激物血管内皮细胞生长因子佛波酯；

（7）将步骤（6）所得的纸芯片按箭头方向折叠，进行样品的测定，绘制灰度与癌细胞浓度的标准曲线，实现可视化比色测定；随后放入荧光设备中，在一定的激发波长和发射波长下进行样品的测定，绘制荧光强度与癌细胞浓度的标准曲线，实现精确荧光测定。

实施例2

制备步骤同例1，不同之处是：所用癌细胞为A549细胞，所用荧光物质为碳点。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> 癌细胞内过氧化氢检测比色/荧光纸芯片的制备

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